國立台東大學生命科學系碩士班
Department of Life Science National Taitung University
碩士論文
Master Dissertation
指導教授: 黃祥恩 博士 Advisor: Dr. Hsiang-En Huang
非光合作用型硫鐵蛋白 AtFd3 基因對阿 拉伯芥發育與抗病能力之影響
Non-photosynthetic-Type Ferredoxin, AtFd3, regulated plant development and
disease resistance in Arabidopsis
研究生: 陳郁雯 撰
Graduate student: Yu-Wen Chen
中華民國 105 年 7 月
July, 2016
i
謝誌
碩士班訓練中於來到了尾聲，這兩年來經歷了學校從臺東市搬遷到知本，過 程中將舊有的實驗室重新建立到新校區，過程中更加了解一間實驗室從零到有的 建立方式，也因學校搬遷在新的實驗環境與不穩定的狀態下，摸索著未知的實驗 方向，在這個的過程中感謝有「黃祥恩」老師在一旁辛勤的執導，讓我在做實驗 的目的上有更加清楚的了解，並且在學習閱讀文獻上，在我時常有疑惑的時候，
老師總是能用幽默的語言來解釋學術上專業的術語，讓我在艱澀的專有名詞中，
更加清楚文獻中作者的要表達的含意，因此總能讓我在後來的碩士班課程—專題 討論上都能高分過關，在此特別感謝老師在課業上與實驗上的指導，此外也感謝 老師這兩年來讓我有許多機會能夠參與校內與校外的學術研討會，並且訓練我有 勇氣站在台上演講與海報演說，將我們的研究成果分享給大家了解，最後再次感 謝老師在我不成熟的論文寫作上，痛苦的修改到還能讓人懂得的內容，此外也十 分感謝老師在兩年來自費請客，與從國科會計畫與校外計畫申請經費的中給予工 讀金，讓我在生活上擁有安穩舒適的校園生活。
碩士班訓練的尾聲中，感謝 「林乃君」與「葛孟杰」老師在暑假的期間，
特別坐上漫途的火車來到台東，聽著我兩年來的研究成果，並且修改有著許多奇 怪與倒裝文法的中文與英文論文內容，並且不辭辛勞的在旁註解需要修改的地方，
讓我有機會把讓人看不懂的文字修正好。在此也感謝學校老師 「彭仁君」在碩 一的課程—生命科學研究法中，讓我學習找出自己研究論文相關的文獻資料，以 及嘗試將文獻中能夠當作研究背景資料的內容，串連成具有邏輯性的前言到預期 結果，並且上台報告給非研究本領域的同儕們發問，讓我有更多機會了解自己研 究的內容。另外也特感謝學校老師「林志輝」 提供 Q-PCR 儀器，在系上儀器 故障時解救我無法進行的實驗。此外感謝系主任「李俊霖」老師找到資金填補缺 乏資源的生科系，並且在這兩年中處理系上跳電、滅菌釜、製冰機等儀器故障與 維修，讓我能在這麼多危機中平安渡過並且完成實驗。最後格外感謝系上行政主 理「蘇怡菁」小姐，協助我在申請研究室的經費報帳中如何填寫資料，以及口頭 考試申請時需要準備哪些資料，並且讓我能順利畢業。
碩士班研究的過程中非常感謝玉君、冠宇、志暄與亭采，協助我在實驗過程 中的大小事務、常與我一起腦力激盪與心情抒發，感謝已畢業的學長姐實驗技術 的傳承，也感謝實驗室的學弟妹等人，讓我有機會將學會的技術傳承，以及協助 我實驗完成。感謝家人在碩士班兩年來的支持，讓我在研究中不用擔心生活物資 上的缺乏，使得我在研究中能專心一致，並且順利完成碩士學位，最後再次感謝 兩年碩士的家人、師長、學長姐、同學與學弟妹一路上的幫忙，在未來的生活裡 祝福大家平安喜樂。
陳郁雯 謹誌 105 年 于臺東大學
ii
非光合作用型硫鐵蛋白 AtFd3 基因對阿 拉伯芥發育及抗病能力之影響
學生: 陳郁雯
國立台東大學生命科學系 (所)
中文摘要
硫鐵蛋白 (Ferredoxin, Fd) 是一群帶有二鐵二硫 (2Fe-2S) 官能基的氧化還 原蛋白，此類蛋白可藉由電子的傳遞來調控植物的基礎代謝反應，包括生長發育 與抗病能力。存在儲藏組織的 Fd 為非光合作用型硫鐵蛋白 (non-photosynthetic type Fd, nPT-Fd)。植物在進入開花繁殖期時，會開始累積 nPT-Fd，藉此將光合 作用所獲得的能量轉換至儲存性組織，而微生物的感染也會影響植物體內 nPT-Fd 的含量。為了探討 nPT-Fd 對於植物發育及對抗病原菌的角色，本實驗 利用花椰菜坎紋病毒 (Cauliflower mosaic virus, CaMV) 的 35S 啟動子，增量表 現阿拉伯芥 nPT-Fd 基因 AtFd3 的轉殖品系 (AtFd3 OE)，另外藉由 RNA 干擾 技術 (RNA interference, RNAi) 來降低阿拉伯芥內源性 nPT-Fd 含量 (NP RNAi)，
觀察 AtFd3 OE 與 NP RNAi 轉殖植株在生長發育及抗病能力之影響。實驗結果 顯示，AtFd3 OE 轉殖植株增加繁殖組織數量與水楊酸抗性路徑標記基因 AtPR1 的表現量，並且對於活性氧化物 (reactive oxygen species, ROS) 誘導物，過氧化 氫 (hydrogen peroxide, H2O2) 與巴拉刈 (Methyl Viologen, MV) 造成細胞膜傷害 回復力比較差；對 Harpin 與水淹青枯病菌誘導過敏性反應的細胞膜過氧化傷害 皆比較敏感，並且增加 AtPR1 基因的表現量，進而降低青枯病菌萎凋的病徵，
但是對炭疽病菌反而增加感病能力。另一方面 NP RNAi 轉殖植株則出現促進營 養生長、延遲進入開花繁殖的時間、減少果莢數、減少 AtPDF1.2 基因表量，對 ROS 誘導劑、Harpin、水淹青枯病菌處理時，對細胞膜氧化傷害回復力並無差 異，但在水淹青枯病菌誘導過敏性反應時，抑制 AtFd3 與 AtFd4 基因表現量，
iii 並且減少青枯病菌造成萎凋病徵，而在炭疽病菌感染時病徵則無差異。綜合以上 結果我們認為 nPT-Fd 改變植物生長大小、進入開花繁殖時間與改變果莢的數量，
而在 AtFd3 OE 轉殖植株增強植物對 ROS 的反應，並藉由 SA 的抗性路徑抵抗 青枯病菌，但是卻會增加炭疽病的感染能力。另一方面 NP-RNAi 轉殖植株則是 非藉由過敏性反應來達到抗病能力，而是可能透過 AtFd4 基因啟動未知路徑來 達到抵抗青枯病菌的能力。
關鍵字: 非光合作用型硫鐵蛋白、發育、青枯病菌、炭疽病菌
iv
Non-photosynthetic-Type Ferredoxin, AtFd3, regulated plant development and disease resistance in Arabidopsis
Author : Yu-Wen Chen
Department of Life Science National Taitung University
Abstract
Ferredoxin (Fd) is a redox protein containing a [2Fe-2S] cluster that receives and delivers electrons to regulate fundamental metabolisms regarding to plant
development and disease resistance. In natural conditions, non-photosynthetic type Fd (nPT-Fd) exists in storage tissues. In the reproductive stage, plants begin to
accumulate nPT-Fd, which is used to transfer energy obtained via photosynthesis into the storage tissues. Microbes can also affect the amount of nPT-Fd during infection of plants. In order to explore the role of nPT-Fd in plant development and resistance, we used CaMV 35S promoter to increase nPT-Fd in AtFd3 transgenic Arabidopsis OE lines and RNA interference (RNAi) technology to suppress the expression level of endogenous nPT-Fd in transgenic Arabidopsis RNAi line. Then, effects on plant development and defense responses in the OE or RNAi lines were evaluated. The results showed that AtFd3 OE lines the expression of AtFd3 inhibited growth in vegetative stage but increased reproductive tissues numbers in reproductive stage.
Under normal growth conditions, the expression of AtPR1, the marker gene of salicylic acid (SA) signaling pathway is increased in AtFd3 OE lines. Moreover, the ability to recover from membrane damage in ROS inducers, hydrogen peroxide (H2O2) and Methyl Viologen (MV) decreased in the AtFd3 OE lines. Furthermore, the AtFd3 OE lines were more sensitive to membrane damaged caused by application of harpin, and subjoined AtPR1 gene was up-regulated by harpin in the OE lines. Hypersensitive
v response (HR) was triggered and AtFd3 was induced when Arabidopsis was
submerged Ralstonia solanacearum solution. Hence, the AtFd3 OE lines exhibited higher oxidative damage in cell membrane than WT and AtPR1 gene expression was increased. AtFd3 OE lines were more resistant to R. solanacearum Rd4 when
root-cutting inoculation was performed, but did not showed progressive infection by colletotrichum sp. On the other hand, the NP RNAi line increased growth in
vegetative stage, delayed reproductive stage and decreased pod numbers. The
expression of AtPDF1.2 was inhibited in the NP RNAi line. Nevertheless, ion leakage caused by H2O2, MV, DCMU, Harpin or submerging R. solanacearum Rd4 in NP RNAi line was not different from wild type. The pathogenicity assay, the NP RNAi line reduced wilting symptom of leaves caused by R. solanacearum Rd4 and showed similar symptoms on leaves caused by Colletotrichum sp when compared to WT. NP RNAi line were more resistant to R. solanacearum Rd4 when root-cutting inoculation was performed. The expression of AtFd4 was induced after WT Arabidopsis was submerged in R.solanacearum. However, this induction was inhibited in the NP RNAi line. In conclusion, we conjecture nPT-Fd can enhance reproductive tissues of
numbers. AtFd3 OE lines against R. solanacearum by enhanced HR and salicylic acid signaling pathway, but degraded Jasmonic acid dependent resistance. In addition, the NP RNAi line facilitated resistant ability not by HR, maybe AtFd4 involved in new unknown pathway.
