硫鐵蛋白

合型的 [7Fe-8S] 與 [8Fe-8S]。在哺乳類動物的 aconitase/iron regulatory protein 1 蛋白質中找到從 [4Fe-4S] 到 [3Fe-4S] 基團。在細胞外實驗中從三價鐵離子 與谷氨酸合成酶 (glutamate synthase)，而在許多動物組織上，功能是將電子傳遞 到細胞色素 (cytochrome) P450。在古細菌 Streptomyces griseolus 與硫酸鹽還原 細菌 Desulfovibrio gigas 的 Fd 分別找到 [3Fe-4S] 與 [4Fe-4S] 基團。細菌的 Fd 可能也包含兩個 [4Fe-4S] 或 [3Fe-4S] 基團或 [4Fe-4S] [3Fe-4S] 組成的基 團，並且主要當作低電位的電子傳遞蛋白。在 Fd 中含有高電位的立方體 [4Fe-4S] 基團。而大部分的 Fd 在低電位 (-250 到 -650 mV) 能夠交換電子，

HiPIP (high potential iron-sulfur proteins) 蛋白能夠從 +50 到 +450 mV 電位交 換電子。HiPIP 蛋白來自紫色光合作用細菌 (purple photosynthetic bacteria)，功 能與光合作用電子傳遞的 cytochrome bc1 複合體與反應中心之間相似。其他群

2 集攜帶 [Fe-S] 基團組成的細胞膜連結蛋白質，在粒線體呼吸鏈中影響電子傳遞，

也會在葉綠體與細菌中傳遞電子。從葉綠體 b6f、cytochrome bc1 複合體與一些 含有 Rieske 蛋白的二氧酶 (dioxygenases) 分離出 [2Fe-2S] 基團。藍細菌 (cyanobacteria) 與植物在細胞膜嵌合的光系統 I (photosystem I, PSI) 蛋白，主要 是 [4Fe-4S] 基團 (Brzóska et al., 2006)。許多生物上擁有 Fd，而在植物上的硫 鐵蛋白主要是 [2Fe-2S] 基團，而 [2Fe-2S] 基團由氧化還原活性中心

[CX4CX2CXnC (n=29 or ≠29)]，周圍接上 4 個高保守性的半胱酸 (Cysteine, Cys) 基團所構成，能夠讓植物進行氧化還原反應 (Bläse et al., 1996; Kameda et al., 2011)。

一、硫鐵蛋白影響的酵素

植物的 Fd 具有 [2Fe-2S] 基團，可以傳遞電子給下游的氧化還原酵素，因 此能夠影響下游的酵素有光合作用線性電子傳遞鏈關鍵酵素

Fd-NADP-oxidoreductase (FNR)、光合作用環狀電子傳遞關鍵酵素

Fd-plastoquinone oxidoreductase (FQR)、葉綠體代謝關鍵酵素 Fd-dependent thioredoxin reductase (FTR)、氧化還原調控與訊號傳遞關鍵酵素

NADP-thioredoxin reductase C (NTRC)、硝酸鹽代謝的關鍵酵素 ferredoxin-nitrite reductase (NiR)、谷氨酸鹽代謝關鍵酵素 ferredoxin-dependent glutamate synthase (Fd-GOGAT)、白色素代謝關鍵酵素 ferredoxin-dependent bilin reductases、硫酸鹽 代謝關鍵酵素 ferredoxin-dependent sulfite reductase (SiR)、卡爾文循環 (calvin cycle) 相關酵素 phosphoribulokinase 與 fructose-1,6-bisphosphatase、澱粉合成相 關酵素 ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase)，然而透過這些酵素可影響下游 的代謝路徑包括糖的生合成 (sugar biosynthesis)、氮的代謝 (nitrogen metabolism)、

蛋白質的結構 (Protein structure)、葉綠素的合成 (chlorophyll biosynthesis)、澱粉 的生合成 (starch biosynthesis)、生長素的合成 (auxin synthesis)、晝夜節律 (circadian rhythmicity) 與過氧化物的二次訊號調控 (second messenger signal) (Balmer et al., 2006 ; Michalska et al., 2009 ; Cejudo et al., 2012 ; Hanke et al., 2013)，

