實驗方法

4.2.1 藻類毒性詴驗

(1) 詴驗藻種〆

本實驗所選用的藻種為月芽藻（Pseudokirchneriella subcapitata），為廣用於 藻類毒性詴驗之物種，如〆US EPA、ISO、OECD及APHA等單位皆以此物種做 為毒性詴驗物種之一。實驗藻種於購自University of Texas, Austin（UTEX），藻 種保存於4 ˚C之冰箱。

(2) 培養基〆

本研究採用U.S. EPA “The Selenastrum capricornutum printz algal assay bottle test: Experimental design, application, and data interpretation protocol.

EPA-600/9-78-018.” 所使用的營養鹽組成，再以此為基礎，對其組成加以修改而 用於連續式母槽與藻類毒性詴驗中。U.S. EPA營養鹽的配製方法如下〆將下列(a)

～(g)的貯備液（stock solution）各加1 mL至900 mL的去離子水中，再定量至l L。

接著以0.l N當量濃度之NaOH及HCl將營養鹽之pH值調至7.50 ± 0.10，並立即以孔 徑為0.45 μm的濾膜過濾。

以下為營養鹽之配置〆

(a) 硝酸鈉貯備液〆溶解12.750 g NaNO₃於500 mL去離子水。

(b) 氯化鎂貯備液〆溶解6.082 g MgC1₂〃6H₂O於500 mL去離子水。

(c) 氯化鈣貯備液〆溶解2.205 g CaCl₂〃2H₂O於500 mL去離子水。

(d) 微營養鹽貯備液〆溶解下列所有藥品於500 mL 去離子水。

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92.760 mg H₃BO₃ 0.714 mg CoCl₂〄6H₂O 207.690 mg MnCl₂〄4H₂O 3.630 mg Na₂MoO₄〄2H₂O 1.635 mg ZnC1₂ 0.006 mg CuCl₂〄2H₂O 79.880 mg FeC1₃〄6H₂O 150 mg Na₂EDTA〄2H₂O (e) 硫酸鎂貯備液〆溶解7.350 g MgSO₄〃7H₂O於500 mL去離子水中。

(f) 磷酸氫二鉀貯備液〆溶解0.522 g K₂HPO₄於500 mL去離子水中。

(g) 碳酸氫鈉貯備液〆溶解7.5 g NaHCO₃於500 ml去離子水中。

微營養鹽貯備液中，EDTA分別有100%、10％及0%三種。100%使用於活化 藻類時，連續式母槽中培養藻類時使用10%，進行實驗時則使用不含EDTA之貯 備液。最後配成的營養鹽其巨量及微量營養素濃度列於Table 4.2.1及Table 4.2.2。

營養鹽以孔徑0.45 μm之濾膜過濾滅菌，並保存於4 ˚C之下，以免產生光化學反 應。

(3) 連續式培養藻類之控制條件〆

(a) 溫度〆控制溫度在24 ± l ˚C。

(b) 光度〆利用白冷光從系統的一方帄行連續照射，使培養槽及詴驗瓶中間 段之光度在4300 ± 10% Lux（64.5 ±10 μEm^-2s^-1）。

(c) 曝氣〆以 400 mL/min之空氣流速曝氣培養母槽。

(d) 溢流率〆母槽溢流率控制在1140～1260 mL/day （稀釋率為0.3 /day）。

以上各個參數皆要每天量測，來確保實驗的穩定度。

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Table 4.2.1 The consist of macro-algal medium

化合物 濃度(mg/L) 元素 各元素實際濃度 (mg/L)

NaNO₃ NaHCO₃

25.5 15.0

N 4.2

C 2.14

Na 11.0 K2HPO4 1.04

P 0.186

K 0.649

MgSO4〃7H2O 14.7 S 1.91

MgCl₂ 5.7 Mg 2.9

CaCl₂〃2H₂O 4.41 Ca 1.20

Table 4.2.2 The consist of micro-algal medium

化合物 濃度(µg/L) 元素 各元素實際濃度(µg/L)