Key word: non-photosynthetic-type ferredoxin, development, Ralstonia solanacearum, Colletotrichum sp.
vi
目錄
致謝……….……….…...i
中文摘要………..………..……...ii
英文摘要………...iv
表目錄……….……...x
圖目錄……….…...…x
第一章、前言……….……1
第一節、硫鐵蛋白………1
壹、硫鐵蛋白之構造……….……...1
一、硫鐵蛋白影響的酵素……….………2
貳、阿拉伯芥硫鐵蛋白之分類………..………..3
叁、非光合作用型硫鐵蛋白之表現位置與表現時間………4
肆、硫鐵蛋白之抗病能力………5
伍、硫鐵蛋白之抗非生物逆境能力………..………..6
第二節、植物抗病機制………..……..7
壹、植物過敏性反應………..7
一、ROS 誘導劑誘導 HR………7
二、Harpin 誘導植物 HR 之案例……….8
三、青枯病菌誘導 HR 之案例………..8
貳、水楊酸與茉莉酸抗病路徑……….9
一、水楊酸抗病路徑標記基因 PR1 表現量影響植物對病原菌反應 之案例………9
二、茉莉酸抗病路徑標記基因 PDF1.2 表現量影響植物對病原菌 反應之案例………..10
三、水楊酸與茉莉酸抗病路徑拮抗作用之案例………...10
vii
第三節、青枯病菌與炭疽病菌………10
壹、青枯病菌之感染機制………..10
貳、植物基因轉殖抗青枯病菌之案例………..11
叁、炭疽病菌之感染機制………..12
肆、植物基因轉殖抗炭疽病之案例………12
第五節、研究動機與目的………..13
第六節、研究架構………..13
第二章、材料方法………...14
第一節、實驗材料………..14
壹、植株材料與培養條件………....14
貳、青枯病菌材料與培養條件………14
叁、炭疽病菌材料與培養條件 ……….……….14
第二節、實驗方法……….15
壹、增量表現 AtFd3 轉殖植株鑑定………………....15
貳、即時聚合酶鏈鎖反應………15
叁、植株生長發育判斷標準……….…………..16
肆、活性氧化物誘導物處理………16
伍、細胞膜離子滲漏檢驗………....17
陸、Harpin 處理…………...17
柒、北方墨點法………18
仈、青枯病菌與炭疽病菌接種……….………..19
玖、青枯病菌與炭疽病菌病徵判定標準……….…...19
拾、統計分析………...20
第三章、結果………21
第一節、建立 AtFd3OE 及 NP-RNAi 基因轉殖阿拉伯芥……….21
壹、構築 pBI121-AtFd3 質體建立 AtFd3 OE 基因轉殖阿拉伯芥……21
viii
貳、利用 PCR 篩選具同型合子的 AtFd3 OE 轉殖植株………21
叁、AtFd3 OE 轉殖植株蓮座葉與側葉具有高表現量的 AtFd3 RNA.. 22
肆、NP RNAi 轉殖植株減少 AtFd3 基因的 RNA 表現量………23
第二節、AtFd3 基因影響植株生長發育與抗性基因表現………23
壹、AtFd3 OE 轉殖植株營養生長受到抑制但是繁殖組織數量增加…23 貳、NP RNAi 轉殖植株營養生長增加，但是繁殖組織數量減少………24
叁、AtFd3 影響抗性標記基因 AtPR1 及 AtPDF1.2 表現…………....25
第三節、AtFd3 基因影響植株對活性氧化物誘導物質之反應………26
壹、AtFd3 OE 轉殖植株對 MV 造成細胞膜傷害回復力較差……….26
貳、AtFd3 OE 轉殖植株對 H2O2 造成細胞膜傷害回復力比較差……27
叁、AtFd3 OE 及 NP RNAi 轉殖植株對 DCMU 造成細胞膜傷害回覆力 反應………..…28
第四節、AtFd3 基因影響植株對 Harpin 誘導的過敏性反應………29
壹、Harpin 誘導植物增量表現 AtFd3 基因………29
貳、AtFd3 OE 轉殖植株對 Harpin 較敏感……….…..29
叁、AtFd3 影響 Harpin 誘導植物表現 AtPR1 及 AtPDF1.2 表現量的 能力………..………30
第五節、AtFd3 基因對青枯病菌水淹處理引起 HR 之影響………….…… 31
壹、青枯病菌水淹處理增加 AtFd3 基因表現量……….…… 31
貳、在 AtFd3 OE 轉殖植株水淹接種青枯病菌誘導 HR 及 AtPR1 基因 表現的能力上升，但對 AtPDF1.2 基因表現量則下降………32
第六節、增量表現 AtFd3 基因增加植物對青枯病菌抵抗能力及炭疽病菌感 病力………..33
壹、AtFd3 OE 轉殖植株增加對青枯病的抵抗能力……….…33
貳、AtFd3 OE 轉殖植株對炭疽病菌的感病能力提升……….…34
ix 叁、NP RNAi 轉殖植株對青枯病菌具有高抵抗能力但是對炭疽病菌並
無顯的抵抗能力………..…34
第七節、NP RNAi 轉殖植株體內 AtFd4 基因表現量受到抑制…………...35
第四章、討論……….…...34
第一節、AtFd3 基因轉殖植株對 AtFd3 基因表現量之差異………37
第二節、AtFd3 基因影響植株生長發育與抗性基因表現………38
第三節、AtFd3 基因參與 ROS 路徑………39
第四節、AtFd3 基因參與植物的過敏性反應………41
第五節、AtFd3 基因幫助植物抵抗青枯病菌與增加對炭疽病的感病能力…43 第六節、未來展望………..45
第五章、參考文獻………...…………46
附錄………..……..101
附錄一、PCR、Q-PCR 與 DNA probe 使用引子條件……….……101
附錄二、培養基與藥劑配方表………102
附錄三、實驗儀器………103
x
表目錄
表 1、藉由 PCR 鑑定 AtFd3 OE 品系。………...…66
圖目錄
圖 1、阿拉伯芥增量表現 AtFd3 基因之 pBI121-AtFd3 構築。……….….67圖 2 、AtFd3 OE 轉殖植株之 AtFd3 基因轉錄程度。……….68
圖 3、NP RNAi 轉殖植株之 AtFd3 基因轉錄程度。……….70
圖 4、AtFd3 OE 轉殖植株對生長生物量之差異。………..71
圖 5、AtFd3 OE 轉殖植株葉冠長發育之差異。………..72
圖 6、AtFd3 OE 轉殖植株之繁殖期組織數量。………..………73
圖 7、NP RNAi 轉殖植株之生長發育。………...74
圖 8、NP RNAi 轉殖植株對主莖發育與繁殖期組織數量之調控。………75
圖 9、AtFd3 OE 轉殖植株對抗性基因之調控能力。………..76
圖 10、NP RNAi 轉殖植株對抗性基因之調控能力。………77
圖 11、AtFd3 OE 轉殖植株對 ROS 誘導劑 MV 之細胞膜傷害程度。………..78
圖 12、NP RNAi 轉殖植株對 ROS 誘導劑 MV 之細胞膜傷害程度。…………79
圖 13、AtFd3 OE 轉殖植株對 ROS 誘導劑 H2O2 之細胞膜傷害程度。………80
圖 14、NP RNAi 轉殖植株對 ROS 誘導劑 H2O2 之細胞膜傷害程度。……….81
圖 15、AtFd3 OE 轉殖植株對 ROS 誘導劑 DCMU 之細胞膜傷害程度。…….82
圖 16、NP RNAi 轉殖植株對 ROS 誘導劑 DCMU 之細胞膜傷害程度。……83
圖 17、阿拉伯芥經由 Harpin 誘導 HR 之 AtFd3 基因表現程度。………..….…84
圖 18、AtFd3 OE 轉殖植株對 Harpin 誘導 HR 之細胞膜傷害程度。…………85
圖 19、NP RNAi 轉殖植株對 Harpin 誘導 HR 之細胞膜傷害程度。………...86
圖 20、AtFd3 OE 轉殖植株對 Harpin 誘導 HR 之抗性基因影響。…………...87
圖 21、NP RNAi 轉殖植株對 Harpin 誘導 HR 之抗性基因表現量。………..…88
xi 圖 22、NP RNAi 轉殖植株對水淹處理青枯病菌 之 AtFd3 基因表現量。……..89 圖 23、AtFd3 OE 轉殖植株對水淹接種 Rd4 誘導 HR 之細胞膜傷害與抗性基因
調控。………91
圖 24、NP RNAi 轉殖植株在水淹處理 Rd4 誘導 HR 之細胞膜氧化傷害程 度。………....93 圖 25、AtFd3 OE 轉殖植株剪根接種 Rd4 之感染染程度。………94 圖 26、AtFd3 OE 轉殖植株對 Colletotrichum sp. 水淹與噴灑接種之發病程度。.95 圖 27、NP RNAi 轉殖植株剪根接種 Rd4 之發病程度。………97 圖 28、NP RNAi 轉殖植株對 Colletotrichum sp. 水淹與噴灑接種之發病程
度。………98
圖 29、AtFd4 與 AtFd3 蛋白質序列比對相同胺基酸位置。………99 圖 30、NP RNAi 轉殖植株對青枯病菌誘導 HR 時 之 AtFd4 基因表現量。.100
1
第一章、前言
第一節、硫鐵蛋白 壹、硫鐵蛋白之構造
在生命早期發育 [Fe-S] 基團是古老的構造。在最原始的古細菌中含有 [Fe-S] 基團的 Fd，過去習慣用來做代謝路徑，在後期的演化被相似功能的 NAD/NADP 給取代。Fe 與 S 的特別化學性質結構，在大部的酵素輔助因子 (enzymatic cofactors) 之中被知道。在自然界中有許多不同類型的 [Fe-S] 基團，
