實驗方法

壹、增量表現 AtFd3 轉殖植株鑑定

農桿菌 Agrobacterium tumefaciens GV3101 pBI121-Fd3 培養於含 25 ppm 建 大黴素 (Gentamicin) (Sigma, USA) 與 50 ppm 卡那黴素 (Kanamycin) (Sigma, USA) 的 Luria Bertani (LB) (配方在附錄二) 培養基中生長，將阿拉伯芥花朵浸 泡在農桿菌菌液中，經由自花授粉後收取後代，T0 子代在含 50 ppm Kanamycin 的 MS 培養基中篩選出 2-4、7-6 與 8-3 品系。抗生素篩選後，將 T2 到 T5 子 代轉殖植株，利用植物基因組 DNA 迷你試劑組 (plant genomic DNA mini kit) (Geneaid, Taiwan) 抽取植株葉片組織基因組 DNA，之後利用專一性引子 35S 啟動子 (promoter) 與 NOS 終止子 (terminator) (附錄一)，經由聚合酶連鎖反 應 (polymerase chain reaction, PCR) 鑑定外源性 AtFd3 基因序列大小為 773 base pair (bp)。

取1 μl 基因組 DNA、1 μl 10 mM 35S 與 NOS 引子 (Blossom, Taiwan)、3 μl 10X PCR 緩衝液 (Protech, Taiwan)、1 μl 2.5 mM dNTP (Protech, Taiwan)、0.1 μl 5 units/μl Pro Taq DNA polymerase (Protech, Taiwan) 與無菌水體積填補至 30 μl 後，

做 PCR 反應。取 5 μl PCR 產物與 1 μl 6X Loading dye (Protech, Taiwan) 混合 後加入，由 0.5 X Tris-Acetate-EDTA 緩衝液 (TAE buffer) (Protech, Taiwan) 配置 成 1 % agarose-LE 1200 (Taiwain Agar Agar, Taiwan)，進行電泳在 0.5 X TAE buffer 環境下分離 DNA 片段，電泳率設定為 16.67 V cm^-1，再由溴化乙錠 (Ethidium Bromide, EtBr) (Zymeset, Taiwan) 染色 5 分鐘，最後由電泳膠數位影 像系統拍攝，由此可知轉殖植株是否帶有外源性 AtFd3 基因的 DNA 序列。

PCR 反應之控制組，大腸桿菌 Escherichia coli DH5α 含 pBI121-Fd3 培養 於含 50 ppm Kanamycin 的 LB 培養基，在全黑暗 28 °C，震盪轉速 150 rpm 的

16 培養箱中生長，利用質體迷你試劑 plasmid mini kit (Sigma, US) 抽取 plasmid DNA，之後以上述作為 DNA 模板進行 PCR 反應。電泳之控制組為 100 bp DNA Ladder (Basic Life, Taiwan)。

貳、即時聚合酶鏈鎖反應 (Quantitative real time polymerase chain

reaction, Q-RT-PCR)

收取阿拉伯芥組織，利用總量 RNA 迷你試劑 (Tissue Total RNA Mini Kit) (Favorgen, Taiwain) 抽取植物組織總量 RNA，經由 MMLV Reverse Transcription kit (Protech, Taiwan) 將 1 μg RNA 反轉錄成 cDNA，再加入 1 μl 10 mM Q-正反引 子 (Blossom, Taiwain) (附錄一)、2 μl 10X PCR 緩衝液、1 μl 2.5 mM dNTP、0.1 μl 5 units/μl Pro Taq DNA polymerase、10μl 2X super SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, US) 與無菌水體積填補至 20 μl，以 Quantitative real-time PCR StepOne 儀器 (附錄三) 進行 Q-RT-PCR，將 AtEFlα 基因的 RNA 放大到 最高螢光數量的循環數作為分母，與待測基因的 RNA 放大到最高螢光數量的循 環數作為分子，由兩者所獲得循環數比值作為相對值的數據。

叁、植株生長發育判斷標準

生物面積計算方式以 0.25 cm² 方格數量換算出生長面積 (Grbic and Bleecker., 1995)。葉冠長計算方式為每棵植株水平方向最長距離與垂直方向最長距離相加 總和。繁殖組織計算方式，主莖與側莖長度大於 0.5 cm，花有白色花瓣，花苞 與果莢長度大於 0.1 cm，側葉長大於 0.2 cm (Boyes et al., 2001)。

