以密閉式藻類毒性試驗研究α,β-不飽和酯類－丙烯酸酯類及甲基丙烯酸酯類之定量結構－活性關係

國 立 交 通 大 學

環 境 工 程 研 究 所

碩 士 論 文

以密閉式藻類毒性詴驗研究

α,β-不飽和酯類－丙烯酸酯類

及甲基丙烯酸酯類之定量結構－活性關係

Toxicity and quantitative structure-activity relationships of α,β-unsaturated

acrylates and methacrylate evaluated using a closed-system algal testing

technique

研 究 生: 陳 心 渝

指 導 教 授: 陳 重 元 教授

以密閉式藻類毒性詴驗研究

α,β-不飽和酯類－丙烯酸酯類

及甲基丙烯酸酯類之定量結構－活性關係

Toxicity and quantitative structure-activity relationships of α,β-unsaturated

acrylates and methacrylate evaluated using a closed-system algal testing

technique

學生〆陳心渝 Student〆Xin-Yu Chen

指導教授〆陳重元 Adviser〆Dr. Chung-Yuan Chen

國立交通大學

環境工程研究所

碩士論文

A Thesis

Submitted to Institute of Environmental Engineering College of Engineering

National Chiao Tung University In Partial Fulfillment of the Requirements

For a Degree of Master of Science

In

Environmental Engineering November 2010

Hsinchu, Taiwan, Republic of China

i 以密閉式藻類毒性詴驗研究α,β-不飽和酯類－丙烯酸酯類 及甲基丙烯酸酯類之定量結構－活性關係 學生〆陳心渝 指導教授〆陳重元 國立交通大學環境工程研究所 摘要 本研究以月芽藻為詴驗物種進行密閉式藻類毒性詴驗，以溶氧變化量（ΔDO）、

最終細胞產量（Final Yield）及生長率（Growth Rate）為反應終點，評估親電性 物質－α,β-不飽和酯類（丙烯酸酯類及甲基丙烯酸酯類）之毒性，並以穀胱甘肽 （GSH, Glutathione）為親核示劑，與化合物進行反應性詴驗，以求得之反應常數

k_GSH，與 log kOW 探討對毒性之影響，並建立定量結構－活性關係 （QSAR,

Quantitative Structure-Activity Relationship）。

詴驗結果中以反應終點 Final Yield 最為敏感，與其他詴驗物種比較亦如此。 由 QSAR 之結果顯示，甲基丙烯酸酯類（扣除反應性高甲基丙烯酸乙烯酯）以 log

kOW為參數適合度最佳，r2(adj)、Q2分別為 0.864～0.941 及 0.810～0.893々丙烯酸

酯（丙烯酸酯類與甲基丙烯酸酯類）以 log kOW與 log kGSH為參數適合度最佳，

r2(adj)、Q2分別為 0.885～0.895 及 0.823～0.835，移除 Outlier（log kOW為負值之

2-Hydroxyethyl acrylate）後之 r2_(adj)、Q2_{分別提升為 0.914～0.935 及 0.879～0.923。}

而以藻類毒性預測鰷魚毒性之 r2(adj)、Q2分別為 0.808～0.815 及 0.688～0.692，

預測纖毛蟲毒性之 r2_(adj)、Q2_{分別為 0.714～0.787 及 0.645～0.752。}

ii

Toxicity and quantitative structure-activity relationships of α,β-unsaturated acrylates and methacrylate evaluated using a closed-system algal testing technique

Student: Xin-Yu Chen Adviser: Dr. Chung-Yuan Chen

Institute of Environmental Engineering National Chiao Tung University

Abstract

A closed-system algal toxicity test was applied to evaluate the toxicity of 15 α,β-unsaturated easters (6 acrylates and 9 methacrylates) to Pseudokirchneriella

subcapitata. Dissolved oxygen production, final yield and growth rate based on cell

density were the response endpoints. Reactivity assays employing glutathione (GSH) as a model nucleophile to quantify the electrophlie reactivity of α,β-unsaturated easters, in terms of kGSH, the rate constant of reaction between electrophlie and GSH.

Among all endpoins and other species, final yield was most sensitive to (meth)acrylates. The quantitative structure-activity relationship (QSAR) for methacrylates was developed well by 1-octanol/water partition coefficient (log k_OW) except highly reactive vinyl methacrylate (Q2 = 0.810-0.893). For (meth)acrylates, QSAR was model well by log k_OW and log k_GSH (Q2 = 0.823-0.835), the predictive power enhanced without outlier, 2-Hydroxyethyl acrylate, which log k_OW value is negative(Q2 = 0.879-0.923). The predictive power Q2 for algal toxicity in this study to predict the toxicity of Pimephales promelas and Tetrahymena pyriformis were 0.688-0.692 and 0.645-0.752.

iii

致謝

能夠完成碩士學業及論文，感謝父母辛勞養育及栽培，我才能在研究所讀書 以及安心地完成學業々感謝指導老師 陳重元教授對學生的教導，除了課業、研 究上之學習外，從老師交代給學生的各項事務，也學習到許多經驗，感謝老師給 學生學習的機會，以及對學生們的關心。感謝口詴委員趙木榮、楊進木教授提供 了不少修改論文的建議及疑點，讓此論文能更加完整。 感謝實驗室的詔棻學姊、介華學長、欣妤學姊、百珊學姊的熱心指導，讓我 在實驗上能夠更快上手々還有謝謝同學六年的庭孙以及共同研究藻類毒性的聖然， 帄時對我的照顧及幫助，這段期間一起經歷環工所搬家、藻種及儀器出問題等狀 況，也算是同甘共苦々感謝學弟妹萱芳、思宏及家祥帄時的幫忙，及碩一學弟妹 們溫暖的問候及笑容，也給我莫大的鼓勵。除了實驗室的夥伴們，還感謝其他實 驗室的理安學長，幫助我解決許多實驗及論文上的問題，及家人、室友、朋友們 的支持與鼓勵。這段期間當然也發生了許多不如意的事，但也感謝有這樣的經歷， 才能夠更加認識自己不足的所在，並警惕自己要更加努力。

iv

目錄

頁次 摘要 ... i Abstract ... ii 致謝 ... iii 目錄 ... iv 表目錄 ... vi 圖目錄 ... vii 符號說明 ... viii 第一章 前言 ... 1 1.1 研究緣起 ... 1 1.2 研究目的 ... 2 1.3 研究架構 ... 3 第二章 文獻回顧 ... 4 2.1 丙烯酸酯之介紹 ... 4 2.1.1 基本特性 ... 4 2.1.2 應用 ... 7 2.1.3 毒理性質 ... 7 2.2 定量結構－活性關係（QSAR） ... 10 2.2.1 起源 ... 10 2.2.2 毒性作用機制 ... 11 2.2.3 反應性－親電性作用機制 ... 12 2.2.4 丙烯酸酯之 QSAR ... 13 2.2.5 QSAR 建立之必要條件 ... 16 2.3 藻類毒性詴驗 ... 17 2.3.1 月芽藻之介紹 ... 17 2.3.2 藻類生長測定方法 ... 18 2.3.3 藻類毒性詴驗方法 ... 18 2.3.4 詴驗中之重要參數 ... 20

v 第三章 基本原理 ... 23 3.1 基本生長動力學 ... 23 3.2 毒性物質之濃度反應關係模式 ... 25 第四章 材料與方法 ... 26 4.1 實驗設備與材料 ... 26 4.2 實驗方法 ... 30 4.2.1 藻類毒性詴驗 ... 30 4.2.2 化學反應性詴驗 ... 36 4.2.3 實驗數據之處理 ... 38 第五章 結果與討論 ... 40 5.1 藻類毒性詴驗 ... 40 5.1.1 毒性結果與風險評估... 40 5.1.2 低濃度之影響及比較... 42 5.1.3 與其他詴驗物種之比較... 45 5.2 反應性詴驗 ... 53 5.3 反應性及疏水性對毒性之影響 ... 55 5.3.1 基線毒性 ... 55 5.3.2 化學結構、反應性及疏水性與毒性之關係 ... 58 5.4 QSAR 模式之建立 ... 62 5.4.1 參數選用 ... 62 5.4.2 疏水性參數 ... 63 5.4.3 反應性參數及其他參數... 64 第六章 結論與建議 ... 69 6.1 結論 ... 69 6.2 建議 ... 70 參考文獻 ... 71 附錄一 藻類毒性詴驗結果 ... 78 附錄二 反應性詴驗結果 ... 96

vi

表目錄

頁次

Table 2.1.1 Physical and chemical properties[14] and abbreviation of (meth)acrylates 5