在細菌固氮酶中找到硫鐵蛋白 (Ferredoxin, Fd)，有從最簡單型的 [Fe-0S] 到複 合型的 [7Fe-8S] 與 [8Fe-8S]。在哺乳類動物的 aconitase/iron regulatory protein 1 蛋白質中找到從 [4Fe-4S] 到 [3Fe-4S] 基團。在細胞外實驗中從三價鐵離子 (ferric iron) 與硫醇 (thiols) 找到簡單型基團像單核 Fd-type 基團 [Fe(SR)4] 或 是 [Fe4(SR)10] 籠型複合體。添加硫化物 (sulfide) 後獲得更多種複合型的基團，
如 [Fe2S2(SR)4] 或 [Fe4S4(SR)4]。然而在真核生物與原核生物中複合型基團的生 物合成是複雜且需要許多步驟進行，並且涉及許多蛋白質。在生命體 [Fe-S] 基 團是不可或缺，當缺少或殘缺會造成生長缺陷、生病與死亡。第一次確認 [Fe-S]
基團的功能是在含有 [Fe-S] 基團的 Fd，並作為電子傳遞，影響許多基本的生 命進行，包含光合作用、呼吸作用與固氮作用。Fd 是 [Fe-S] 基團的主要群集，
並且包含多種的 [Fe-S] 基團，這些基團習慣用來傳遞電子。在葉綠體上的 Fd 找到 [2Fe-2S] 基團，功能是傳遞電子到酵素，如亞硝酸還原酶 (nitrite reductase) 與谷氨酸合成酶 (glutamate synthase)，而在許多動物組織上，功能是將電子傳遞 到細胞色素 (cytochrome) P450。在古細菌 Streptomyces griseolus 與硫酸鹽還原 細菌 Desulfovibrio gigas 的 Fd 分別找到 [3Fe-4S] 與 [4Fe-4S] 基團。細菌的 Fd 可能也包含兩個 [4Fe-4S] 或 [3Fe-4S] 基團或 [4Fe-4S] [3Fe-4S] 組成的基 團，並且主要當作低電位的電子傳遞蛋白。在 Fd 中含有高電位的立方體 [4Fe-4S] 基團。而大部分的 Fd 在低電位 (-250 到 -650 mV) 能夠交換電子，
HiPIP (high potential iron-sulfur proteins) 蛋白能夠從 +50 到 +450 mV 電位交 換電子。HiPIP 蛋白來自紫色光合作用細菌 (purple photosynthetic bacteria)，功 能與光合作用電子傳遞的 cytochrome bc1 複合體與反應中心之間相似。其他群
2 集攜帶 [Fe-S] 基團組成的細胞膜連結蛋白質，在粒線體呼吸鏈中影響電子傳遞，
也會在葉綠體與細菌中傳遞電子。從葉綠體 b6f、cytochrome bc1 複合體與一些 含有 Rieske 蛋白的二氧酶 (dioxygenases) 分離出 [2Fe-2S] 基團。藍細菌 (cyanobacteria) 與植物在細胞膜嵌合的光系統 I (photosystem I, PSI) 蛋白，主要 是 [4Fe-4S] 基團 (Brzóska et al., 2006)。許多生物上擁有 Fd，而在植物上的硫 鐵蛋白主要是 [2Fe-2S] 基團，而 [2Fe-2S] 基團由氧化還原活性中心
[CX4CX2CXnC (n=29 or ≠29)]，周圍接上 4 個高保守性的半胱酸 (Cysteine, Cys) 基團所構成，能夠讓植物進行氧化還原反應 (Bläse et al., 1996; Kameda et al., 2011)。
一、硫鐵蛋白影響的酵素
植物的 Fd 具有 [2Fe-2S] 基團，可以傳遞電子給下游的氧化還原酵素，因 此能夠影響下游的酵素有光合作用線性電子傳遞鏈關鍵酵素
Fd-NADP-oxidoreductase (FNR)、光合作用環狀電子傳遞關鍵酵素
Fd-plastoquinone oxidoreductase (FQR)、葉綠體代謝關鍵酵素 Fd-dependent thioredoxin reductase (FTR)、氧化還原調控與訊號傳遞關鍵酵素
NADP-thioredoxin reductase C (NTRC)、硝酸鹽代謝的關鍵酵素 ferredoxin-nitrite reductase (NiR)、谷氨酸鹽代謝關鍵酵素 ferredoxin-dependent glutamate synthase (Fd-GOGAT)、白色素代謝關鍵酵素 ferredoxin-dependent bilin reductases、硫酸鹽 代謝關鍵酵素 ferredoxin-dependent sulfite reductase (SiR)、卡爾文循環 (calvin cycle) 相關酵素 phosphoribulokinase 與 fructose-1,6-bisphosphatase、澱粉合成相 關酵素 ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase)，然而透過這些酵素可影響下游 的代謝路徑包括糖的生合成 (sugar biosynthesis)、氮的代謝 (nitrogen metabolism)、
蛋白質的結構 (Protein structure)、葉綠素的合成 (chlorophyll biosynthesis)、澱粉 的生合成 (starch biosynthesis)、生長素的合成 (auxin synthesis)、晝夜節律 (circadian rhythmicity) 與過氧化物的二次訊號調控 (second messenger signal) (Balmer et al., 2006 ; Michalska et al., 2009 ; Cejudo et al., 2012 ; Hanke et al., 2013)，
3 由此可知 Fd 能夠透過下游的氧化還原酵素影響植物的生長代謝路徑與抗病路 徑。
貳、阿拉伯芥硫鐵蛋白之分類
阿拉伯芥上擁有 8 種不同的硫鐵蛋白序列，分別有 AtFd1、AtFd2、AtFd3、
AtFd4、AtFd1 mi、AtFd2 mi、FdC1 與 FdC2，依照功能與分佈位置可分為五大 類 (Hanke et al., 2004; Voss et al. 2011；Grinberg et al., 2000)。
第一類為光合作用型硫鐵蛋白 (photosynthetic-type Fd, PT-Fd) 或稱葉部型 硫鐵蛋白 (Leaf-type Fd)，存在於綠色組織中，包含 AtFd1 與 AtFd2。植株進行 光合作用時，葉綠體的光系統 II 蛋白 (photosystem II, PSII) 產生電子，將電子 依序傳遞給質體醌 (plastoquinone, PQ)、細胞色素 b6f 複合蛋白 (cytochrome b6f complex, Cyt b6f )、色素體藍素 (plastocyanin, PC) 與光系統 I 蛋白 (photosystem I, PSI)，最後將電子傳遞給 Fd，Fd 將電子傳遞給下游的 Fd–NADP+ 氧化還原 酵素 (Fd–NADP+ oxidoreductase, FNR)，使得 NADP+ 還原成 NADPH、葉綠素 生合成、光敏素生合成、脂肪合成、氧化還原代謝與氮與硫的同化作用
(assimilation)，而此過程稱為線型電子傳遞鏈 (linear electron flow, LEF)。除了 LEF 以外， Fd 也能透過環狀電子傳遞 (Cyclic electron transfer, CET) 傳遞電子，
CEF 是從光合作用中的 PSI 將電子傳遞給 Fd 後，再回頭傳遞給 Cyt b6f、PQ 與 NADPH 去氫酶複合蛋白 (NADPH dehydrogenase, NDH) 幫植物再一次的獲 得能量的過程，其中 AtFd1 可能在環狀電子傳遞扮演重要的角色， (Hanke et al., 2013)。AtFd1 與 AtFd2 氧化還原電位分別為 -425 mV 與 -433 mV，與玉米的 Leaf-type Fd 氧化還原電位相近，由於阿拉伯芥光合作用型硫鐵蛋白氧化還原電 位低於 NADPH 與玉米的 FNR，因此能夠決定了光合作用中電子的流動方向 (Hanke et al., 2004)。
第二類為非光合作用型硫鐵蛋白 (non-photosynthetic type ferredoxin, nPT-Fd) 或稱根部型硫鐵蛋白 (root-type Fd)，存在於儲存性組織 (Hanke et al., 2004)。在 非光合作用的色素體 (plastids) 上，將葡萄糖 (glucose-6-phosphate, G6P) 經由氧 化五碳醣磷酸化途徑 (oxidative pentose phosphate pathway, OPP) 產生 NADPH
4 經由氧化作用後 FNR 能夠將電子傳遞給 Fd 去進行植物的代謝反應 (Cejudo et al.,2012)。AtFd3 氧化還原電位為 -337 mV，與玉米的 root-type Fd、FNR 與 NADPH 氧化還原電位相近，因此有利於從 NADPH 催化產生的電子傳遞到 Fd，
並且對亞硫酸同化作用的還原酵素 (sulfite reductase, SiR) 有較高的親和力 (Hanke et al., 2004)。
第三類為 AtFd4 其序列與 AtFd3 相似，其氧化還原電位為 -152 mV，有 高度氧化還原潛在的功能 (Hanke et al., 2004)。第四類為粒線體型 Fd
(Adrenodoxin)，存在於粒線體中，包含 AtFd2 mi 與 AtFd1 mi，氧化還原電位 為 -250 mV，在阿拉伯芥中它們的功能還未被探討 (Grinberg et., 2000)。第五類 為具有有效延長 C 端的 Fd，包含 FdC1 與 FdC2，FdC1 能夠從 PSI 蛋白上 獲得電子，當缺乏 FdC2 並且 FdC1 上調表現時，氧化還原電位大約為 -200 mV，