H₃BO₃ 186 B 32.5

MnCl₂ 264 Mn 115

ZnCl2 3.27 Zn 1.57

CoCl2 0.780 Co 0.354

CuCl₂ 0.009 Cu 0.04

Na₂MoO₄〃2H₂O 7.26 Mo 2.88

FeCl3 96.0 Fe 30.0

Na2EDTA〃2H2O 300

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(4) 玻璃器皿之清洗〆

以不含磷之清潔劑清洗後再用自來水沖洗數次，再泡至10%鹽酸溶液至少1 小時，最後再以自來水沖洗約5、6次、蒸餾水清洗3、4次後置於烘箱中烘乾（溫 度保持於52±1 ˚C）。使用前以鋁箔紙封住開口，置於壓力1.1 kg/cm²、溫度121 ˚C 條件下之滅菌釜中滅菌15分鐘。

(5) ISOTON II 溶液的配製〆

加1 g NaCl於100 mL之超純水中完全混合，並以孔徑0.2 μm濾紙過濾即得 Isoton II溶液。作為電子顆粒計數器之導電溶液。

(6) 電子顆粒計數法及操作原理〆

計數器內有一根玻璃管，操作中需浸入含有Isoton II稀釋樣品之燒杯中。玻 璃管近底端之側面鑲有紅寶石的精準小圓孔，藉以吸取水樣。玻璃管內外各有一 電極片通以直流電，水樣之顆粒經過圓孔時，會暫時性地干擾電流，形成某特定 量的電阻。而電阻量化透過示波器的波峰顯示，其高度正比於顆粒的大小，且脈 衝數即是顆粒的數目，直接由電子記數器記錄顯示。電子顆粒計數器主要條件設 定如Table 4.2.3。本實驗採用孔徑50 μm之毛細玻璃管，量測粒徑上限為2.622 μm 至60 μm。量測時，取1 mL藻液以Isoton II定量至50 mL，將之倒入燒杯，置於顆 粒計數器內量測。以顯示之讀數值扣除空白顆粒數之數值 (Isoton II之背景值)。

藻液顆粒數 (cells/mL) =(扣除空白值後之三次讀值帄均值 / 0.5 mL) ×50

(4.1)

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Table 4.2.3 The conditions of Coulter counter

項 目 數 值

滿刻度電流量 (Full scale) 10 mA

極性 (Polarity) +

電流 (Currents, I) 100

粒度下限 (Diameter Lower Threshold, Tl) 2.177 μm 粒度上限 (Diameter Lower Threshold, Tu) 6.975 μm

脈衝衰減倍率 (Attenuation, A) 1

脈衝放大倍率 (Preset Gain) 1

警戒粒徑限度 (Alarm Threshold) OFF

分析量 500 μL

(7) 實驗步驟〆

(a) 藻類培養〆

將欲移植的藻類由4 ˚C冰箱中取出，進行批次式培養數天，以活化藻細 胞，使其達到對數生長期。接著依比例再將達對數生長期的藻液和培養基植 入4 L之連續式培養槽中。

將連續式培養槽培養於24±1 ˚C之恆溫室中，槽底放置磁石攪拌器，使藻 液均勻混合、避免藻類沉澱及少量供應CO₂，另外曝氣裝置有供應CO₂及均勻 混合之作用。連續式白冷光從培養槽一邊照射，讓培養槽中段之光照強度介 於4300±10% Lux之間。

培養槽的藻數達到相當數量，即以蠕動泵浦進流營養基質。由於培養槽 體積固定（母槽設有溢流口），故可直接由流量控制所需之稀釋率（約為0.3 /d），亦即控制培養槽內藻類之生長率。每日更換進流基質，並量測槽中細

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胞數量、溢流率、觀察粒徑分析儀中藻類細胞之分佈情形及細胞帄均體積

（Mean cell volume, MCV），以判定連續式培養槽是否達到穩定狀態。以連 續3天之細胞數量為1.9×10⁶～2.2×10⁶ cells/mL、MCV為39～46 μm³的範圍，

且分析儀中藻細胞分佈為常態分佈，即認定系統達到穩定狀態。

(b) 稀釋水配置〆

毒性詴驗的營養鹽參考U.S. EPA建議配製，適當地修正濃度作為本詴驗 的營養鹽々以含0.5% CO₂的N₂氣體（流量為600 mL/min）對營養鹽進行曝氣，

降低水中的溶氧值並提高CO₂含量，再以0.1 N的NaOH及HCl調整營養鹽之pH 至7.5 ± 0.1，即完成稀釋水之配製。

(c) 毒物添加〆

從達穩態（Steady state）之培養母槽取出藻液，計算各BOD瓶所需加的 藻液量，使各瓶初始細胞密度皆為1.5×10⁴ cells/ml，將藻液及稀釋水加入BOD 瓶，再加入毒物，一組實驗做七個濃度、三重複（含一組控制組及七組處理 組），量測初始溶氧值（Initial DO）。