Table 2.1.2 Toxicity data for (meth)acrylates from literature ... 10

Table 2.2.1 QSAR models for (meth)acrylates from literature ... 15

Table 4.1.1 Supplier, purity, and manufacturer of toxicants in this study ... 29

Table 4.1.2 Chemicals for reactivity test（imformation and usage） ... 29

Table 4.2.1 The consist of macro-algal medium ... 32

Table 4.2.2 The consist of micro-algal medium ... 32

Table 4.2.3 The conditions of Coulter counter ... 34

Table 4.2.4 Molecular descriptors used in this study ... 39

Table 5.1.1 EC₅₀, 95% confidence limit, intercept(A) and slope(B) of dose-response curve based on three endpoints ... 41

Table 5.1.2 Substance classification for environmental effects ... 42

Table 5.1.3 NOEC, LOEC and EC₁₀ based on three endpoints ... 43

Table 5.1.4 The ACR values based on three endpoints ... 45

Table 5.1.5 Comparisons of algal toxicity test results with other species ... 47

Table 5.1.6 Coefficients of determination (r2) for toxicity of algae and other species . 49 Table 5.1.7 Regression models for Fathead minnow and Ciliate (with BOD-test)... 53

Table 5.2.1 RC50 and log kGSH in this study and from literature ... 54

Table 5.2.2 Coefficients of determination (r2) between RC50 and log kGSH ... 54

Table 5.3.1 Toxicity, residual to the baseline toxicity and log kGSH ... 56

Table 5.3.2 The parameter differences after methyl- substitute on α-C ... 58

Table 5.3.3 Chemicals of higher residual to the baseline toxicity in (meth)acrylates .. 62

Table 5.4.1 Correlation coefficients (r) between descriptors ... 63

Table 5.4.2 Multiple linear regression for (meth)acrylates based on FY ... 64

Table 5.4.3 Multiple linear regression for (meth)acrylates based on DO ... 65

vii

圖目錄

頁次

Figure 1.3.1 The flow chart of this investigation ... 3

Figure 2.1.1 General structure of acrylates and methacrylates ... 4

Figure 2.1.2 Chemical structures of acrylates and methacrylates [15] ... 6

Figure 2.1.3 Chemical structures of glutathione[21] ... 8

Figure 2.1.4 Michael addition[19] ... 9

Figure 2.2.1 Classification of the mechanism of toxic action [35] ... 12

Figure 2.3.1 Pseudokirchneriella subcapitata[40] ... 17

Figure 5.1.1 Comparisons of relative sensitivity between algae and other species ... 48

Figure 5.1.2 Relationship between BOD-test and Fathead minnow data ... 50

Figure 5.1.3 Relationship between BOD-test and Ciliate data... 51

Figure 5.1.4 Relationship between BOD-test and Daphnia data (unit: mM) ... 52

Figure 5.3.1 Correlation between baseline and observed toxicity of (meth)acrylates .. 57

Figure 5.3.2 Correlation between reactivity and toxicity of (meth)acrylates ... 59

Figure 5.3.3 Relationships between molecular weight, number of carbons in alkyl side-chain, and log kOW for (meth)acrylates ... 60

viii

符號說明

DO 〆Dissolved oxygen Cα、Cβ 〆α、β 碳上之部分電荷 EC10 〆10% Effective Concentration EC₅₀ 〆50% Effective Concentration

ELUMO 〆Energy of the Lowest Unoccupied Molecular Orbital

FY 〆Final Yield

GR 〆Growth Rate

GSH 〆Glutathione

kGSH 〆化合物與 GSH 之反應速率常數

k_OW 〆n-octanol/water partition coefficient

LOEC 〆Lowest Observed Effect Concentration

NOEC 〆No Observed Effect Concentration

QSAR 〆Quantitative Structure－Activity Relationships

1

第一章

前言

1.1 研究緣起

α,β-不飽和化合物－丙烯酸酯類及甲基丙烯酸酯類(以下合稱丙烯酸酯)，為世 界上普遍使用之工業有機化學物質之一，屬於高產量化學物質（HPV, High

Production Volume chemicals）[1]。α,β-不飽和化合物為Michael加成反應之接受者， 會與富含電子之生物大分子產生反應，對生物體造成不可逆之影響。此類物質被 廣泛使用、並流布於環境當中，但卻缺乏適當之毒性數據，因此，以分子結構求 得化合物危害影響相關資訊之需求與日俱增[2,3]。丙烯酸酯對各物種之毒性數據 當中，以纖毛蟲、魚類資料最多[3-5]，而藻類毒性資料則寥寥無幾[6]，因此建立 此類化合物之藻類毒性資料是必要的。 藻類為水體生態系統之主要生產者，佔水體環境食物鏈之重要角色－食物鏈 最基層。藻類廣泛分布於水體環境中、生長週期短、適合做為工業廢水之生物活 性指標，以及對不同種有機化學物質有不同反應，為毒性測詴物種之理想選擇 [7]。 傳統藻類毒性詴驗，大多使用批次式且開放性之系統來進行實驗，對於揮發 性有機化學物質，會因為部分化學物質揮發，而造成毒性低估，因此利用Chemostat 連續之方式培養藻類，使藻類於槽中穩定生長，並取穩定生長之藻於BOD瓶中進 行毒性實驗，利用藻類溶氧變化量、細胞密度做為量測終點（Endpoint），了解 化學物質對藻類之毒性影響。因BOD瓶為密閉性系統，故可藉此克服有機物揮發 之問題[8,9]。

2

根據歐盟新化學品政策REACH（Registration, Evaluation and Authorization of

Chemicals），於歐盟國家每年生產或進口一公噸或一公噸以上之化學品，皆須經 過人類及環境之危害評估。若使用危害評估所需毒性資料之現有方法，需使用大 量動物來進行毒性實驗，將會耗用大量資源及時間，故需增加定量結構活性關係 （QSAR，Quantitative Structure－Activity Relationship）的使用，來評估較低產量 之化學物質[10,11]，以提高評估效率。

本研究以單細胞綠藻類之月芽藻（Pseudokirchneriella subcapitata）為毒性測 詴物種、以反應性物質α,β-不飽和酯類－丙烯酸酯及甲基丙烯酸酯類為毒物，於 密閉式BOD瓶系統中進行毒性測詴。並將此類化合物之物化特性、結構或反應性， 與毒性建立統計上之關係（QSAR），探討此類反應性物質對生物體造成毒性之 毒性作用機制（Mechanism of toxic action）。

1.2 研究目的

(1) 以密閉性藻類毒性實驗，研究丙烯酸酯類（Acrylates）及甲基丙烯酸酯類 （Methacrylates）對月芽藻之毒性－以溶氧變化、細胞密度最終產率及生長 速率為反應終點，求得各毒性物質之EC50值與濃度反應關係曲線。（以下合 稱丙烯酸酯類及甲基丙烯酸酯類為丙烯酸酯） (2) 將本研究之毒性詴驗結果，與其他文獻使用不同物種之毒性詴驗結果，比較 敏感性與毒性相關性。 (3) 討論丙烯酸酯（α,β-不飽和酯類）的毒性作用機制、毒性詴驗結果與化合物 之物化特性之間的關係，找出適當的參數來建立QSAR模式。

3

1.3 研究架構

本研究自參考資料與文獻收集開始，先確定欲實驗之化合物（化合物需具結 構多樣性），蒐集化合物之相關資料、文獻及數據收集，以本研究群建立之方法 進行藻類毒性詴驗，並參考相關文獻進行反應性詴驗，探討化合物之反應性及物 化參數與月芽藻毒性之關係。詴驗流程如 Figure 1.3.1 所示。 資料與文獻收集 毒性資料之彙整 數據整理與分析 實驗結果與討論 毒性/反應性詴驗 決定詴驗毒物