能夠在 PSI 作光還原反應，但不能夠將電子傳遞給 NADPH (Voss et al. 2011)。
叁、非光合作用型硫鐵蛋白之表現位置與表現時間
利用西方墨點法檢測阿拉伯芥的 Fd 在蓮座葉上的表現量比例分別為 AtFd1 7 %、AtFd2 90%、AtFd3 3% 與 AtFd4 0.05 % (Hanke et al., 2004)；而利用 半定量聚合酶連鎖反應 (semi-quantitative PCR) 檢測阿拉伯芥的 Fd 基因表現 則發現 AtFd1、AtFd2、AtFd3 在蓮座葉、側葉、莖、果莢組織皆會表現，而在 花朵上則不表現，其中只有 AtFd3 會在根部作表現 (Hanke et al., 2005)。而利用 即時定量聚合酶連鎖反應 (quantitative real time PCR) 檢測 PT-Fd 與 nPT-Fd 表現量發現，在蓮座葉、子葉與莖部 nPT-Fd 表現量會比 PT-Fd 少，而在根部 與種子上 nPT-Fd 則比 PT-Fd 來得多 (Venegas-Calero et al., 2009)。在柑橘上 nPT-Fd 表現在花瓣、幼果、根和果肉 (Alonso et al., 1995)；玉米(Zea mays) 的 nPT-Fd 表現在幼苗的根、胚軸與根部 (Hase et al., 1991)；而向日葵的 nPT-Fd 表現在葉、子葉、莖、根與種子 (Venegas-Calero et al., 2009)，而根部組織有表 現 nPT-Fd 的植物有番茄 (Lycopersicon esculentum) (Green et al., 1991)、蘿蔔 (Raphanus sativus) (Wada et al., 1986)、水稻 (Oryza sativa) (Doyama et al., 1998)、
5 菠菜(Spinacia oleracea) (Morigasaki et al.,1990) 和白化豆芽 (Hirasawa et al., 1988)。
nPT-Fd 會存在於細胞的澱粉體 (amyloplastid) (Balmer et al., 2006)、葉綠體 (chloroplastid) (Takahashi et al., 1986) 與色素體 (plastid) 之中 (Yan et al., 2006)。
當植物進行光合作用時，在葉綠體的 Fd 能將光能傳遞至 thioredoxin (Trx) 進行 固碳反應生成蔗糖，再經由韌皮部傳遞蔗糖至植物的各個組織中，而在組織的細 胞中澱粉體經由 Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PD) 將蔗糖轉換成 NADPH，經由在澱粉體硫鐵蛋白的 Fd3 將能量傳遞給 Trx，Trx 再把能量用至 碳水化合物的代謝、氮的代謝與蛋白質構成 (Balmer et al., 2006)。此外，Fd3 會 表現在根部的色素體與葉綠體，而 Fd1 只會表現在葉綠體。在運送胜肽的 Fd1 靠近成熟區域的 Fd3 時，只會在葉綠體表現。在運送胜肽的 Fd3 靠近成熟區 域的 Fd1 時，會在葉綠體與根部的色素體表現。有此可知只有 Fd3 能夠在葉 綠體與色素體間作表現 (Yan et al., 2006)。另外在柑橘上發現乙烯會誘導 nPT-Fd 基因表現 (Alonso et al., 1995)，而在香蕉感染真菌鐮孢菌屬 (Fusarium spp.) 時，
則會誘導與玉米相似序列的 nPT-Fd 基因表現 (Berg et al., 2007)。由這些文獻可 知非光合作用型硫鐵蛋白 Fd3，平常只會在根部作表現，並且在葉部上少量表現，
當植物在無法進行光合作用需要能量時，只能藉由醣解作用產生能量，並且經由 Fd3 傳遞電子，讓植物進行代謝反應，此外在病原菌來攻擊植物時，也會產生 Fd3 表現量上升。
肆、硫鐵蛋白之抗病能力
水稻 (O. sativa) 增量表現 sweet pepper ferredoxin-like amphipathic protein 1 (AP1)，增加抵抗白葉枯病菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 的能力 (Tang et al., 2001)。蘭花 (Oncidium orchid) 增量表現 PFLP 時，能夠增加抵抗 E. carotovora (Liau et al., 2003)。在菸草增量表現甜椒光合作用型硫鐵蛋白 sweet pepper Fd1, 又稱 Plant ferredoxin-like protein (PFLP) 時，能夠對 Erwinia carotovora subsp.
6 carotovora 與 P. syringae pv. Tabaci 產生壞齟病徵、延遲病原菌生長、增加過敏 性反應 (hypersensitive response, HR) 的標記基因 hsr203j 的表現量與累積 H2O2 的含量 (Huang et al., 2004)。在菸草上接種 Pseudomonas syringae pv.
syringae 時，會增加 Fd1 表現量，而在接種 Erwinia carotovora ssp. carotovora 時，則會降低 Fd1 表現量。在菸草上透過增量表現 PFLP 能夠抵抗 Erwinia
carotovora ssp. Carotovora 與 Pseudomonas fluorescens，而在菸草利用反股 (antisense) pflp 基因序列減少 Fd1 表現量時，增加對 E. carotovora ssp.
carotovora 與 P. fluorescens 的感病能力 (Huang et al., 2007 a)。番茄增量表現 PFLP 能夠抵抗根部病原菌 Ralstonia solanacearum 與葉部病原菌 E. carotovora subsp. carotovora。(Huang et al., 2007 b)。海芋 (Zantedeschia elliottiana) 增量表 現，能夠增加抵抗軟腐病菌 E. carotovora ssp. carotovora (Yip et al., 2007)。阿拉 伯芥增量表現分別含有細胞質與質外體 (apoplast) 蛋白的 PFLP，在感染青枯病 菌 Ralstonia solanacearum 時，能夠減少青枯病菌造成的萎凋病徵，並且增加對 Pseudomonas syringae 的 harpin (hap Z) 誘導過敏性反應 (Lin et al., 2010 )。香蕉 (Musa sp.) 增量表現 PFLP，則能夠提升抵抗 X. campestris pv. musacearum 的能 力 (Namukwaya et al., 2012)。阿拉伯芥增量表現 PFLP 時，透過 harpin 與蛋白 酶 (protease) 誘導 HR，增加對 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum 的抗病能力 (Ger et al., 2014 )。由這些文獻可知，光合作用型硫鐵蛋白具有提高 抵抗病原菌的能力，因此非光合作用型硫鐵蛋白 AtFd3 基因具有抗病的潛力。
伍、硫鐵蛋白對非生物逆境之調控能力
菸草上處理 Fe 離子逆境時，會減少葉部 Fd 含量，並且減少葉綠素含量 (Huanga et al., 1992)。菸草上轉殖阿拉伯芥的 Fd 限制 Cyclic Electron Flow 靠近 PSI (CEF-PSI)，會增加 Chl 螢光的 non-photochemical quenching (NPQ)，並且影 響低光照下植物的耐受性 (Yamamoto et al., 2006)。阿拉伯芥遇到乾旱逆境時，
AtFd1 基因表現量會增加，AtFd2 基因表現量則無改變 (Lehtimaki et al. 2010)。
阿拉伯芥 Fd-GOGAT1/GLU1 突變株能夠對冷、熱、乾旱與氧化逆境有影響性 (Kissen et al., 2010)。藻類 Chlamydomonas reinhardtii 增量表現硫鐵蛋白 PETF 亦能夠增加對熱的耐受性 (Lin et al., 2013)。大麥 (Hordeum brevisubulatum) 的
7 HbCIPK2 賦予鹽與乾旱的耐受性，並且能夠與 Fd 交互作用，暗示 Fd 可能調 控鹽害與乾旱逆境 (Zhang et al., 2015)。在熱逆境時阿拉伯芥增量表現含有葉綠 體蛋白的 PFLP，能夠降低 H2O2 含量、MDA 累積與離子滲漏，並且利用 RNAi 降低阿拉伯芥內源性的 AtFd1 與 AtFd2 時，會降低抗壞血酸 (ascorbate) 與增 加植物產生不良的反應，由此 Fd 可能與 ascorbate 調控有關，來增加植物對熱 逆境的耐受能力 (Lin et al., 2015)。由這些文獻可知光合作用型硫鐵蛋白具有參 與非生物逆境的調控能力，因此非光合作用型硫鐵蛋白 AtFd3 基因具有抵抗非 生物逆境的潛力。。
第二節、植物抗病機制 壹、植物之過敏性反應