3 由此可知 Fd 能夠透過下游的氧化還原酵素影響植物的生長代謝路徑與抗病路 徑。

貳、阿拉伯芥硫鐵蛋白之分類

阿拉伯芥上擁有 8 種不同的硫鐵蛋白序列，分別有 AtFd1、AtFd2、AtFd3、

AtFd4、AtFd1 mi、AtFd2 mi、FdC1 與 FdC2，依照功能與分佈位置可分為五大 類 (Hanke et al., 2004; Voss et al. 2011；Grinberg et al., 2000)。

第一類為光合作用型硫鐵蛋白 (photosynthetic-type Fd, PT-Fd) 或稱葉部型 硫鐵蛋白 (Leaf-type Fd)，存在於綠色組織中，包含 AtFd1 與 AtFd2。植株進行 光合作用時，葉綠體的光系統 II 蛋白 (photosystem II, PSII) 產生電子，將電子 依序傳遞給質體醌 (plastoquinone, PQ)、細胞色素 b6f 複合蛋白 (cytochrome b6f complex, Cyt b6f )、色素體藍素 (plastocyanin, PC) 與光系統 I 蛋白 (photosystem I, PSI)，最後將電子傳遞給 Fd，Fd 將電子傳遞給下游的 Fd–NADP⁺ 氧化還原 酵素 (Fd–NADP⁺ oxidoreductase, FNR)，使得 NADP+ 還原成 NADPH、葉綠素 生合成、光敏素生合成、脂肪合成、氧化還原代謝與氮與硫的同化作用

(assimilation)，而此過程稱為線型電子傳遞鏈 (linear electron flow, LEF)。除了 LEF 以外， Fd 也能透過環狀電子傳遞 (Cyclic electron transfer, CET) 傳遞電子，

CEF 是從光合作用中的 PSI 將電子傳遞給 Fd 後，再回頭傳遞給 Cyt b6f、PQ 與 NADPH 去氫酶複合蛋白 (NADPH dehydrogenase, NDH) 幫植物再一次的獲 得能量的過程，其中 AtFd1 可能在環狀電子傳遞扮演重要的角色， (Hanke et al., 2013)。AtFd1 與 AtFd2 氧化還原電位分別為 -425 mV 與 -433 mV，與玉米的 Leaf-type Fd 氧化還原電位相近，由於阿拉伯芥光合作用型硫鐵蛋白氧化還原電 位低於 NADPH 與玉米的 FNR，因此能夠決定了光合作用中電子的流動方向 (Hanke et al., 2004)。

第二類為非光合作用型硫鐵蛋白 (non-photosynthetic type ferredoxin, nPT-Fd) 或稱根部型硫鐵蛋白 (root-type Fd)，存在於儲存性組織 (Hanke et al., 2004)。在 非光合作用的色素體 (plastids) 上，將葡萄糖 (glucose-6-phosphate, G6P) 經由氧 化五碳醣磷酸化途徑 (oxidative pentose phosphate pathway, OPP) 產生 NADPH

4 經由氧化作用後 FNR 能夠將電子傳遞給 Fd 去進行植物的代謝反應 (Cejudo et al.,2012)。AtFd3 氧化還原電位為 -337 mV，與玉米的 root-type Fd、FNR 與 NADPH 氧化還原電位相近，因此有利於從 NADPH 催化產生的電子傳遞到 Fd，

並且對亞硫酸同化作用的還原酵素 (sulfite reductase, SiR) 有較高的親和力 (Hanke et al., 2004)。

第三類為 AtFd4 其序列與 AtFd3 相似，其氧化還原電位為 -152 mV，有 高度氧化還原潛在的功能 (Hanke et al., 2004)。第四類為粒線體型 Fd

(Adrenodoxin)，存在於粒線體中，包含 AtFd2 mi 與 AtFd1 mi，氧化還原電位 為 -250 mV，在阿拉伯芥中它們的功能還未被探討 (Grinberg et., 2000)。第五類 為具有有效延長 C 端的 Fd，包含 FdC1 與 FdC2，FdC1 能夠從 PSI 蛋白上 獲得電子，當缺乏 FdC2 並且 FdC1 上調表現時，氧化還原電位大約為 -200 mV，