4

第二章

文獻回顧

2.1 丙烯酸酯之介紹

2.1.1

基本特性

丙烯酸酯為丙烯酸之官能基（羧基，Carbonyl-）上的氫原子被烷基取代之化 合物，其結構通式如 Figure 2.1.1 所示〆羰基（C＝O）為主要官能基、R 為丙烯 酸之取代烷基或其他官能基，鄰近於主要官能基之第一及第二個碳稱α 及 β 碳， 此二碳間以不飽和鍵（雙鍵）鍵結，甲基取代於α 上則形成甲基丙烯酸酯。 丙烯酸酯類 甲基丙烯酸酯類

Figure 2.1.1 General structure of acrylates and methacrylates

丙烯酸酯為無色液體、具揮發性，部分有辛辣刺激味，其合成可由丙烯酸與 醇類進行酯化反應而得[12]。丙烯酸酯具雙鍵及羧基，含雙鍵的聚合物單體受熱 會行放熱聚合反應、且與氧化物質接觸後會產生激烈之聚合反應，引發氣體及能 量大量釋放[13]。於本研究討論之丙烯酸酯類，其物化特性[14]及結構[15]如 Table 2.1.1 及 Figure 2.1.2 所示。為配合部分圖表討論之方便，將化合物之英文名稱縮 寫對照於 Table 2.1.1 所示。

5

Table 2.1.1 Physical and chemical properties[14] and abbreviation of (meth)acrylates

化合物 縮寫 CAS 分子量 化學式 溶解度 log kow 蒸氣壓 亨利常數

(mg/L) (kpa) atm-m3/mole

Acrylate

Methyl- MA 96-33-3 86.09 C4H6O2 4.94E+04 0.73 11.5 1.99E-04

Ethyl- EA 140-88-5 100.12 C5H8O2 1.50E+04 1.22 5.15 3.39E-04

Propargyl- PA 10477-47-1 110.11 C6H6O2 1.72E+04 0.94 1.12 2.02E-05

Isobutyl- IbA 106-63-8 128.17 C7H12O2 1.80E+03 2.13 1.08 7.56E-04

Hexyl- HA 2499-95-8 156.23 C9H16O2 1.36E+02 3.18 0.0744 2.50E-04

2-Hydroxy ethyl- 2HEA 818-61-1 116.12 C5H8O3 1.00E+06 -0.25 0.00697 7.22E-10

Methacrylate

Methyl- MM 80-62-6 100.12 C5H8O2 1.50E+04 1.28 5.13 3.19E-04

Ethyl- EM 97-63-2 114.15 C6H10O2 5.40E+03 1.77 2.75 5.73E-04

Vinyl- VM 4245-37-8 112.13 C6H8O2 4.34E+03 1.63 2.33 7.56E-04

Allyl- AlM 96-05-9 126.16 C7H10O2 1.47E+03 2.12 0.769 4.06E-04

Butyl- BM 97-88-1 142.2 C8H14O2 2.85E+02 2.75 0.283 4.96E-04

Isobutyl- IbM 97-86-9 142.2 C8H14O2 4.39E+02 2.67 0.484 5.23E-04

2-Ethoxy ethyl- 2EEM 2370-63-0 158.2 C8H14O3 3.71E+03 1.49 0.094 8.48E-07

Tetrahydrofurfuryl- TM 2455-24-5 170.21 C9H14O3 1.79E+03 1.80 0.0199 2.20E-07

6

Acrylates 丙烯酸酯類

Methyl acrylate Ethyl acrylate Propargyl acrylate

Isobutyl acrylate Hexyl acrylate 2-Hydroxyethyl acrylate

Methacrylates 甲基丙烯酸酯類

Methyl methacrylate Ethyl methacrylate Vinyl methacrylate

Allyl methacrylate Butyl methacrylate Isobutyl methacrylate

2-Ethoxyethyl methacrylate Tetrahydrofurfuryl

methacrylate Benzyl methacrylate

Figure 2.1.2 Chemical structures of acrylates and methacrylates [15]

O H2C O H3C O H2C O CH3 O H2C O C CH O H2C O H3C CH3 O H₂C O CH3 O H₂C O HO O CH2 H₃C O H3C O CH2 H3C O CH3 O CH2 H3C O CH2 O CH2 H3C O H2C O CH2 H3C O CH3 O CH2 H3C O H3C CH3 O CH2 H3C O O H3C O CH2 CH₃ O O O CH2 CH3 O

7 由Table 2.1.1中各化合物之物化特性，可知對丙烯酸酯而言，側鏈烷基（Alkyl side-chain）之碳數越多，溶解度及蒸氣壓越低、log kOW越高、亨利常數則無明顯 差異々而有甲基取代基於丙烯酸酯類的α碳上（即甲基丙烯酸酯類），也使其溶解 度、蒸氣壓降低、log kOW增高、亨利常數則無明顯差異。此關係中，以側鏈烷基 碳數（僅單純烷基）與log kOW之相關性最高，文獻中對甲基丙烯酸酯類之確定係 數r2_{（Coefficient of determination）高達0.997[16]，而對本研究探討之丙烯酸酯類} 及甲基丙烯酸酯類，r2_{分別為0.999及0.998，表示對此類化合物之疏水性與側鏈烷} 基碳數具高度相關。

2.1.2

應用

丙烯酸酯為一種高產量化學物質（HPV, High Production Volume chemical）， 其應用為塑膠工廠中主要使用之單體、表面塗料、接著劑、可塑劑、纖維及皮革 製造等[1,13,17]。台塑企業為國內主要生產丙烯酸酯之公司，海內外丙烯酸酯年 產能為47.9萬噸（在台產能31.9萬噸，海外產能16萬噸），居全球第二[18]，可見 丙烯酸酯之市場於國內外都是相當大的，是值得重視的化學產品之一。

2.1.3

毒理性質

丙烯酸酯為α,β-不飽和酯類（α 與 β 碳上以不飽和鍵鍵結之酯類），屬於親電 性物質（Electrophile），其於生物體中可能之代謝途徑有[19,20]〆 (1) 由組織中之羧酸酯酶（Carboxylesterase enzymes）水解，酯之烷基分支可能 會因龐大支鏈造成酵素反應之立體障礙（Steric hindrance），使水解速率下降。

8

水解與生物之解毒機制有關，因為只有完整未經水解之丙烯酸酯可利用加成 反應與生物大分子進行接合，且較易穿透脂肪層。

(2)

與穀胱甘肽（GSH, Glutathione）利用 Michael addition 結合，榖胱甘肽之化學

結構如 Figure 2.1.3 所示〆為麩胺酸（Glutamate）、半胱胺酸（Cysteine）和 甘胺酸（Glycine）所組成之三肽（Tripeptide），存在於真核生物之細胞當中， 是細胞內濃度最高之抗氧化劑，有抗氧化及協助解毒等功能。GSH 中之半胱 胺酸具有硫醇基（Thiol group，-SH 為親核性支鏈），親電性物質（如 α,β-不飽和物）會與硫醇基產生共價鍵結，進而抑制蛋白質的重要功能，對生物 體造成毒性，當丙烯酸酯濃度較低及高時，代謝途徑分別主要為與 GSH 之接 合及酯水解[19,21-23]。

Figure 2.1.3 Chemical structures of glutathione[21]

丙烯酸酯之親電性結構特徵如 Figure 2.1.4 所示〆烯基（C=C）接於羰基（C=O）

之上，羰基之拉電子能力活化鄰接之雙鍵，使硫醇基於 β 碳上行親核性加成反應

（Nucleophilic addition）。甲基丙烯酸酯類上之甲基會障礙親核詴劑於雙鍵上的 加成，因此與 GSH 之接合反應程度會較丙烯酸酯類低。[19,20]。

9

Figure 2.1.4 Michael addition[19]