在病原菌攻擊植物時，植物會在幾個小時間產生大量的 HR，能夠在植物外 觀上產生壞疽的現象。病原菌相關分子物質 (pathogen associated molecular patterns, PAMPs) 統稱為激發子 (elicitors)，能夠誘發植物產生的 HR 反應。病 原菌產生的致病 (avirulence, avr) 基因直接或間接被植物的 R 基因辨認決定 HR 的產生。植物辨認的病原菌時，經由鈣離子通透影響鐵離子的流動與藉由細 胞膜上的 NADPH oxidase 產生 ROS，將病原菌的訊號經由傳遞路徑放大，進而 誘導大量的抗性基因表現、 ROS 路徑保護機制或細胞凋亡抵抗病原菌過程稱為 HR (Morel and Dangl, 1997)。
一、ROS 誘導劑誘導 HR
二氯苯基二甲脲 (DCMU) 為 ROS 誘導物，在植物的葉綠體行光合作用時，
阻斷電子從 PQ 傳遞到光系統 I，使得植物產生 ROS 誘導 HR 反應。甲基紫 精 (Methyl Viologen) 為 ROS 誘導物，在植物的葉綠體行光合作用時，阻斷電 子從光系統 I 傳遞到 NADP+，使得植物產生 ROS 誘導 HR 反應 (Taiz and Zeiger, 2010)。H2O2 為 ROS 成員之一，能夠使得植物誘導 HR (Levine et al., 1994)。 Fd 具有將電子傳遞給氧化還原酵素超氧化歧酶 (superoxide dismutase,
8 SOD)，而 SOD 能將 ROS 轉換成水分子，不讓植物受到過渡傷害 (Sakurai et al., 2007)，因此非光合作用型硫鐵蛋白 AtFd3 基因具有參與調控 ROS 路徑的潛 力。
二、 Harpin 誘導植物 HR 之案例
阿拉伯芥處理 Harpin 能夠誘導 HR 與抗性反應，而 Harpin 同時也能夠誘 導系統性獲得抗病 (systemic acquired resistance , SAR)，並增加基因水楊酸 (Salicylic Acid, SA) 標記基因 pathogenesis-related protein (PR1) 與 PR2 基因表 現量，當阿拉伯芥 nim1 (non-inducible immunity) 基因突變時，處理 Harpin 後 會使得對 SA 反應與 SAR 系統產生缺陷 (Dong et al., 1999 )。菸草葉片處理 Harpin 誘導 HR 時，會誘導 SA 路徑的標記基因 PR1、PR2 與 PR3 表現量增 加，並且透過 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 作用活化病原菌相關基因 HIN1 增加表現量 (Lee et al., 2001)。阿拉伯芥細胞處理 Harpin 誘導 HR 時會 增加 H2O2 與 nitric oxide (NO) 含量、造成植物細胞死亡，並且增加移除 alternative oxidase (AOS) 的 Alternative oxidase 1a (AOX1a) 基因的表現量 (Krause et al., 2004)。阿拉伯芥處理 Harpin 時誘導植物產 HR 反應，並且增加 離子滲漏與 H2O2 含量抵抗 Erwinia carotovora (Pandey et al., 2005)。菸草葉片處 理 Harpin 時，會增加植物的離子滲漏，並且啟動 HR 反應 (Vidal et al., 2007)。
在菸草增量表現 PFLP 時，在葉綠體的位置上，加強 Harpin 誘導 HR，並且透 過細胞膜上的 NADPH oxidase 增加 ROS 的產生 (Dayakar et al., 2003)。阿拉伯 芥處理 Harpin 時，會誘導 PFLP 基因表現量增加，並且在增量表現 PFLP 轉 殖植株處理 Harpin 時，增加離子滲漏量、H2O2 含量，並且可能透過蛋白酶 (protease) 路徑，增加對 P.carotovorum subsp. carotovorum 的抗病能力 (Ger et al., 2014)。由這些文獻可知經由 Harpin 誘導 HR 反應時，會誘導 ROS 路徑與 SA 抗病路徑，並且光合作用型的硫鐵蛋白會參與 Harpin 誘導的 HR，這些文 獻表示非光合作用型硫鐵蛋白 AtFd3 基因具有參與 Harpin 誘導 HR 的潛 力。
三、青枯病菌誘導 HR 之案例
阿拉伯芥葉片滲透青枯病菌時，會誘導類似的 HR 反應，並且誘導 PR1、
9 glutathione S-transferase (GST1)、Cu,Zn superoxide dismutase (SOD) 基因表現表現 量增加 (Ho and Yang., 1999)。菸草葉片滲漏青枯病菌時誘導 HR 反應，並且誘 導 SA 抗病路徑基因 PR1 表現量增加 (Kiba et al., 2003)。轉殖 PFLP 的阿拉伯 芥，需要在防禦反應快速磷酸化作用 casein kinase II phosphorylation (CK2P) 的 蛋白，並且在 Harpin 誘導 HR 時，增加 NADPH oxidase 基因的 atrboh D 基 因表現量，增強對青枯病菌的抗性反應 (Lin et al., 2011)。這些文獻表示，青枯 病菌在植物葉片上具有啟動 HR 反應的能力，同時也會增加 SA 標記基因 PR1 表現量，而光合作用型硫鐵蛋白能夠參與 HR 抵抗青枯病菌，因此將非光合作 用型硫鐵蛋白 AtFd3 基因增量表現在葉片上，具有參與青枯病菌誘導 HR 的潛 力。
貳、水楊酸與茉莉酸抗病路徑
病原菌攻擊植物時，植物辨認到病菌的 PAMP 後，會經由 ROS 誘導產生 荷爾蒙 SA 的累積，並啟動下游抗性基因表現，而其中常被使用的標記基因為 PR；另一方面 ROS 也能使得細胞膜質過氧化產生茉莉酸 (Jasmonic Acid, JA)，
同樣能夠調控細胞核的抗性基因表現，而其中常被使用的標記基因為 plant defence 1.2 (PDF1.2) (Kunkel and Brooks., 2002；Torres et al., 2010)，由 SA 與 JA 的標記基因表現量上升與下降可以知道植物是如何抵抗病原菌攻擊。
一、水楊酸抗病路徑標記基因 PR1 表現量影響植物對病原菌反應之案例 阿拉伯芥增加對病原菌感受性的 enhanceddisease susceptibility1 (eds1) 基因 突變時感染 P. syringae，使 pathogenesis-related 1 (PR1) 基因表現量降低，並且 增加對 P. syringae 感受能力 (Glazebrook et al., 1996)。阿拉伯芥感染 Erysiphe orontii 時，使 PR1、PR2 與 PR5 基因表現量增加，並且在阿拉伯芥 eds5 與 調控 SA 訊號傳遞路徑下游基因表現的 non-expresser of PR (npr1) 基因突變時 感染 Erysiphe orontii，使 PR1 基因表現量抑制，並且增加對 Erysiphe orontii 的 感受性 (Reuber et al.,1998)。阿拉伯芥累積 SA 含量的 SA induction deficient2 (sid2) 基因突變時，導致無法累積 SA 的含量，並在感染 Peronospora parasitica 與 P. syringae 時，更加容易感病，並且降低 PR1 基因表現量 (Nawrath and
10 Métraux., 1999)。番茄感染青枯病菌 Ralstonia solanacearum 時，誘導 PR1 基因 增加，並且能夠增加青枯病菌的抗病能力 (Milling et al., 2011)。由此可知植物增 加 SA 抗病路徑標記基因 PR1 時，能夠抵抗活體營養型病原菌。
二、茉莉酸抗病路徑標記基因 PDF1.2 表現量影響植物對病原菌反應之案例 阿拉伯芥增量表現 JA 生合成基因時，會使 PDF1.2 基因持續表現，同時增 加植物對灰黴病菌 Botrytis cinerea 的抗性 (Seo et al., 2001)。而在阿拉伯芥感染 炭疽病菌 Colletotrichum higginsianum 時，則會誘導 PDF1.2 基因表現量增加，
提升抵抗病原菌的能力 (Narusaka et al., 2004)。由此可知植物增加 JA 抗病路徑 抵抗死體營養型病原菌。
三、水楊酸與茉莉酸抗病路徑拮抗作用之案例
阿拉伯芥 eds4 與 phytoalexin deficient4 (pad4) 基因突變時，SA 累積會受 損，使得增加依賴 JA 防禦基因表現 (Gupta et al., 2000)；cpr6 突變株 SA 累積 量上升，同時增加依賴 SA 與 JA 防禦，經由與 eds5 雜交突變株降低 SA 表 現量，結果 PDF 1.2 基因表現量增加 (Clarke et al., 2000)。阿拉伯芥突變株 mitogen-activated protein kinase4 (mpk4) 時，SA 標記基因 PR1、PR2 與 PR5 增 加表現量與增加 SA 含量，但在 JA 標記基因 PDF1.2 抑制表現量 (Petersen et al., 2000)。阿拉伯芥 suppressor of SA insensitivity2 (ssi2) 突變株增加 PR1 基因 表現量，並在添加 JA 時抑制 PDF 1.2 基因表現量 (Kachroo et al., 2001)。阿拉 伯芥無法偵測到 JA 的下游路徑的 coronatine insensitive1 (coi1) 突變株感染 P.