能夠在 PSI 作光還原反應，但不能夠將電子傳遞給 NADPH (Voss et al. 2011)。

叁、非光合作用型硫鐵蛋白之表現位置與表現時間

利用西方墨點法檢測阿拉伯芥的 Fd 在蓮座葉上的表現量比例分別為 AtFd1 7 %、AtFd2 90%、AtFd3 3% 與 AtFd4 0.05 % (Hanke et al., 2004)；而利用 半定量聚合酶連鎖反應 (semi-quantitative PCR) 檢測阿拉伯芥的 Fd 基因表現 則發現 AtFd1、AtFd2、AtFd3 在蓮座葉、側葉、莖、果莢組織皆會表現，而在 花朵上則不表現，其中只有 AtFd3 會在根部作表現 (Hanke et al., 2005)。而利用 即時定量聚合酶連鎖反應 (quantitative real time PCR) 檢測 PT-Fd 與 nPT-Fd 表現量發現，在蓮座葉、子葉與莖部 nPT-Fd 表現量會比 PT-Fd 少，而在根部 與種子上 nPT-Fd 則比 PT-Fd 來得多 (Venegas-Calero et al., 2009)。在柑橘上 nPT-Fd 表現在花瓣、幼果、根和果肉 (Alonso et al., 1995)；玉米(Zea mays) 的 nPT-Fd 表現在幼苗的根、胚軸與根部 (Hase et al., 1991)；而向日葵的 nPT-Fd 表現在葉、子葉、莖、根與種子 (Venegas-Calero et al., 2009)，而根部組織有表 現 nPT-Fd 的植物有番茄 (Lycopersicon esculentum) (Green et al., 1991)、蘿蔔 (Raphanus sativus) (Wada et al., 1986)、水稻 (Oryza sativa) (Doyama et al., 1998)、

5 菠菜(Spinacia oleracea) (Morigasaki et al.,1990) 和白化豆芽 (Hirasawa et al., 1988)。

nPT-Fd 會存在於細胞的澱粉體 (amyloplastid) (Balmer et al., 2006)、葉綠體 (chloroplastid) (Takahashi et al., 1986) 與色素體 (plastid) 之中 (Yan et al., 2006)。

當植物進行光合作用時，在葉綠體的 Fd 能將光能傳遞至 thioredoxin (Trx) 進行 固碳反應生成蔗糖，再經由韌皮部傳遞蔗糖至植物的各個組織中，而在組織的細 胞中澱粉體經由 Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PD) 將蔗糖轉換成 NADPH，經由在澱粉體硫鐵蛋白的 Fd3 將能量傳遞給 Trx，Trx 再把能量用至 碳水化合物的代謝、氮的代謝與蛋白質構成 (Balmer et al., 2006)。此外，Fd3 會 表現在根部的色素體與葉綠體，而 Fd1 只會表現在葉綠體。在運送胜肽的 Fd1 靠近成熟區域的 Fd3 時，只會在葉綠體表現。在運送胜肽的 Fd3 靠近成熟區 域的 Fd1 時，會在葉綠體與根部的色素體表現。有此可知只有 Fd3 能夠在葉 綠體與色素體間作表現 (Yan et al., 2006)。另外在柑橘上發現乙烯會誘導 nPT-Fd 基因表現 (Alonso et al., 1995)，而在香蕉感染真菌鐮孢菌屬 (Fusarium spp.) 時，

則會誘導與玉米相似序列的 nPT-Fd 基因表現 (Berg et al., 2007)。由這些文獻可 知非光合作用型硫鐵蛋白 Fd3，平常只會在根部作表現，並且在葉部上少量表現，

當植物在無法進行光合作用需要能量時，只能藉由醣解作用產生能量，並且經由 Fd3 傳遞電子，讓植物進行代謝反應，此外在病原菌來攻擊植物時，也會產生 Fd3 表現量上升。

肆、硫鐵蛋白之抗病能力

水稻 (O. sativa) 增量表現 sweet pepper ferredoxin-like amphipathic protein 1 (AP1)，增加抵抗白葉枯病菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 的能力 (Tang et al., 2001)。蘭花 (Oncidium orchid) 增量表現 PFLP 時，能夠增加抵抗 E. carotovora (Liau et al., 2003)。在菸草增量表現甜椒光合作用型硫鐵蛋白 sweet pepper Fd1, 又稱 Plant ferredoxin-like protein (PFLP) 時，能夠對 Erwinia carotovora subsp.