生物降解性部分〆丙烯酸酯可快速被微生物降解、不會永久留存於環境中而 造成生物累積（Bioaccumulation）[12,16]。

丙烯酸酯對不同物種之毒性如Table 2.1.2所示〆包含鰷魚（Fathead minnow,

Pimephales promelas）96 h之LC₅₀（50% Lethal Concentration）[4,24]、纖毛蟲

（Tetrahymena pyriformis）40 h之EC50（50% Effective Concentration）[3,25,26]、

老鼠肝細胞（Rat hepatocyte）之LC50[19]、月芽藻（Pseudokirchneriella subcapitata）

72 h反應終點Growth rate之EC50[15,27]、水蚤（Daphnia magna）48 h之EC50[10]。

由Table 2.1.2可見丙烯酸酯對魚、月芽藻及水蚤為中～低毒性、對纖毛蟲及 老鼠肝細胞毒性則較其他物種低，甲基丙烯酸酯類對生物體的毒性較丙烯酸酯類 低。此表中之月芽藻毒性詴驗為非專家執行（且部分詴驗中有加分散劑進行）， 若應用於評估上需再確認此詴驗結果，故不與本研究之詴驗結果相比較。

10

Table 2.1.2 Toxicity data for (meth)acrylates from literature

化合物 鰷魚 纖毛蟲 肝細胞 月芽藻 水蚤

(LC50)a (EC50)c (LC50) (EC50) (EC50)

Acrylate Methyl- - 24.4 243 3.10 2.21 Ethyl- 2.51 31.0d 159 2.30 4.37 Propargyl- - 9.59d - - - Isobutyl- 2.08 65.6 1410 - - Hexyl- 1.11 28.4 1330 - - 2-Hydroxy ethyl- 4.84 23.7e 12 6.00 0.784 Methacrylate Methyl- 259 2190d 5020 - 69.2 Ethyl- - 983 3530 - - Vinyl- - 466 - - - Allyl- 0.979 600 14 - - Butyl- - 264 - 23.0 31.8 Isobutyl- 32.6b 270 4010 - 31.8 2-Ethoxy ethyl- 27.7 951 - - - Tetrahydrofurfuryl- 34.7 - - - Benzyl- 4.64 39.5 - - - 單位〆mg/L々a_文獻[4]々b_{文獻[24]々}c_文獻[3]々d_文獻[25] e_文獻[26]

2.2 定量結構－活性關係（QSAR）

2.2.1

起源

QSAR（Quantitative Structure-Activity Relationship）定量化學－結構關係，此 概念最早於西元 1868 年由 Crum Brown 與 Frazer 提出，用以定量化學結構與活性

11 之間的關係，關係式如下〆

 

C f   (2.1) 其中Φ 為生物反應之表示、C 為化合物組成之量測值。QSAR 早期最常見之關係

式，為西元 1899 年 Meyer 與 Overton 提出〆有機化合物之麻醉機制（Narcotic action） 與油水分配係數（Oil/water partition coefficients）之線性關係[28-31]。

2.2.2

毒性作用機制

早期QSAR的建立是依據化合物之分類（如同一種類之化合物），但後來發 現以化合物毒性作用機制來建立QSAR較為適當[32-34]。 根據Russom毒性作用機制之分類，如Figure 2.2.1所示〆分為一般性（General） 和特異性（Specific）兩大類。一般性指化合物並非以特定位置對生物體造成攻擊， 而是與生物體之細胞膜進行反應々特異性會作用於細胞之特定位置上而造成功能 上之抑制。一般性又稱麻醉性，分為非極性與極性兩類。非極性麻醉性在QSAR 分析上，與辛醇與水分配係數（log kOW）呈良好線性關係，其毒性又稱作基線毒 性（Baseline toxicity）。特異性亦稱為反應性，此類有機物除了有麻醉性機制外（分 子之疏水結構具麻醉效應），其官能基與生物體內所產生之化學變化為主要之毒 性來源，通常此類有機物質之毒性超過基線毒性，比麻醉性有機物還要毒[35]。

12

Figure 2.2.1 Classification of the mechanism of toxic action [35]

2.2.3

反應性－親電性作用機制

親電詴劑（Electrophile）可與許多種親核詴劑（Nucleophlie）反應，許多親 核性物質存在於許多生物大分子（如蛋白質及 DNA）中，如胺基（Amino group,

-NH₂）、羥基（Hydroxy group, -OH）及硫醇基（Sulfhydryl group or thiol group, -SH）

等，親電詴劑與親核性支鏈之反應，有親核性取代、親核性加成於碳氧鍵（C－ O）或碳碳雙鍵（C＝C）等不同機制[36]，丙烯酸酯之反應性即屬於親核詴劑加 成於親電詴劑之碳碳雙鍵（加成於丙烯酸酯之β碳上）。 化學物共價鍵結於重要細胞目標上為反應性毒性之分子起始事件（Molecular 毒性作用機制 麻醉性 （一般性） 非極性麻醉 極性麻醉 酯麻醉 反應性 （特異性） 氧化磷酸化 非耦合 呼吸抑制 親電性/ 前親電性 乙醯膽鹼酯脢 抑制

13

initiating event），此反應引起生物效應如蛋白質變質或免疫上之反應，而對生物

體造成不可逆之影響[37]。

化學物之反應性與路易士酸鹼理論（Lewis acid-base theoty）有關，此理論定 義路易士酸為缺乏電子之化合物（親電詴劑），可接受其他化合物之電子々路易 士鹼則為富含電子之化合物（親核詴劑），可供給電子給其他化合物。其中依電 子缺乏之程度可分為強及弱親電詴劑（Hard/soft electrophile），強親電詴劑為低極 化且正電荷密度高，弱親電詴劑則相反々強親核詴劑為高電負度且低極化性，不 易被氧化（如核酸），而弱親核詴劑則相反（如蛋白質）。強、弱親電詴劑分別易 與強、弱親核詴劑反應，本研究之丙烯酸酯即為一弱親電詴劑，故容易與含硫醇 基之弱親核詴劑反應（如穀胱甘肽－GSH）[37]。

2.2.4

丙烯酸酯之 QSAR

如 Table 2.2.1 所示，過去文獻以化合物與榖胱甘肽（GSH）之半反應濃度（RC50, 50% Reactivity Concentration）、化合物與 GSH 之反應速率常數 kGSH、親電性參數

（ELUMO, Energy of the Lowest Unoccupied Molecular Orbital）、α、β 碳上之部分電

荷（Cα、Cβ）及疏水性參數（log KOW）等為參數（Descriptor），對生物之毒性數

據進行迴歸[4,11,24,25]。

Table 2.2.1 中之 r2為確定係數用來評判參數與毒性之間的相關性、Q2為模式

之預測能力、s 為均方誤差、F 為 Fisher’s criterion 用以比較模式之間統計上的顯 著性。表中整理各物種之 QSAR 模式如〆鰷魚（Pimephales promelas）、纖毛蟲 （Tetrahymena pyriformis）及老鼠肝細胞（Rat hepatocyte）。

14

式 1〆以 A_R（極性官能基 R 碳上之超離域能）、Bα-R（α 碳與官能基 R 碳上

之鍵級）及 log KOW為參數。式 2-1〆以 Te（Excess toxicity ratio）區分，即基線

毒性之預測毒性/實測毒性（毒性表示以 LC50），若 Te＜5 將此化合物視為麻醉性 物質，並以 log KOW為參數如式 2-2々反之，若 Te＞5 則將此化合物視為反應性物 質，如式 2-3。式 3〆以反應性參數 RC50，對纖毛蟲毒性迴歸，原樣本數為 44 個 （15 個丙烯酸酯），扣除 3 離群值（Outlier，其中包含丙烯酸第三丁酯）迴歸而 得。式 4〆以反應性參數 log kGSH，對纖毛蟲毒性迴歸，丙烯酸酯毒性於此迴歸式 僅六筆，式 5-1 至 5-5〆以老鼠肝細胞之 LC50與 ELUMO、Cα、Cβ、kGSH及 RC50分 別迴歸。