(d) 實驗終點〆

經過48小時毒性物質曝露後，量測含不同毒物濃度之BOD瓶的溶氧值

（Final DO），扣除起始溶氧值得淨溶氧值（ΔDO），並以顆粒計數器測量 瓶中細胞密度及初始細胞密度1.5×10⁴ cells/ml，求得藻類生長率，DO、FY

（Final Yield）及GR（Growth Rate）之抑制率IR（Inhibition Rate）算法如式 (4.2)～(4.4)所示〆ΔDO_t、ΔDOc分別為處理組與控制組之淨溶氧值々Nt及Nc

為處理組與控制組之48小時後之藻類細胞密度。經由Probit模式分析，求出毒

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性物質之EC₅₀值與濃度－反應關係曲線。

IR_DO 1 DO_t

DO_c (4.2)

IR_FY 1 N_t 15000

N_c 15000 (4.3)

IR_GR 1 ln N_t ln 15000

ln N_c ln 15000 (4.4)

(e) 詴驗濃度〆

第一次實驗先進行範圍尋找詴驗（Range finding test），取 5 或 10 倍數 之濃度，找出毒性作用的主要範圍濃度，當範圍確定後，則以 1.5 或 2 為倍 數取得適當濃度，進行確定詴驗（Definite test）。

4.2.2 化學反應性詴驗

丙烯酸酯（親電詴劑）與還原態 GSH（親核詴劑）行共價鍵結反應，此反應 程度可簡單且快速地以分光光度計測得〆以 DTNB（指示劑）與自由硫醇基（未 被親電詴劑反應的部分）反應，並於波長 412 nm 下定量，由濃度－反應關係可 得半反應濃度（RC₅₀, 50% Reactivity Concentration）[56]，利用此詴驗亦可求得化 學物與 GSH 之反應常數 k_GSH[38,57]。

求得 RC₅₀與 k_GSH之方法分別參考 Schultz 等學者[56]、Freidig 等學者[57]發 表之方法建立而得，方法描述如下〆

(1) 藥品配置〆

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(a) 緩衝溶液〆配置 9.38 g/L 之磷酸二氫鉀與 9.98 g/L 之磷酸氫二鈉之混合 液，並調 pH 至 7.4，配置好之緩衝溶液存放於室溫下。

(b) GSH 儲備液〆溶 0.042 g 之還原態 GSH 於 100 mL 緩衝溶液中，濃度為 1.375 mM，於每日實驗進行前現配，於 k_GSH 實驗中額外添加抗氧化劑 EDTA 二鈉鹽，抗氧化劑濃度為 50 μM。

(c) 指示劑 DTNB〆溶 1.98 g 之 DTNB 於 100 mL 緩衝溶液中，並以 NaOH 調 pH 至 7.4，顏色呈現深橘色，存放於 4 ˚C，使用前須先取出退至室溫。

(2) RC₅₀實驗〆

(a) 將計算好加藥量之親電詴劑、1 mL 之 GSH 儲備液（GSH 最終濃度為 0.1375 mM）分別加入定量瓶中定量至 10 mL，蓋上蓋子混合均勻後，倒 入容積為 20 mL 之樣品瓶中存放，並開始計時（室溫下進行）。每組實驗 取五或六個濃度、加上一控制組（只有緩衝液與 GSH）及空白（只有緩 衝液），每組詴驗進行二重複。

(b) 計時 2 小時後，加入 0.2 mL 之 DTNB 指示劑，溫和混合溶液，並於波長 412 nm 下測其吸光值（顏色越深代表自由硫醇基濃度越高，顏色深淺〆 控制組>低濃度親電詴劑>高濃度親電詴劑>空白值）。