6 carotovora 與 P. syringae pv. Tabaci 產生壞齟病徵、延遲病原菌生長、增加過敏 性反應 (hypersensitive response, HR) 的標記基因 hsr203j 的表現量與累積 H2O2 的含量 (Huang et al., 2004)。在菸草上接種 Pseudomonas syringae pv.

syringae 時，會增加 Fd1 表現量，而在接種 Erwinia carotovora ssp. carotovora 時，則會降低 Fd1 表現量。在菸草上透過增量表現 PFLP 能夠抵抗 Erwinia

carotovora ssp. Carotovora 與 Pseudomonas fluorescens，而在菸草利用反股 (antisense) pflp 基因序列減少 Fd1 表現量時，增加對 E. carotovora ssp.

carotovora 與 P. fluorescens 的感病能力 (Huang et al., 2007 a)。番茄增量表現 PFLP 能夠抵抗根部病原菌 Ralstonia solanacearum 與葉部病原菌 E. carotovora subsp. carotovora。(Huang et al., 2007 b)。海芋 (Zantedeschia elliottiana) 增量表 現，能夠增加抵抗軟腐病菌 E. carotovora ssp. carotovora (Yip et al., 2007)。阿拉 伯芥增量表現分別含有細胞質與質外體 (apoplast) 蛋白的 PFLP，在感染青枯病 菌 Ralstonia solanacearum 時，能夠減少青枯病菌造成的萎凋病徵，並且增加對 Pseudomonas syringae 的 harpin (hap Z) 誘導過敏性反應 (Lin et al., 2010 )。香蕉 (Musa sp.) 增量表現 PFLP，則能夠提升抵抗 X. campestris pv. musacearum 的能 力 (Namukwaya et al., 2012)。阿拉伯芥增量表現 PFLP 時，透過 harpin 與蛋白 酶 (protease) 誘導 HR，增加對 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum 的抗病能力 (Ger et al., 2014 )。由這些文獻可知，光合作用型硫鐵蛋白具有提高 抵抗病原菌的能力，因此非光合作用型硫鐵蛋白 AtFd3 基因具有抗病的潛力。

伍、硫鐵蛋白對非生物逆境之調控能力

菸草上處理 Fe 離子逆境時，會減少葉部 Fd 含量，並且減少葉綠素含量 (Huanga et al., 1992)。菸草上轉殖阿拉伯芥的 Fd 限制 Cyclic Electron Flow 靠近 PSI (CEF-PSI)，會增加 Chl 螢光的 non-photochemical quenching (NPQ)，並且影 響低光照下植物的耐受性 (Yamamoto et al., 2006)。阿拉伯芥遇到乾旱逆境時，

AtFd1 基因表現量會增加，AtFd2 基因表現量則無改變 (Lehtimaki et al. 2010)。

阿拉伯芥 Fd-GOGAT1/GLU1 突變株能夠對冷、熱、乾旱與氧化逆境有影響性 (Kissen et al., 2010)。藻類 Chlamydomonas reinhardtii 增量表現硫鐵蛋白 PETF 亦能夠增加對熱的耐受性 (Lin et al., 2013)。大麥 (Hordeum brevisubulatum) 的

7 HbCIPK2 賦予鹽與乾旱的耐受性，並且能夠與 Fd 交互作用，暗示 Fd 可能調 控鹽害與乾旱逆境 (Zhang et al., 2015)。在熱逆境時阿拉伯芥增量表現含有葉綠 體蛋白的 PFLP，能夠降低 H2O2 含量、MDA 累積與離子滲漏，並且利用 RNAi 降低阿拉伯芥內源性的 AtFd1 與 AtFd2 時，會降低抗壞血酸 (ascorbate) 與增 加植物產生不良的反應，由此 Fd 可能與 ascorbate 調控有關，來增加植物對熱 逆境的耐受能力 (Lin et al., 2015)。由這些文獻可知光合作用型硫鐵蛋白具有參 與非生物逆境的調控能力，因此非光合作用型硫鐵蛋白 AtFd3 基因具有抵抗非 生物逆境的潛力。。

第二節、植物抗病機制