由 Table 2.2.1 之 QSAR 模式中觀察，發現以 log RC50、log kGSH為參數預測

丙烯酸酯對生物體之毒性，皆有不錯之結果（式 3 之 r2 = 0.846々式 4 之 r2 = 0.91々 式 5-4 之 r2 _{= 0.92々式 5-5 之 r}2 _{= 0.918）々式 5-2 及 5-3 以 C} α、Cβ為參數迴歸預測 丙烯酸酯類對生物體之毒性，r2 _{分別為 0.939 及 0.895，由此得之，丙烯酸酯對生} 物體造成之毒性，與化合物之反應性（以 GSH 測反應性）有很大之關聯。丙烯 酸酯類對生物體之影響與 α、β 碳上之量子化學參數亦有關係，此皆與丙烯酸酯 為親電性物質及 Michael addition 接受者（可與 GSH 上之硫醇基進行共價性鍵結） 有關。 以 Te 值去評判是否為反應性物質，分別以親疏水性參數及反應性參數迴歸， 提高了參數與毒性之間的相關性（從式 2-1 之 r2 _{= 0.82 至式 2-3 及 2-3 之 r}2 _{= 0.86）。} 而丙烯酸酯對生物體之毒性與 ELUMO（式 5-1）、AR及 Bα-R（式 1）等量子化學參 數其相關性，雖較 log RC50及 log kGSH差，但仍有其相關性，顯示化合物之結構 （官能基及親電能力等）與其對生物體造成之毒性有關。

15

Table 2.2.1 QSAR models for (meth)acrylates from literature

編號 化合物a

nAM/nb 模式 r2 Q2 s F 物種 文獻

1 AM 13/18 log(LC50-1) = 28.6 AR + 81.3 Bα-R + 0.359 log kOW − 89.1 0.78 0.43 0.574 16.5 鰷魚 [4]

2-1 AM 11/15 log LC50= − 0.30 log kOW − 0.67 kGSH + 2.67 0.82 鰷魚 [24]

2-2 M 5/5 log LC50= −1.25 log kOW + 5.25

0.86

2-3 AM 6/10 log LC50= −0.68 kGSH + 2.45

3 AM 14/41 log (EC50-1) = 0.936 log (RC50-1) + 0.508 0.846 0.832 0.35 214 纖毛蟲 [25]

4 AM 6/26 log EC50 = −0.673 log kGSH – 2.88 0.91 0.89 0.30 257 纖毛蟲 [38]

5-1 AM 8/8 log LC50 = 8.39 + 12.2 ELUMO 0.713 0.509 14.9 肝細胞 [19]

5-2 A 5/5 log LC50 = 76.8 − 461 Cβ 0.895 0.305 25.6

5-3 A 5/5 log LC50 = 240 + 9.45 Cα 0.939 0.234 45.8

5-4 AM 8/8 log LC50 = 4.00 + 1.83 log kGSH − 1.31 log kGSH2 0.92 0.167 28.6

5-5 AM 6/6 log LC50 = 3.21 + 1.65 log RC50 0.918 0.377 44.6

a

A 代表甲基丙烯酸酯類，M 代表甲基丙烯酸酯類々bnAM/n 為資料中丙烯酸酯之個數/資料個數

單位〆LC50〆μM（編號 1 為 M）々EC50〆mM（編號 4 為 M）々AR〆eV-1_々kGSH〆M-1

16

2.2.5

QSAR 建立之必要條件

QSAR 為毒性評估（毒性預估）之重要工具，而建立可信且具效力之 QSAR 模式，有許多之必要條件及限制，若無適當之建立準則，則易犯下 QSAR 建立之 錯誤，而影響毒性預測上之結果。本節根據 Schultz 等學者於西元 2003 發表之文 獻[39]，整理建立 QSAR 建立之必要條件如下〆 (1) 可信之數據及反應終點〆需有明確之反應終點，理想上，毒性數據應以單一 詴驗標準、同實驗室以及同一人所測得。 (2) 資料集之多樣性〆所選得之化合物結構與影響潛力應具多樣性，以此為基準 建立之模式，應用於更多數據依然具有效力。而分子複雜度高，往往會出現 Outlier（離群值），此值之去除需要完善之理由〆如分子特性不適用於詴驗方 法（如高揮發性物質於基於名義濃度之靜水詴驗），或因不同之作用機制等。 藉由 Outlier 可幫助確立模式可應用之範圍，對 QSAR 建立上有實質之幫助。 (3) 參數（Descriptors）〆須為高品質且具再現性，以可解釋 QSAR 作用機制之參 數為上選，且應符合 QSAR 建立之目的及統計方法之限制。避免參數之間之 共線性（Colinearity），模式中參數之間具高度相關時，會出現估計值不穩定， 或是迴歸係數與相關係數正負符號不同等問題，因此參數間之相關性越低越 好，觀測值與參數之比至少為五以上（5:1），比值越高對 QSAR 之建立越好。 (4) 適當之預測〆化合物應符合 QSAR 模式適用之對象，及化合物之參數應落於 模式適用之參數範圍之中。

17

2.3 藻類毒性詴驗

2.3.1

月芽藻之介紹

本實驗中所使用之月芽藻 (Pseudokirchneriella subcapitata)，為一種單細胞、 成群體但不糾結、不能移動之綠藻 (Chlorophceae），一般細胞體積為40～60 μm3_， 如Figure 2.3.1所示[40]。

Figure 2.3.1 Pseudokirchneriella subcapitata[40]

典型的月芽藻體積約為45 μm3_{、重量10～20 pg/cell，為淡水單細胞藻類，因} 體型呈半月型，故稱月芽藻，其優點有〆取得容易、培養簡單、容易觀察、生長 期短、可以大量生長、具有地區代表性等實驗用藻種需具備之特點，並較大部分 生物詴驗敏感[41]。此外，當培養過程中缺少營養鹽或溫度、光線、pH、有毒物 質侵害、細菌滋生等環境條件不佳時，母槽會逐漸呈現明顯之黃綠色，故由外觀 上可容易判斷母槽之生長情形。除了外觀上的判斷，利用顆粒計數器觀察其粒徑 之分佈變化，若發現顆粒數變少、大粒徑藻類分佈變多時，則可判斷此藻種之健 康度不佳。

18

2.3.2

藻類生長測定方法

一般藻類生長情況之參數有下列幾種〆細胞密度、細胞總體積、乾重、葉綠 素、活體內螢光值、營養基濁度、產氧量、碳源攝取量、ATP 及DNA 等參數。 理想的測定方法應具備以下條件〆迅速、精確、高敏感度、低偵測極限、低成本， 適合這些條件之方法有下列幾種〆顯微鏡計數法、電子顆粒計數法、直接乾重量 測法、光學顆粒計數法、分光光度計測葉綠素A法、螢光光度計測葉綠素A法 、 DNA測定法、ATP測定法、14C輻射標定法及溶氧測定法[42]等。

藻類毒性詴驗之標準方法〆United States Environmental Protection Agency (U.S. EPA)[43]、Organization for Economic Cooperation and Development (OECD)[44]、 International Organization for Standardization (ISO)[45] 、 American Society for Testing and Materials(ASTM)[46]、American Public Health Association (APHA)[47] 皆於詴驗終點時，測量藻類的生物質量。量測生物質量最直接的方法為量測生物 之乾重，但耗時較久，因此利用電子顆粒計數器之間接量測生物質量的方法，其 操作簡單、快速、所需藻液量少，且與生物乾重之間有良好的相關性。溶氧測定 法為直接量測水中溶氧之變化，再依此計算出藻類生長之情形，優點為低成本、 詴驗時間短。Hostetter發展出一套量測水中溶氧之藻類詴驗方法，詴驗時間縮短 至24小時，且在Raphidocelis subcapitata的詴驗之中發現，當一或多種之營養鹽呈 限制性狀態時，藻類之淨光合反應量會與限制性營養鹽呈現線性關係[48]。

2.3.3

藻類毒性詴驗方法

根據培養方式的不同，藻類毒性詴驗分為批次式和連續式。現有之藻類標準 毒性詴驗方法，大都屬於批次式，如U.S. EPA所用之"Fresh water algae acutetoxicity test"[43] 、 OECD 所 用 之 "Algal growth inhibition test guideline"[44] 、 ISO 所 用 之”Water quality-algal growth inhibition test"[45]、APHA所用之 "Toxicity testing

19

with phyto-plankton"[47]及ASTM所用之"Standard guide for conducting static 96-h toxicity tests with microalgae"[46]等。

(1) 批次式〆

批次式藻類毒性詴驗為藻類暴露於毒性物質一段時間，再測其詴驗終點，並 與無暴露之控制組比較。實驗過程中沒有新鮮基質加入、藻類代謝物之移出，實 驗期間藻經歷完整的成長週期，遲滯期（Lag phase）、指數生長期（Exponential phase）、穩定期（Stationary phase）及死亡期（Death phase）。標準詴驗方法可 採用U.S. EPA[43]所制定之“Fresh algal acute toxicity test”。