syringae 時，增加 PR1 基因表現量並且增加 SA 含量 (Kloek et al., 2001)。這 些文獻顯示 SA 與 JA 的訊號傳遞彼此具有拮抗作用。
第三節、青枯病菌與炭疽病菌 壹、青枯病菌之感染機制
青枯病菌 Ralstonia solanacearum 為土壤傳播型細菌病原菌，屬於革蘭氏陰 性菌能夠移動的桿菌，可感染全球許多農作物並限制其生產量，在馬鈴薯上可造
11 成褐腐病，而在番茄、菸草、茄子、香蕉與觀賞植物，則會造成細菌型萎凋病或 南方萎凋病 (Mansfield al., 2012)。植株萎凋病徵是青枯病菌自植株受傷的部位、
根尖、側根產生時的裂縫進入維管束中生長，並產生胞外多醣體抑制木質部水分 運輸而造成的現象 (Mansfield et al., 2012；Abramovitch et al., 2006)。青枯病菌病 原性主要是依賴第三型分泌系統 (Type III Secretion System,T3SS)，而這跟 Hrp (Hypersensitive Response and Pathogenicity) 蛋白調控病原菌的發展與植物的 HR 有關。在植物細胞上細菌是由 HrpB 調控者 (regulator) 決定 Hrp 基因的表現，
然而這個活化作用需要植物細胞與細菌之間自然的交互作用，此作用的活化是藉 由細菌在外膜上的受器的 PrhA 蛋白將植物訊號傳入細菌胞內，並藉由 PrhJ、
HrpG、與 HrpB 調控者，整合成一個複雜調控的網絡。另外，青枯病菌其他致 病因子，包括 plant cell wall-degrading enzymes (CWDEs) 是經由第二型分泌系統 (typeII secretion system,T2SS) 被分泌出。而細菌會產生 β-1,4-endoglucanase (Egl)、
endopolygalacturonase (PehA)、exopolygalacuturonases (PehB and PehC)、
β-1,4-cellobiohydrolase (CbhA) 與 pectin methyl esterase (Pme)，其中 Egl、PehA、
PehB 幫助細菌持續致病 (Cunnac et al., 2004；Hikichi et al., 2007)。使得阿拉伯 芥感染青枯病菌 Rd4 與 Rd15 時，造成植物產生萎凋的病徵 (Lin et al., 2010)。
貳、植物基因轉殖抗青枯病菌之案例
Lactoferrin (LF) 是一個普遍存在的陽離子鐵結合乳醣蛋白，將 bovine LF (BLF) 基因轉殖到菸草、阿拉伯芥和小麥上，能夠讓植株抵抗 Rhizoctonia solani 與 Fusarium graminearum，在基因轉殖番茄上 BLF 賦予抵抗 Ralstonia
solanacearum 的能力，是由於 BLF 與 PR1 基因重組後具有抵抗病原菌能 力 (Lakshman et al., 2013)。 cationic lytic peptide cecropin B (CB) 是一個從巨型 蠶蛾 Hyalophora cecropia 分離出的蛋白，具有能夠抵抗革蘭氏陰性與陽性細菌 的能力，經由基因轉殖在番茄中可使得植株抵抗 Ralstonia solanacearum 與 Xanthomonas campestris pv. vesicatoria 的能力提高 (Jan et al., 2010)。
Jasmonate-Resistant 1-Like 1 是與番茄 Jasmonate-Resistant 1 (JAR1) 相似的蛋白，
12 JAR1 與 JA 訊號有關，經由基因轉殖到番茄上能夠抵抗 Ralstonia solanacearum (Wang et al., 2012)。這些文獻表示基因轉殖能夠讓植物抵抗青枯病菌。
參、炭疽病菌之感染機制
炭疽病菌 Colletotrichum sp. 為真菌性病原菌，Colletotrichum 為無性世代，
屬於腔菌綱 (Coelomycetes)，寄主廣泛包括許多種經濟作物，如香蕉、木薯、高 粱、玉米、番茄、木瓜、番荔枝、龍眼、芒果、波菜、豆類、黃瓜等作物 (Dean et al., 2012, Cannon et al., 2012)，可感染植株的葉片、莖部與果實 (Cai et al., 2009)。
在高濕度環境下藉由分生孢子感染寄主。分生孢子附著於植物細胞上，伸出附著 器 (appressorium)，將主要菌絲 (primary hyphae) 深入植物細胞膜上，此時病原 菌為短暫的活體營養型，之後要從植物生上獲得養分時，轉換成死體營養型，將 次要菌絲分支整個深入細胞體內，使得植物細胞死亡。炭疽病感染阿拉伯芥時，
外觀上造成黃黑色腐爛的病徵 (O'Connell et al., 2012 )。
肆、植物基因轉殖抗炭疽病之案例
NB-LRR-type disease resistance (R) 是過去習慣拿來保護植物的蛋白，因此 將阿拉伯芥 NB-LRR-type R 基因中的 RPS4 與 RRS1 共同轉殖至十字花科與 茄科作物上，能夠分別抵抗 Colletotrichum higginsianum 與 Colletotrichum orbiculare (Narusaka et al., 2013)。LJAMP2 是一個從益母草 Leonurus japonicas 分離出來的抗菌蛋白，將其轉殖到中國的白楊 Populus tomentosa 上能夠抵抗 Colletotrichum gloeosporioides 與 Alternaria alternata (Jia et al.,2010)。高粱的 MYB Transcription Factor，能夠產生 3-deoxyanthocyanidin phytoalexins 抵抗 Colletotrichum sublineolum，但是玉米的 MYB Transcription Factor 無法產生 3-deoxyanthocyanidin phytoalexins，因此將高粱的 MYB Transcription Factor 轉殖 到玉米上也有抵抗 Colletotrichum sublineolum 的能力 (Ibraheem et al., 2015)，由 以上可知藉由基因轉殖應能幫助植物抵抗炭疽病菌。
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第五節、研究動機與目的
硫鐵蛋白能將光合作用與醣解作用產生的電子，接受並傳遞給下游的氧化還 原酵素，進而影響植物的生長代謝與抗病路徑。許多基因轉殖作物上都能夠抵抗 青枯病菌與炭疽病菌。植物產生 ROS 時，能透過 HR、SA 與 JA 抗病路徑幫 助植物抵抗病原菌。阿拉伯芥轉殖甜椒的光合作用型硫鐵蛋白 PFLP 時，能透 過 ROS 路徑誘導 HR 抵抗青枯病菌。然而阿拉伯芥光合作用型硫鐵蛋白只會 表現在綠色組織上，並且需要依賴光才會有功能，而非光合作用型硫鐵蛋白平常 表現在根部組織，以及少量表現在葉部組織上，並且不需要依賴光就能有功能，
因此本實驗想藉由農桿菌轉殖法，轉殖花椰菜坎紋病毒 35 S 啟動子控制 AtFd3 基因，來增加外源性的 AtFd3 基因在阿拉伯芥的各個組織上表現，並利用 RNAi 干擾技術將內源性 AtFd3 基因的表現量降低，來探討非光合作用型硫鐵蛋白 AtFd3 基因調控阿拉伯芥的發育與抗病能力。
第六節、研究架構
非光合作用型硫鐵蛋白 AtFd3 基因對阿拉伯芥發育與抗病能力之影響
建立 AtFd3 OE 及 NP RNAi 基因轉殖阿拉伯芥
AtFd3 基因對植株生長發育與抗性基因表現之影響
AtFd3 基因對 ROS 誘導物質之反應
AtFd3 基因對 Harpin 誘導植株的過敏性反應之影響
AtFd3 基因對於青枯病菌水淹處理誘導植株過敏性反應之影響
AtFd3 基因對青枯病菌抗病能力及炭疽病菌感病能力之影響
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第二章、材料方法
第一節、實驗材料 壹、植株材料與培養條件
實驗進行使用阿拉伯芥 Arabidopsis thaliana 生態型 (ecotype) Columbia-0 為 實驗中的控制組野生型 (Wild type)，實驗組為三個增量表現 AtFd3 OE 品系分 別為 2-4、7-6 和 8-3 與靜默表現 NP RNAi 轉殖植株。NP RNAi 種子來自 Hase 博士實驗室 (Hanke and Hase., 2008)。種子利用 70 % 酒精清洗 1 分鐘、含 0.1
% Tween 20 (Riedel-de Haen, Germany) 1.2 % 次氯酸鈉清洗 5 分鐘、無菌水清洗 1 分鐘 5 次後，置於 4 °C 春化 14 小時。種子培養於固態培養基 1/2 Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) (Sigma, US)，或介質 (真珠石:泥炭土=1:1) 中，
兩者皆在 22 °C，光照 16 小時與黑暗 8 小時循環，光照強度 330 μmol m-2 s-1 的生長箱中生長。
貳、青枯病菌材料與培養條件
青枯病菌為 Ralstonia solanacearum Radish 4 (Rd4) 與 Radish 15 (Rd15)，菌 株液態培養於培養基中 (Nutrient Broth pH 7.0, NB) (ST-Bio, Taiwan)，在全黑暗中 培養於 28 °C，震盪轉速 150 rpm 的培養基中生長。
叁、疽病菌材料與培養條件.