肆、活性氧化物誘導劑處理

17 活性氧化物 (ROS) 誘導劑分別取 0.1 mM Methyl viologen (MV) (Sigma, US) 與 50 mM H2O2 (Shimakyu, Japan)，浸泡培養於 1/2 MS 培養植株上 5 分鐘；

10 μM 3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea (DCMU) (Sigma, US)，則是浸泡 30 分鐘。

伍、細胞膜離子滲漏檢驗

將整株植物組織浸泡於 1 ml 超純水中，700 mmHg 真空抽氣 5 分鐘，放 氣 2-3 分鐘，重覆 3 次，靜置 5-10 小時，測離子滲漏量，之後沸水煮 10 分 鐘，冷卻 20 分鐘，再測離子滲漏量，計算離子滲漏率公式為 (原離子滲漏量/

煮沸後離子滲漏量) × 100 %。

陸、Harpin 處理

大腸桿菌 Escherichia coli DH5α pSY10-Hrp Z 來自 Collmer 博士實驗室 (He et al.,1993)，將細菌培養於含 50 ppm 氨苄青黴素 (Ampicillin, Amp) (Sigma, US) 的 LB 培養基，在 28 °C 全黑暗與震盪 150 rpm 的培養箱中生長，當細菌生 長至 OD 值約 0.4 到 0.6 時，添加 Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) (Zymeset, Taiwan) 至最終濃度為 0.5 mM，以誘導 HrpZ 蛋白產生，細菌持續生長至 OD 值約 0.8 到 1.0 時，取菌液於室溫下以 3,000 rpm 離心 15 分鐘，在含 200 mM NaCl pH 7.0 10 mM sodium phosphate (PI) 緩衝液重新懸浮，以 4,000 rpm 離心 5 分鐘，重覆 3 次，之後於 -80 °C 冷凍過夜，使得細胞被打破，震盪回溶後，於 4 °C 9,000 rpm 離心 10 分鐘後，取上清液沸水煮 10 分鐘，使蛋白變性，之後 在 4 °C 9,000 rpm 離心 10 分鐘，取上清液以 protein assay dye reagent 試劑組 (Bio-Rad, US) 定量蛋白質，-80 °C 保存，經由小牛血清蛋白 (Bovine serum albumin) (Sigma, US) 做出的標準曲線換算蛋白質濃度。Harpin 添加試驗時，以 PI 緩衝液製備 0.05 μg/μl Harpin 後，在 1/2 MS 培養基上生長的 21 天大植株，

18 以每盤 2 ml 的 harpin 作處理。Harpin 注射試驗時，取 20 μl 0.1 μg/μl Harpin 以 無針頭之針筒注射，至以介質培養的 40 天大的植株葉片中。

柒、北方墨點法

收取以水淹處理 Harpin 後 4 天的阿拉伯芥植株，利用 Tissue Total RNA Mini Kit 抽取植株地上部組織總量 RNA。取 10 μg RNA 與等體積 RNA loading dye (Ambion, US) 混和 50 °C 水浴 30 分鐘，之後加入含 1X Running buffer (MOPS/Sodium Acetate/EDTA buffer) (Ambion, US) 製成 1 % RNA-free Agarose gel (Ambion, US) 的孔洞中，以 700 ml 1X Running buffer 進行電泳分離 RNA，

電泳率設定為 5 V cm^-1。由電泳膠數位影像系統拍攝，當作 RNA 總量，接著由 往上依序堆疊衛生紙、3 張濾紙 (toyo roshi kaisha, Japan)、hybridization transfer membrance (PVDF) (Blossom, Taiwan)、Gel、3 張濾紙、鹽橋用 3 張濾紙、水平 蓋子重量約 150 到 200 g，每樣皆浸泡過 Transfer buffer (Ambion, US)，經由虹 吸管原理轉置 1.5 到 2 小時，取出 hybridization transfer membrance 正反面均以 0.12 J mol sec^-1 UV 處理 1 分鐘，讓 mRNA 黏合在膜上，再將膜放入雜交管 中 (hybridization tube, Thermo Hybaid, US) 中，添加 20 ml prehybridization solution，68 °C，30 rpm，1 小時，去掉溶液，添加 5 ml hybridization solution (此 藥劑會重複使用，使用時加熱至 95 °C)，68 °C，30 rpm，過夜，去掉溶液，加 5 ml 2 X wash solution，25 °C，30 rpm，15 分鐘，去掉溶液，重覆 1 次，加 5 ml 0.5 X wash solution，68 °C，30 rpm，15 分鐘，去掉溶液，重覆 1 次，加 100 ml Wash buffer 室溫，30 rpm，2 分鐘，去掉溶液，加 30 ml 1 % Blocking solution，