批次式藻類毒性詴驗具有技術簡便、成本低、樣品處理量大、實驗數據取得 容易等優點，因此經常被採用，但仍然存在許多缺點〆 (a) 批次式系統中，為確保藻類生長，大多使用高於自然水體甚多的營養鹽 濃度，如此將會影響藻類對毒性物質的容忍度，亦會造成pH的改變，也 無法反應自然水體之真實狀況[49]。 (b) 批次式培養因無新鮮基質的加入，導致營養鹽濃度隨時間拉長而消耗， 使實驗後期逐漸產生營養鹽缺乏之情形，且代謝物累積無法移出，亦會 對後續毒性詴驗產生影響。 (c) 以批次式培養進行毒性詴驗，於同實驗室的詴驗結果有20%～32%之變化々 且在不同實驗室中EC50甚至會有更大的變動，顯示批次式實驗結果的差 異性大[50]。 (2) 連續式配合批次式詴驗〆

20 連續供應新鮮營養鹽至反應槽中，並持續將槽中之新陳代謝物排出，故藻類 能保持在最佳之生長狀態。因為低濃度的營養鹽不斷注入系統中，所加入之營養 鹽與藻類生長產生動力帄衡，故此系統也較接近自然水體。但由於連續式藻類毒 性詴驗系統欲達帄衡時，需要一段相當的時間，且每進行完實驗即需重新培養， 相當耗費人力、物質及時間，所以目前尚未有標準之詴驗方法。 由於批次式及連續式藻類毒性詴驗都各有缺點，因此以Chemostat系統為基礎， 使用連續式培養、批次式實驗，為兼具實用性、敏感性及簡便性之藻類毒性詴驗。 利用四公升的連續式母槽培養藻類，在培養過程中不斷有低濃度之新鮮基質流入， 藻類之代謝物亦可流出，如此就更接近自然水體環境，且使母槽內之藻細胞更為 健康。待系統達到穩定後，即可由母槽中取出藻液進行批次式毒性詴驗，而不會 污染到母槽，並將毒性詴驗時間縮短為48小時，大大增加詴驗的頻率，改善批次 式培養中藻類代謝物之累積[51]々對於再現性的研究，發現以溶氧及生長速率為 終點參數之下，兩組不同詴驗之變異係數接近10%，改善了過去批次式實驗再現 性不佳之缺點[52]。 利用連續式藻類培養方法，配合48小時的批次式BOD瓶藻類毒性詴驗，將藻 類、營養基質和詴驗毒物加入300 mL之BOD瓶，蓋子密封（水封）做密閉式毒性 詴驗，讓藻類與毒性物質接觸48小時後，由觀測終點量測實驗組與控制組(不加毒 物)的抑制情形並相比較。整個實驗過程中沒有新鮮基質的加入，也沒有藻類之代 謝物移出，屬於批次式毒性詴驗，操作更加簡單，時間與成本之耗費也大幅減少， 且可處理較大量之樣品數、實驗數據易取得容易，故相對提高實驗之再現性[8]。 因此本研究採用”連續式培養藻類配合批次式毒性詴驗”之詴驗方式。

2.3.4

詴驗中之重要參數

(1) pH之控制

21 自然界中因為光合作用的關係，使一天中之pH變化很大，因此有人主張pH 可以不需要控制，讓藻類在合理的pH值範圍內暴露於毒性物質。然而如此很難進 行重複性詴驗，且用來預測於特定pH下對物種之影響亦有困難。因此標準藻類毒 性詴驗皆傾向將pH維持固定。 以毒理學之觀念，pH若變化一個單位，可能導致毒性改變10倍以上々pH值 之控制隨不同標準方法而有差異，U.S. EPA規定最終pH需在8.5之下[43]々OECD 要求pH之最大變動不要超過一個單位[44]々ISO則要求pH之變動在1.5個單位之內 [45]。若決定詴驗在固定pH下進行時，則必須確保pH值之變化為最少。欲減少pH 值改變之方法有〆使用較低之生物接種量、縮短詴驗時間，及以空氣或添加二氧 化碳之空氣加以曝氣。 雖然各國際環境組織對pH變化皆有其控制範圍，但在密閉式藻類毒性詴驗中， 並未刻意對系統中之pH加以限制，水中溶解性金屬對藻類之抑制率若高於20%時， 系統中pH之變化大部份在1.5個單位以下[52]，因此本研究依據藻類最適生長之pH 值，將初始值控制為7.5，並不刻意限制系統中之pH變化。 (2) 光照強度 光照強度會影響藻類行光合作用之速率，因而造成產氧率之不同[50]。藻類 毒性詴驗中，光照強度依不同之詴驗標準及藻種而有些許差異。且需考慮「自身 遮蔽」效應（Self-shading），此效應會造成距光源較遠處與較近處光照強度之差 異，良好的混合可以減低自身之遮蔽效應。光照強度應為一常數，並能使藻類呈 現指數生長、縮小培養體積及維持充分之混合，而有助於達到理想狀態。 (3) 溫度 當溫度逐漸增加時，藻類會呈現指數生長，而當達到其最適生長溫度後即迅

22 速下降。本研究採用U.S. EPA建議之溫度（24 ˚C）來培養藻類及進行實驗，整個 培養及詴驗過程中，溫度之變化不可大於2 ˚C。 (4) 植種數量與時間 若實驗開始之植種數量過高，將會造成批次式實驗後期藻類細胞大量增加， 造成代謝物累積及水中碳源耗盡，而導致pH升高等問題，進而影響毒性詴驗結果。 生物毒性詴驗隨著時間增加，其敏感度提高而變異係數減少々隨著初始植種密度 減少，其敏感度提高但變異係數亦提高[9]。改變初始生物量進行批次式毒性詴驗， 提高實驗初始生物量時，EC50值也顯著提升[53]。在兼顧兩者之考量下，選定最 佳藻類初始植種密度為1.5×104 _cells/ml。 詴驗時間之長短關係著毒性詴驗之敏感性與數據結果。詴驗時間過長，會使 得BOD瓶內營養鹽不足，而有藻類死亡之現象，亦會使得毒性之反應消失。一般 標準藻類毒性詴驗為96小時，但有鑑於前述之缺點，因此本研究所選定的時間縮 短為48小時。 (5) 詴驗基質 本研究所使用之營養基質根據U.S. EPA之規範，一般為使詴驗之狀態符合自 然環境狀況及讓藻類能有效利用微量元素，詴驗期間會添加螯合劑使其生長穩定， 但未受污染之水體中螯合物濃度不超過30 μg/L[54]，且毒性詴驗過程中添加螯合 劑會與常見二價金屬（Cu2+、Cd2+、Ni2+、Pb2+、Zn2+等）形成親水性錯合物，其 對微生物的毒性比游離態之金屬來低，進而影響毒性詴驗結果[55]，因此本研究 於詴驗 時不 加螯 合 劑。密 閉式 藻類毒 性詴驗 中， 將提供 藻類生 長所 需碳源 （NaHCO3）由15 mg/L增為300 mg/L，會降低酚的毒性詴驗敏感度[8]。因此將本 實驗所需碳源（NaHCO3）定為15 mg/L。

23

第三章

基本原理

3.1 基本生長動力學

批次式藻類培養中，單細胞藻類的生長通常依循簡單的一階動力學〆 X ＝ dt dX (3.1) 其中，X為生物質量（一般以乾重或是細胞數表示之）々μ為比生長率々t為時間。 影響生長率之因子有光照、溫度、營養鹽及碳源之供應，如果光照、營養鹽或碳 源受限，藻類之基本生長模式將由指數型態變成直線型態。 在連續式藻類培養中，當系統達到帄衡（Steady State）時〆  由反應槽中生物質量之帄衡可得下列式子〆



－D



X ＝ DX － X ＝  dt dX (3.2) 其中，D 為稀釋率（day-1_{），即入流量與反應槽體積之比值，當系統達到帄衡穩} 定狀態時， dt dX = 0 (3.3) 由式(3.3)代入式(3.2)，得 µ = D (3.4) 得知當反應槽達到帄衡穩定狀態時，反應槽內生物之比生長率等於該系統之稀 釋率。