炭疽病菌為 Colletotrichum sp.，由番茄葉片上分離，經由 ITS1 與 ITS4 引 子鑑定，PCR 產物大小 600 bp，經由基隆米克斯公司解序後，利用美國國家級 生物資訊中心 (National Center for Biotechnology Information, NCBI）資料庫作序 列比對，由此獲得病原菌名稱 (資料沒有呈現)，病原菌培養在固態 1/5 馬鈴薯 培養基 (Potato Dextrose Agar, PDA) 上，在 12 小時光照與 12 小時黑暗循環，
15 26 °C 的培養箱中生長。
第二節、實驗方法
壹、增量表現 AtFd3 轉殖植株鑑定
農桿菌 Agrobacterium tumefaciens GV3101 pBI121-Fd3 培養於含 25 ppm 建 大黴素 (Gentamicin) (Sigma, USA) 與 50 ppm 卡那黴素 (Kanamycin) (Sigma, USA) 的 Luria Bertani (LB) (配方在附錄二) 培養基中生長，將阿拉伯芥花朵浸 泡在農桿菌菌液中，經由自花授粉後收取後代，T0 子代在含 50 ppm Kanamycin 的 MS 培養基中篩選出 2-4、7-6 與 8-3 品系。抗生素篩選後，將 T2 到 T5 子 代轉殖植株，利用植物基因組 DNA 迷你試劑組 (plant genomic DNA mini kit) (Geneaid, Taiwan) 抽取植株葉片組織基因組 DNA，之後利用專一性引子 35S 啟動子 (promoter) 與 NOS 終止子 (terminator) (附錄一)，經由聚合酶連鎖反 應 (polymerase chain reaction, PCR) 鑑定外源性 AtFd3 基因序列大小為 773 base pair (bp)。
取1 μl 基因組 DNA、1 μl 10 mM 35S 與 NOS 引子 (Blossom, Taiwan)、3 μl 10X PCR 緩衝液 (Protech, Taiwan)、1 μl 2.5 mM dNTP (Protech, Taiwan)、0.1 μl 5 units/μl Pro Taq DNA polymerase (Protech, Taiwan) 與無菌水體積填補至 30 μl 後，
做 PCR 反應。取 5 μl PCR 產物與 1 μl 6X Loading dye (Protech, Taiwan) 混合 後加入，由 0.5 X Tris-Acetate-EDTA 緩衝液 (TAE buffer) (Protech, Taiwan) 配置 成 1 % agarose-LE 1200 (Taiwain Agar Agar, Taiwan)，進行電泳在 0.5 X TAE buffer 環境下分離 DNA 片段，電泳率設定為 16.67 V cm-1，再由溴化乙錠 (Ethidium Bromide, EtBr) (Zymeset, Taiwan) 染色 5 分鐘，最後由電泳膠數位影 像系統拍攝，由此可知轉殖植株是否帶有外源性 AtFd3 基因的 DNA 序列。
PCR 反應之控制組，大腸桿菌 Escherichia coli DH5α 含 pBI121-Fd3 培養 於含 50 ppm Kanamycin 的 LB 培養基，在全黑暗 28 °C，震盪轉速 150 rpm 的
16 培養箱中生長，利用質體迷你試劑 plasmid mini kit (Sigma, US) 抽取 plasmid DNA，之後以上述作為 DNA 模板進行 PCR 反應。電泳之控制組為 100 bp DNA Ladder (Basic Life, Taiwan)。
貳、即時聚合酶鏈鎖反應 (Quantitative real time polymerase chain
reaction, Q-RT-PCR)
收取阿拉伯芥組織，利用總量 RNA 迷你試劑 (Tissue Total RNA Mini Kit) (Favorgen, Taiwain) 抽取植物組織總量 RNA，經由 MMLV Reverse Transcription kit (Protech, Taiwan) 將 1 μg RNA 反轉錄成 cDNA，再加入 1 μl 10 mM Q-正反引 子 (Blossom, Taiwain) (附錄一)、2 μl 10X PCR 緩衝液、1 μl 2.5 mM dNTP、0.1 μl 5 units/μl Pro Taq DNA polymerase、10μl 2X super SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, US) 與無菌水體積填補至 20 μl，以 Quantitative real-time PCR StepOne 儀器 (附錄三) 進行 Q-RT-PCR，將 AtEFlα 基因的 RNA 放大到 最高螢光數量的循環數作為分母，與待測基因的 RNA 放大到最高螢光數量的循 環數作為分子，由兩者所獲得循環數比值作為相對值的數據。
叁、植株生長發育判斷標準
生物面積計算方式以 0.25 cm2 方格數量換算出生長面積 (Grbic and Bleecker., 1995)。葉冠長計算方式為每棵植株水平方向最長距離與垂直方向最長距離相加 總和。繁殖組織計算方式，主莖與側莖長度大於 0.5 cm，花有白色花瓣，花苞 與果莢長度大於 0.1 cm，側葉長大於 0.2 cm (Boyes et al., 2001)。
肆、活性氧化物誘導劑處理
17 活性氧化物 (ROS) 誘導劑分別取 0.1 mM Methyl viologen (MV) (Sigma, US) 與 50 mM H2O2 (Shimakyu, Japan)，浸泡培養於 1/2 MS 培養植株上 5 分鐘；
10 μM 3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea (DCMU) (Sigma, US)，則是浸泡 30 分鐘。
伍、細胞膜離子滲漏檢驗
將整株植物組織浸泡於 1 ml 超純水中，700 mmHg 真空抽氣 5 分鐘，放 氣 2-3 分鐘，重覆 3 次，靜置 5-10 小時，測離子滲漏量，之後沸水煮 10 分 鐘，冷卻 20 分鐘，再測離子滲漏量，計算離子滲漏率公式為 (原離子滲漏量/
煮沸後離子滲漏量) × 100 %。
陸、Harpin 處理
大腸桿菌 Escherichia coli DH5α pSY10-Hrp Z 來自 Collmer 博士實驗室 (He et al.,1993)，將細菌培養於含 50 ppm 氨苄青黴素 (Ampicillin, Amp) (Sigma, US) 的 LB 培養基，在 28 °C 全黑暗與震盪 150 rpm 的培養箱中生長，當細菌生 長至 OD 值約 0.4 到 0.6 時，添加 Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) (Zymeset, Taiwan) 至最終濃度為 0.5 mM，以誘導 HrpZ 蛋白產生，細菌持續生長至 OD 值約 0.8 到 1.0 時，取菌液於室溫下以 3,000 rpm 離心 15 分鐘，在含 200 mM NaCl pH 7.0 10 mM sodium phosphate (PI) 緩衝液重新懸浮，以 4,000 rpm 離心 5 分鐘，重覆 3 次，之後於 -80 °C 冷凍過夜，使得細胞被打破，震盪回溶後，於 4 °C 9,000 rpm 離心 10 分鐘後，取上清液沸水煮 10 分鐘，使蛋白變性，之後 在 4 °C 9,000 rpm 離心 10 分鐘，取上清液以 protein assay dye reagent 試劑組 (Bio-Rad, US) 定量蛋白質，-80 °C 保存，經由小牛血清蛋白 (Bovine serum albumin) (Sigma, US) 做出的標準曲線換算蛋白質濃度。Harpin 添加試驗時，以 PI 緩衝液製備 0.05 μg/μl Harpin 後，在 1/2 MS 培養基上生長的 21 天大植株，
18 以每盤 2 ml 的 harpin 作處理。Harpin 注射試驗時，取 20 μl 0.1 μg/μl Harpin 以 無針頭之針筒注射，至以介質培養的 40 天大的植株葉片中。
柒、北方墨點法
收取以水淹處理 Harpin 後 4 天的阿拉伯芥植株，利用 Tissue Total RNA Mini Kit 抽取植株地上部組織總量 RNA。取 10 μg RNA 與等體積 RNA loading dye (Ambion, US) 混和 50 °C 水浴 30 分鐘，之後加入含 1X Running buffer (MOPS/Sodium Acetate/EDTA buffer) (Ambion, US) 製成 1 % RNA-free Agarose gel (Ambion, US) 的孔洞中，以 700 ml 1X Running buffer 進行電泳分離 RNA，
電泳率設定為 5 V cm-1。由電泳膠數位影像系統拍攝，當作 RNA 總量，接著由 往上依序堆疊衛生紙、3 張濾紙 (toyo roshi kaisha, Japan)、hybridization transfer membrance (PVDF) (Blossom, Taiwan)、Gel、3 張濾紙、鹽橋用 3 張濾紙、水平 蓋子重量約 150 到 200 g，每樣皆浸泡過 Transfer buffer (Ambion, US)，經由虹 吸管原理轉置 1.5 到 2 小時，取出 hybridization transfer membrance 正反面均以 0.12 J mol sec-1 UV 處理 1 分鐘，讓 mRNA 黏合在膜上，再將膜放入雜交管 中 (hybridization tube, Thermo Hybaid, US) 中，添加 20 ml prehybridization solution，68 °C，30 rpm，1 小時，去掉溶液，添加 5 ml hybridization solution (此 藥劑會重複使用，使用時加熱至 95 °C)，68 °C，30 rpm，過夜，去掉溶液，加 5 ml 2 X wash solution，25 °C，30 rpm，15 分鐘，去掉溶液，重覆 1 次，加 5 ml 0.5 X wash solution，68 °C，30 rpm，15 分鐘，去掉溶液，重覆 1 次，加 100 ml Wash buffer 室溫，30 rpm，2 分鐘，去掉溶液，加 30 ml 1 % Blocking solution，
室溫，30 rpm，2 小時，去掉溶液，加 5 ml Antibody solution，室溫，30 rpm，
30 分鐘，去掉溶液，加 100 ml wash buffer，室溫，30 rpm，15 分鐘，去掉溶液，
共 2 次，加 20 ml Detection Buffer，室溫，30 rpm，3 分鐘，去掉溶液，加 1 ml CDP-Star chemiluminescence Reagent (Perin Elmer, US) 呈色，壓片 3 到 5 分鐘，
19 浸泡顯影劑 1 分鐘，浸泡於水中 1 分鐘，浸泡定影劑 1 分鐘，電腦掃描圖片。