室溫，30 rpm，2 小時，去掉溶液，加 5 ml Antibody solution，室溫，30 rpm，

30 分鐘，去掉溶液，加 100 ml wash buffer，室溫，30 rpm，15 分鐘，去掉溶液，

共 2 次，加 20 ml Detection Buffer，室溫，30 rpm，3 分鐘，去掉溶液，加 1 ml CDP-Star chemiluminescence Reagent (Perin Elmer, US) 呈色，壓片 3 到 5 分鐘，

19 浸泡顯影劑 1 分鐘，浸泡於水中 1 分鐘，浸泡定影劑 1 分鐘，電腦掃描圖片。

(Buffer 配方在附錄二)

欲置備 DNA Probe 時，抽取 WT 阿拉伯芥基因組 DNA，經由 PCR 放大 PR1 序列數量，取 1 μl PCR 產物、3 μl PCR DIG labling Mix^Plus dUTP (Roche, Switzerland)、1 μl 10 mM PR1 引子 (Blossom, Taiwain)、3 μl 10X PCR 緩衝液、

0.1 μl 5 units/μl Pro Taq DNA polymerase 與無菌水體積填補至 30 μl，作 PCR，

經由電泳確認產物有無產出 (引子序列在附錄一)。

捌、青枯病菌與炭疽病菌接種

隔夜培養的青枯病菌，以 6,000 xg 離心 10 分鐘去培養基後，以無菌水重 新懸浮，再次以無菌水將菌液調整至 10⁵ CFU/ml (含 0.025 % silwet L-77

surfactant, Helena Chemical, US)。水淹接種法是將培養於 1/2 MS 培養基生長 21 天大的植株，以菌液浸泡 30 分鐘；剪根接種法則是將介質培養的植株取出，剪 去一半根部之後，將根部浸泡於調整好濃度的菌液中 10 分鐘後，再重新種回土 壤中。

培養於斜面 1/5 PDA 培養基上的炭疽病菌以無菌水 (含 0.05 % Tween 20) 將孢子沖洗下來，將分生孢子調整濃度至 10⁴ spores/ml (含 0.025 % silwet L-77 surfactant)，之後將分生孢子接種在 1/2 MS 培養基生長 21 天大的植株，浸泡 30 分鐘；噴灑接種於介質培養 40 天大的植株，以每株 50 ml 體積噴灑。

玖、青枯病菌與炭疽病菌病徵判定標準

青枯病菌病徵判定標準，依萎縮病葉數量分為 6 級，0 級為未發病，1 級為 發病 1 至 2 片，2 級為發病 2 至 3 片，以下已此類推至 5 級，發病率 (%) 換算 公式為 (N0*n+N1*n+N2*n+N3*n+N4*n+N5*n) /(Nt*nt) *100，N 為級數，n 為 樣本數，Nt 為總級數，nt 為樣本總數。

20 炭疽病病徵判定標準，依黃黑點病徵數量葉片數分為 10 級，0 級為未發病，

1 級為發病 1 片，2 級為發病 2 片，以下已此類推至 9 級，發病率 (%) 換算公式 為 (N0*n+N1*n+N2*n+N3*n+N4*n+N5*n+N6*n+N7*n+N8*n+N9*n)/(Nt*nt)*100 ， N 為級數，n 為樣本數，Nt 為總級數，nt 為樣本總數。

拾、統計分析

經由 SPSS 12.0 統計軟體，單因子變異數分析 (One way analysis of variance, ANOVA)，假設相同變異數 Duncan 氏，顯著水準 p<0.05。比較平均數經由 Microsoft Excel 2007 計算所得。

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