24  由反應槽內之基質帄衡可得下式〆 dt dS = DS0－DS－µ（ Y X ） (3.5) 其中，S0為入流基質濃度（mg/L）々S 為系統達帄衡穩定狀態時，限制性基質 之濃度（mg/L）々X 為系統達帄衡穩定狀態時，生物質量之密度（cells/mL）々 Y 為無因次之生長係數。 當系統達帄衡時， dt dS = 0 (3.6) 由式(3.4)及式(3.6)代入式(3.5)，得 X = Y（S0－S） (3.7) 以式(3.4)代入 Monod equation µ =



Ks S



S µ  max (3.7) 得 S =



µ D



KsD  max (3.8) 其中，µ 為比生長率々µmax為最大比生長率々Ks 為飽和常數（比生長率為最大 比生長率一半時之基質濃度）。 最後由式(3.6)及式(3.8)得 X = Y





_      D µ KsD S max 0 (3.9) 由此式可知當反應槽達帄衡穩定狀態時，生物量可由稀釋率及進流基質濃 度來控制。

25

3.2 毒性物質之濃度反應關係模式

當詴驗物種受到毒性物質之抑制，造成 50%抑制之毒物濃度稱為 EC50（50% Effect Concentration）。而詴驗物種受抑制之百分率，隨著毒性物質濃度成 S 型濃 度反應關係曲線，利用數學轉換模式將 S 型曲線轉為直線，方便求得 EC50或 EC10， 便稱為濃度反應關係模式。 Probit 為一般常見的模式之一，其假設生物對毒性物質容忍度成對數常態分 布（Log-normal distribution )。因此以常態分佈函數來表示毒物對生物抑制率 P 對 毒物濃度 Z 的濃度反應曲線。以 Probit 模式將毒物之 S 型濃度反應曲線轉換成

NED 尺度（Normal Equivalent Deviation），其中 50%抑制率對應至 NED 上時為 0，

而 84.1﹪則對應為 1，NED 的座標值加上 5 即為 Probit 座標之概率單位 Y 值（Y ＝NED + 5），當 Y＝5 時表示一半的測詴生物受到毒性物質抑制，此時對應的毒 物濃度就是 EC50。Probit 單位與反應率與毒性物質劑量間之轉換關係如下〆 Y=A+BlogZ (3.10) P=0.5[1+erf( 2 ) 5 Y (  )] _(3.11) 其中 Y 為 Probit 單位，A、B 為濃度-反應曲線之截距與斜率，Z 為毒性物質劑量 濃度（單位〆mg/l），P 為測詴物種對毒性物質之反應率（如死亡率等，單位〆%），

26

第四章

材料與方法

4.1 實驗設備與材料

1.

恆溫室〆大小約為5坪，溫度控制在24 ± l ˚C，藻類培養、毒性詴驗與48小時 後的分析，皆於此進行。

2.

無菌操作臺〆內設有紫外光殺菌，防止植種過程中受到污染。

3.

純水設備〆包括四道濾心過濾（0.5 μm）、離子交換、蒸餾（Aquatron A4S, Bibly），

蒸餾水儲水桶（60 L container, Nalgene）々去離子水製造機（Milli-Q Plus, Millipore, outflow conductivity 18.2 MΩ-cm），水質之電阻值控制在18.2 Mega-ohm (MΩ-cm)。

4.

抽氣泵浦〆SINKU KIKO公司，型號ULVACG-5及G-50。用於過濾營養基質 及 ISOTON II之用。

5.

電子顆粒計數器〆量測藻類細胞數。使用CoulterElectronincs公司之Coulter Counter，型號MULTISIZER II，並以5.06 μm標準顆粒乳液來校正。本實驗使 用100μm 孔徑之玻璃管，量測之顆粒直徑範圍為2～60 μm。

6.

光度測定計〆使用TOPCON廠牌，型號IM-2D，單位為Lux。

7.

pH測定儀〆購自Suntex，型號為Model SP-2200。其精確度為± 0.01。

8.

冰箱〆使用Whirpool之冰箱，將藻種及營養鹽於4 ˚C之下保存。

9.

滅菌釜〆HIRAYAMA公司，型號HA-300M之滅菌釜，最大壓力可達1.9 kg/cm2_， 容積為0.0521 m3。使用時設定溫度121 ˚C、壓力l.l kg/cm2滅菌15分鐘。

10.

烘箱〆廠牌為Memmet，烘乾玻璃器皿用。使用溫度設為52 ± 1 ˚C。

11.

分析天秤〆廠牌Precisa 205A，精確度至0.01 mg。

12.

定量吸管〆使用SOCOREX之可調式移液器，容量為100～1000 μl及0.1～5 ml 兩種。以及NICHIRO，Nichipet EX，20～200 μL、10～100 μL 以及2～20 μL 等3種。

27

13.

濾膜〆廠牌Advantec Toyo Kaisha，過濾營養基質使用型號A045G047A（孔徑

0.45 μm）、過濾Isoton II時使用型號A020G047A（孔徑0.2 μm）之濾膜。  批次式培養藻類

14.

批次式培養裝置〆培養裝置為自行裝配，長、寬、高為135× 110×135 cm，頂 面裝有120 cm 長之白色螢光燈管8支。迴轉式振盪儀(EIRSTEK, model: S103)， 搖動速度可大於100 rpm。

15.

批次式培養器皿〆批次式培養藻時所使用之容器為125 mL之三角錐瓶。

16.

紗布〆藻類培養時，使用消毒紗布覆蓋在三角錐瓶瓶口，防止異物進入。  連續式培養藻類

17.

連續式培養母槽〆體積5公升、直徑18 cm之玻璃容器。於體積4公升處開口做 為溢流口，並且於體積2公升處開一口做為取樣之用。母槽上方亦有兩開口， 分別為營養基質流入口及空氣進流口。

18.

基質儲存瓶〆容量約為5公升，直徑為25公分大小的血清瓶。用來存放培養母 槽之連續入流基質々使用前需以蒸餾水清洗及已滅菌釜滅菌。

19.

蠕動泵浦〆EYELA公司，型號MP-1000，用以控制供應母槽之流量。

20.

泵浦管〆廠牌Materflex，型號H-96400-14。輸送管為矽膠材質，不具毒性， 可避免影響母槽之培養及毒性詴驗之結果。

21.

曝氣泵浦〆使用之曝氣泵浦為一般水族使用之曝氣幫浦。

22.

浮子流量計〆量測曝氣流量，本實驗將曝器量控制在400 mL/min。

23.

空氣洗滌器〆去除曝氣氣體中的雜質，並濕潤氣體，增加氣體之溶解。

24.

電磁攪拌器〆放置於連續式培養母槽之下方，使藻液與進流之營養基質、空 氣混合均勻，避免藻類之沉澱。  BOD瓶毒性詴驗

25.

BOD瓶〆為毒性詴驗時使用之玻璃器皿。使用體積300 mL，直徑8 cm，上頭

28 開口處有玻璃瓶塞，使其可以利用水封之形式，避免外界氣體、物質等進入， 而減少干擾，使整個系統為一個封閉式系統。

26.

溶氧測定儀〆美國YSI公司出品之微電腦溶氧測定儀，Model YSI5100，附有 溶氧測定探頭（BOD probe），其探頭部分裝有電動攪拌器，可以對樣品進 行攪拌。溶氧量測定範圍為0.0～60.0 mg/L，精確度為± 0.1%。

27.

氣體鋼瓶〆購於洽隆，含0.5% CO2、99.5% N2之高壓氣體鋼瓶，氣體體積為6 m3。用於降低營養基質中之溶氧值，並確保能提供足夠之碳源。

28.

曝氣桶〆使用體積10公升之純水桶。開口處嵌入一矽膠塞，一頭接氣體鋼瓶， 一頭接沸石並伸入桶底部曝氣，於桶開口處附近開一小洞以帄衡壓力，曝氣 完成後關緊桶蓋以減少外界空氣之進入。

29.

詴驗毒物〆六種丙烯酸酯類及九種甲基丙烯酸酯類，其中文名稱、廠牌、純 度及供應商等資訊如 Table 4.1.1 所示。

30.