(Buffer 配方在附錄二)
欲置備 DNA Probe 時，抽取 WT 阿拉伯芥基因組 DNA，經由 PCR 放大 PR1 序列數量，取 1 μl PCR 產物、3 μl PCR DIG labling MixPlus dUTP (Roche, Switzerland)、1 μl 10 mM PR1 引子 (Blossom, Taiwain)、3 μl 10X PCR 緩衝液、
0.1 μl 5 units/μl Pro Taq DNA polymerase 與無菌水體積填補至 30 μl，作 PCR，
經由電泳確認產物有無產出 (引子序列在附錄一)。
捌、青枯病菌與炭疽病菌接種
隔夜培養的青枯病菌，以 6,000 xg 離心 10 分鐘去培養基後，以無菌水重 新懸浮，再次以無菌水將菌液調整至 105 CFU/ml (含 0.025 % silwet L-77
surfactant, Helena Chemical, US)。水淹接種法是將培養於 1/2 MS 培養基生長 21 天大的植株，以菌液浸泡 30 分鐘；剪根接種法則是將介質培養的植株取出，剪 去一半根部之後，將根部浸泡於調整好濃度的菌液中 10 分鐘後，再重新種回土 壤中。
培養於斜面 1/5 PDA 培養基上的炭疽病菌以無菌水 (含 0.05 % Tween 20) 將孢子沖洗下來，將分生孢子調整濃度至 104 spores/ml (含 0.025 % silwet L-77 surfactant)，之後將分生孢子接種在 1/2 MS 培養基生長 21 天大的植株，浸泡 30 分鐘；噴灑接種於介質培養 40 天大的植株，以每株 50 ml 體積噴灑。
玖、青枯病菌與炭疽病菌病徵判定標準
青枯病菌病徵判定標準，依萎縮病葉數量分為 6 級，0 級為未發病，1 級為 發病 1 至 2 片，2 級為發病 2 至 3 片，以下已此類推至 5 級，發病率 (%) 換算 公式為 (N0*n+N1*n+N2*n+N3*n+N4*n+N5*n) /(Nt*nt) *100，N 為級數，n 為 樣本數，Nt 為總級數，nt 為樣本總數。
20 炭疽病病徵判定標準，依黃黑點病徵數量葉片數分為 10 級，0 級為未發病，
1 級為發病 1 片，2 級為發病 2 片，以下已此類推至 9 級，發病率 (%) 換算公式 為 (N0*n+N1*n+N2*n+N3*n+N4*n+N5*n+N6*n+N7*n+N8*n+N9*n)/(Nt*nt)*100 ， N 為級數，n 為樣本數，Nt 為總級數，nt 為樣本總數。
拾、統計分析
經由 SPSS 12.0 統計軟體，單因子變異數分析 (One way analysis of variance, ANOVA)，假設相同變異數 Duncan 氏，顯著水準 p<0.05。比較平均數經由 Microsoft Excel 2007 計算所得。
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第三章、結果
第一節、建立 AtFd3 OE 及 NP RNAi 基因轉殖阿拉伯芥 壹、構築 pBI121-AtFd3 質體建立 AtFd3 OE 基因轉殖阿拉伯芥
AtFd3 基因可以調控植物許多基礎代謝反應。但是過去的研究顯示此基因在 阿拉伯芥的蓮座葉等營養生長組織表現量很低，只有到了開花繁殖期才會開始增 量表現 (Venegas-Calerón et al., 2009)，因此本研究為了瞭解此基因對植株生長發 育與抵抗病原菌反應之影響。藉由 35S 啟動子 (promoter) 來改變植物體內 AtFd3 的表現時間、表現位置及表現總量，藉以探討當阿拉伯芥 Arabidopsis thaliana lines Col-0 全株大量表現外源性 AtFd3 基因時，對於生長及抵抗病原菌 的影響。實驗使用帶有 pBI121-AtFd3 質體的農桿菌 Agrobacterium tumefaciens GV3101 來進行轉殖。pBI121-AtFd3 質體的構築內容包含農桿菌 Nopaline Synthase (NOS) 的啟動子、抗抗生素基因 Neomycin Phosphotransferase II (NPT II) 與 NOS 的終止子 (terminator) 序列。此質體可讓基因轉殖植株生長在含有卡 納黴素的抗生素培養基上，藉此篩選出帶有外源性序列的轉殖植株。另外在 Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 的 35S 啟動子序列及 NOS 的終止子序列間，
利用限制酶酵素 Hind III、Bam HI、Sac I 插入 AtFd3 基因 (圖1)。經由農桿菌 轉殖與抗生素篩選後，獲得 AtFd3 增量表現轉殖植株的品系的 T0 子代。
貳、利用 PCR 篩選具同型合子的 AtFd3 OE 轉殖植株
基因轉殖的過程中，外源性序列需要完整插入植物基因組 DNA 中並藉由 自花授粉產生同型合子，才能將外源性基因穩定的遺傳給下一代。為了確定 AtFd3 OE 轉殖植株品系的基因組 DNA 上，具有外源性 AtFd3 基因的同型合 子，利用 PCR 檢定自花授粉後 T2 到 T5 子代的不同品系基因轉殖植株。檢 驗時利用 35S promoter 與 NOS terminator 的序列設計專一性引子 (附表一) 對 基因組DNA 進行 PCR，預計放大的外源性 AtFd3 基因片段為 773 base pair (bp)，利用膠體電泳計算轉殖比率並判斷同型合子狀態。由結果可知在 T5 子代 轉殖植株品系 7-6-9-A-1 與 2-4-1-A-1 轉殖比率分別為 100 % 與 95 %，在 T4 子代轉殖植株品系為 8-3-A-1、7-6-9-A、2-4-1-A 轉殖比率分別為 91.6 %、98 %
22 與 100 %，在 T3 子代轉殖植株品系為 8-3-A、7-6-9、2-4-1 轉殖比率分別為 85.7 %、95 % 與 86 %，T2 子代轉殖植株品系為 8-3 轉殖比率為 90 %，WT 轉 殖比率為 0 % (表1)。由此結果推測上述 AtFd3 OE 品系均具有 AtFd3 外源性 基因的同型合子。
叁、AtFd3 OE 轉殖植株蓮座葉與側葉具有高表現量的 AtFd3 RNA
為了比較不同組織中 AtFd3 基因表現量在 WT 中的差異，本研究抽取種植 88 天後阿拉伯芥蓮座葉 (Rosette Leaves, RL)、側葉 (Cauline Leaves, CL) 與花 (Flowers, F) 組織部位的總量 RNA，並利用 Q-RT-PCR 比較 AtElf α 基因及 AtFd3 基因的相對表現量，結果顯示在側葉及花組織部位的 AtFd3 表現量顯著 高於蓮座葉 10 到 14 倍 (圖2 A)。另外實驗中也進一步比較在不同生長期阿拉 伯芥蓮座葉中 AtFd3 基因的表現量，結果顯示處於開花繁殖期 (105 天) 之 WT 蓮座葉， AtFd3 基因的表現量僅比營養生長期 ( 40 天) 增加 1.3 倍，且 不具統計的顯著差異 (圖2 B)。此結果表示 AtFd3 基因表現量在 WT 植株中，
大部分僅出現在側葉及花組織部位，即使進入開花繁殖期，AtFd3 基因的表現量 在阿拉伯芥的蓮座葉組織中，並無明顯增加的情形。
為了檢測 AtFd3 OE 轉殖植株其蓮座葉組織內部 AtFd3 基因表現量是否 有增量表現。本研究將 WT 及三種不同的 AtFd3 OE 基因轉殖植株分別培養至 88 天後，利用 Q-RT-PCR 分別檢測其 AtFd3 基因表現量，結果顯示在不同的 AtFd3 OE 轉殖品系 2-4、7-6、8-3 中，AtFd3 的基因表現量分別比 WT 多出 1500 倍、10 倍與 20 倍，統計分析後均有顯著增加的差異 (圖2 C)。此結果顯 示 AtFd3 OE 2-4 品系為高表現量轉殖植株品系，而 AtFd3 OE 7-6 與 AtFd3 OE 8-3 品系為低表現量轉殖植株品系。再進一步選用高表現量的品系 AtFd3 OE 2-4，
比較不同組織中 AtFd3 基因表現量的增加情況，結果顯示 AtFd3 基因的表現量 在 AtFd3 OE 2-4 品系的蓮座葉比 WT 增加 1500 倍，而在側葉則有 2100 倍 增加，在花的組織則只有 90 倍增加 (圖2 D)。上述結果表示在本研究中成功選 殖出三個不同 AtFd3 基因表現量的 AtFd3 OE 轉殖植株品系，而其中高表現量 品系 AtFd3 OE 2-4 的 AtFd3 基因表現量，在蓮座葉與側葉組織增加比較多，
但是在花的組織則增加效果比較低。
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肆、NP RNAi 轉殖植株減少 AtFd3 基因的 RNA 表現量
為了瞭解降低內源性 AtFd3 基因的表現量對於植物生長發育與抵抗病原菌 之影響，因此從 Hank 氏研究室獲得 Non-photosynthetic-Type Ferredoxin (NP) RNAi 轉殖植株 (Hank et al., 2008)，轉殖植株藉由 35S 啟動子、AtFd3 基因正 股序列、AtFd3 基因反股序列與 NOS terminator 序列構築基因表現，藉由 RNAi 的機制讓植株減少內源性 AtFd3 基因表現量。而本研究為了確認該 NP RNAi 轉殖植株確實具有降低植株內源性 AtFd3 基因表現量的功能。所以將 WT 及 NP RNAi 轉殖植株培養在 1/2 MS 培養基生長 21 天後，萃取其蓮座葉組織的 總量 RNA，利用 Q-RT-PCR 量化 AtFd3 基因的相對表現量。結果顯示 NP RNAi 轉殖植株的 AtFd3 基因表現量顯著下降至 WT 的 0.6 倍 (圖3 A)，表示 NP RNAi 轉殖植株的內源性 AtFd3 基因表現量確實成功被抑制。另外研究也檢 視在介質環境中生長 60 天後的植株，同樣萃取蓮座葉組織，並利用檢測 Q-RT-PCR 量化 AtFd3 基因的相對表現量，結果同樣顯示 NP RNAi 轉殖植株 體內的 AtFd3 基因表現量比 WT 顯著下降至 WT 的 0.4 倍 (圖3 B)，上述實 驗驗證 NP RNAi 轉殖植株蓮座葉組織的內源性 AtFd3 基因表現量確實有比 WT 減少的效果。
第二節、AtFd3 基因影響植株生長發育與抗性基因表現 壹、AtFd3 OE 轉殖植株營養生長受到抑制但是繁殖組織數量增加
AtFd3 會藉由調控關鍵酵素的活性來參與許多物生長發育相關的基礎代謝 路徑，為了瞭解藉由 35S 啟動子增量表現外源性 AtFd3 基因對於植物生長的影 響，將 WT 及三個不同 AtFd3 OE 轉殖植株分別垂直培養於 1/2 MS 培養 16 天後，觀察其地上部與地下部組織生長情形 (圖4 A)。結果顯示 AtFd3 OE 轉殖 植株地上部的葉冠組織分別比 WT 減少 50 %，統計分析結果具有顯著差異，
而根部面積在 AtFd3 OE 轉殖植株與 WT 相比減少 50 %，經統計分析結果具 有顯著差異 (圖4 B)，上述結果顯示三個不同的 AtFd3 OE 基因轉殖植株在植物 生長初期的葉冠與根部生長均受到明顯的抑制。
為了進一步了解增量表現外源性 AtFd3 基因對於植物營養生長期的影響，
所以將三個不同的 AtFd3 OE 轉殖植株培養於介質環境中 40 天後，觀察其地