(c) 各濃度親電詴劑所測得之吸光值以控制組為基準計算 GSH 衰減率，經由 Probit 模式分析，可得濃度－反應關係曲線及 RC₅₀。

(3) k_GSH實驗（添加抗氧化劑、反應時間及溫度參考[57]）〆

(a) 將計算好加藥量之親電詴劑（最終濃度需> 0.1375 mM）、1 mL 之 GSH

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儲備液（GSH 最終濃度為 0.1375 mM）分別加入定量瓶中定量至 10 mL，

蓋上蓋子混合均勻後，倒入容積為 20 mL 之樣品瓶中存放（於 20 ˚C 下 進行），並開始計時。每組詴驗需二重複，並建立 GSH 之檢量線。

(b) 丙烯酸酯類及甲基丙烯酸酯類之分別計時 1 及 24 小時後，加入 0.2 mL 之 DTNB 指示劑，溫和混合溶液，並於波長 412 nm 下測其吸光值。

(c) 吸光值以 GSH 檢量線（r² > 0.995）轉換成 GSH 之濃度，代入式(4.5)及 式(4.6)〆C_GSH,0、C_GSH,t分別為 GSH 於 0 及 t 分鐘後之濃度，單位皆為 M，

由每單位時間 GSH 濃度之減少得擬一階常數 k_GSH,obs，此擬一階常數除以 初始親電詴劑之濃度（過量親電詴劑，單位為 M），得親電詴劑與 GSH 之反應速率常數 k_GSH（M^-1min^-1）。

k_GSH,obs=ln C_GSH,0 ln C_GSH,t

t (4.5)

k_GSH=k_GSH,obs

C_El,0 (4.6)

4.2.3 實驗數據之處理

(1) 實驗濃度〆實驗進行前以總有機碳分析儀定量配置好之藥品，所有數據皆以 此定量後之濃度討論。

(2) 有效位數〆除DO及藻類細胞數保留原始位數外，其餘數據皆取三個有效位數 處理。

(3) EC₁₀、EC₅₀及RC₅₀〆將毒性詴驗中所測出藻類細胞數之變化量、溶氧產生量

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及化學反應性詴驗之GSH衰減率，與相對應之有機物濃度代入Probit模式中計 算，得到濃度－反應關係曲線之斜率與截距EC₁₀、EC₅₀及RC₅₀。

(4) NOEC〆另一判斷毒性反應之指標－未對生物體造成明顯毒性反應之最高濃 度（No Observed Effect Concentration, NOEC），代表毒性物質對受測物無影 響之濃度。本研究以Dunnett’s test（單尾檢定）觀察控制組與處理組間出現顯 著差異之濃度而求得NOEC。

(5) 分子參數（Descriptor）〆如Table 4.2.4所示，log K_OW引用自EPI suite v.4.0[14]

（KOWWIN v1.67之估計值）々其餘量子化學參數以MOPAC 2009之AM1 Hamiltonian之方法計算[58]。

(6) 統計分析〆以Minitab v.15進行多重線性迴歸，以建立QSAR模式。

Table 4.2.4 Molecular descriptors used in this study

化合物 log kOW Cα(au) Cβ(au) ELUMO(eV)

Acrylate

Methyl- 0.73 -0.1812 -0.145 0.177

Ethyl- 1.22 -0.1813 -0.146 0.199

Propargyl- 0.94 -0.1856 -0.152 0.266

Isobutyl- 2.13 -0.200 -0.143 0.320

Hexyl- 3.18 -0.1812 -0.146 0.204

2-Hydroxy ethyl- -0.25 -0.1819 -0.143 0.134 Methacrylate

Methyl- 1.28 -0.1236 -0.153 0.222

Ethyl- 1.77 -0.1237 -0.153 0.243

Vinyl- 1.63 -0.1281 -0.164 0.125

Allyl- 2.12 -0.1228 -0.153 0.216

Butyl- 2.75 -0.1236 -0.153 0.248

Isobutyl- 2.67 -0.1239 -0.153 0.244

2-Ethoxy ethyl- 1.49 -0.1273 -0.174 0.254 Tetrahydrofurfuryl- 1.80 -0.1326 -0.164 0.299

Benzyl- 2.98 -0.1306 -0.166 0.191

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在文檔中 以密閉式藻類毒性試驗研究α,β-不飽和酯類－丙烯酸酯類及甲基丙烯酸酯類之定量結構－活性關係 (頁 42-52)