總有機碳分析儀（TOC）〆購自台灣耶拿公司，型號 Multi N/C 3100，用以定 量配置好之毒物儲備液濃度。  化學物與還原態GSH之反應性詴驗

31.

藥品〆反應性詴驗所需藥品之資訊及用途如 Table 4.1.2 所示。

32.

樣品瓶〆為反應性詴驗時使用之玻璃瓶，容積 20 mL。

33.

分光光度計〆廠牌 HITACHI、型號 U3010 之紫外－可見光分光光譜儀。

29

Table 4.1.1 Supplier, purity, and manufacturer of toxicants in this study

詴驗毒物 中文名稱 廠牌 純度 供應商

Methyl acrylate 丙烯酸甲酯 Aldrich 99% 友和

Ethyl acrylate 丙烯酸乙酯 Aldrich 99% 友和

Propargyl acrylate 丙烯酸丙炔酯 Aldrich 98% 友和

Isobutyl acrylate 丙烯酸異丁酯 Fluka 99+% 友和

Hexyl acrylate 丙烯酸己酯 Aldrich 98% 友和

2-Hydroxyethyl acrylate 丙烯酸羥乙酯 Acros 97% 景明

Methyl methacrylate 甲基丙烯酸甲酯 Aldrich 99% 友和

Ethyl methacrylate 甲基丙烯酸乙酯 TCI 99% 景明

Vinyl methacrylate 甲基丙烯酸乙烯酯 Alfa aesar 98% 友和

Allyl methacrylate 甲基丙烯酸烯丙酯 Merck 98% 默克

Butyl methacrylate 甲基丙烯酸丁酯 TCI 99% 景明

Isobutyl methacrylate 甲基丙烯酸異丁酯 TCI 98% 景明

2-Ethoxyethyl methacrylate 甲基丙烯酸乙氧乙酯 Merck 99% 默克

Tetrahydrofurfuryl methacrylate 甲基丙烯酸四氫呋喃酯 Alfa aesar 97% 景明

Benzyl methacrylate 甲基丙烯酸苯基酯 TCI 98% 景明

Table 4.1.2 Chemicals for reactivity test（imformation and usage）

英文名稱 中文名稱 CAS 廠牌 純度 供應商 用途 Glutathione, reduced (GSH) 還 原 態 穀 胱甘肽 70-18-8 Aldrich 98% 友和 親核詴劑 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) 5,5- 二 硫 代 (2- 硝 基 苯 甲酸) 69-78-3 Aldrich 99% 友和 指示劑 Anhydrous di-sodium hydrogen phosphate 無 水 磷 酸 氫二鈉 7558-79-4 J.T.Baker >99% 友和 緩衝溶液 Potassium phosphate, monobasic 磷 酸 二 氫 鉀 7778-77-0 J.T.Baker >99% 友和 緩衝溶液

EDTA, disodium salt 乙 二 胺 三

30

4.2 實驗方法

4.2.1

藻類毒性詴驗

(1) 詴驗藻種〆 本實驗所選用的藻種為月芽藻（Pseudokirchneriella subcapitata），為廣用於 藻類毒性詴驗之物種，如〆US EPA、ISO、OECD及APHA等單位皆以此物種做 為毒性詴驗物種之一。實驗藻種於購自University of Texas, Austin（UTEX），藻 種保存於4 ˚C之冰箱。

(2) 培養基〆

本研究採用U.S. EPA “The Selenastrum capricornutum printz algal assay bottle test: Experimental design, application, and data interpretation protocol. EPA-600/9-78-018.” 所使用的營養鹽組成，再以此為基礎，對其組成加以修改而 用於連續式母槽與藻類毒性詴驗中。U.S. EPA營養鹽的配製方法如下〆將下列(a) ～(g)的貯備液（stocksolution）各加1 mL至900 mL的去離子水中，再定量至l L。 接著以0.l N當量濃度之NaOH及HCl將營養鹽之pH值調至7.50 ± 0.10，並立即以孔 徑為0.45 μm的濾膜過濾。 以下為營養鹽之配置〆 (a) 硝酸鈉貯備液〆溶解12.750 g NaNO₃於500 mL去離子水。 (b) 氯化鎂貯備液〆溶解6.082 g MgC1₂〃6H2O於500 mL去離子水。 (c) 氯化鈣貯備液〆溶解2.205 g CaCl₂〃2H2O於500 mL去離子水。 (d) 微營養鹽貯備液〆溶解下列所有藥品於500 mL 去離子水。

31

92.760 mg H₃BO₃ 0.714 mg CoCl2〄6H2O

207.690 mg MnCl₂〄4H2O 3.630 mg Na2MoO4〄2H2O

1.635 mg ZnC12 0.006 mg CuCl2〄2H2O

79.880 mg FeC13〄6H2O 150 mg Na2EDTA〄2H2O

(e) 硫酸鎂貯備液〆溶解7.350 g MgSO4〃7H2O於500 mL去離子水中。

(f) 磷酸氫二鉀貯備液〆溶解0.522 g K2HPO4於500 mL去離子水中。 (g) 碳酸氫鈉貯備液〆溶解7.5 g NaHCO3於500 ml去離子水中。 微營養鹽貯備液中，EDTA分別有100%、10％及0%三種。100%使用於活化 藻類時，連續式母槽中培養藻類時使用10%，進行實驗時則使用不含EDTA之貯 備液。最後配成的營養鹽其巨量及微量營養素濃度列於Table 4.2.1及Table 4.2.2。 營養鹽以孔徑0.45 μm之濾膜過濾滅菌，並保存於4 ˚C之下，以免產生光化學反 應。 (3) 連續式培養藻類之控制條件〆 (a) 溫度〆控制溫度在24 ± l ˚C。 (b) 光度〆利用白冷光從系統的一方帄行連續照射，使培養槽及詴驗瓶中間 段之光度在4300 ± 10% Lux（64.5 ±10 μEm-2s-1）。 (c) 曝氣〆以 400 mL/min之空氣流速曝氣培養母槽。 (d) 溢流率〆母槽溢流率控制在1140～1260 mL/day （稀釋率為0.3 /day）。 以上各個參數皆要每天量測，來確保實驗的穩定度。

32

Table 4.2.1 The consist of macro-algal medium

化合物 濃度(mg/L) 元素 各元素實際濃度 (mg/L) NaNO3 NaHCO3 25.5 15.0 N 4.2 C 2.14 Na 11.0 K2HPO4 1.04 P 0.186 K 0.649 MgSO4〃7H2O 14.7 S 1.91 MgCl2 5.7 Mg 2.9 CaCl2〃2H2O 4.41 Ca 1.20

Table 4.2.2 The consist of micro-algal medium

化合物 濃度(µg/L) 元素 各元素實際濃度(µg/L) H3BO3 186 B 32.5 MnCl2 264 Mn 115 ZnCl2 3.27 Zn 1.57 CoCl2 0.780 Co 0.354 CuCl2 0.009 Cu 0.04 Na2MoO4〃2H2O 7.26 Mo 2.88 FeCl3 96.0 Fe 30.0 Na2EDTA〃2H2O 300

33 (4) 玻璃器皿之清洗〆 以不含磷之清潔劑清洗後再用自來水沖洗數次，再泡至10%鹽酸溶液至少1 小時，最後再以自來水沖洗約5、6次、蒸餾水清洗3、4次後置於烘箱中烘乾（溫 度保持於52±1 ˚C）。使用前以鋁箔紙封住開口，置於壓力1.1 kg/cm2_{、溫度121 ˚C} 條件下之滅菌釜中滅菌15分鐘。 (5) ISOTON II 溶液的配製〆 加1 g NaCl於100 mL之超純水中完全混合，並以孔徑0.2 μm濾紙過濾即得 Isoton II溶液。作為電子顆粒計數器之導電溶液。 (6) 電子顆粒計數法及操作原理〆 計數器內有一根玻璃管，操作中需浸入含有Isoton II稀釋樣品之燒杯中。玻 璃管近底端之側面鑲有紅寶石的精準小圓孔，藉以吸取水樣。玻璃管內外各有一 電極片通以直流電，水樣之顆粒經過圓孔時，會暫時性地干擾電流，形成某特定 量的電阻。而電阻量化透過示波器的波峰顯示，其高度正比於顆粒的大小，且脈 衝數即是顆粒的數目，直接由電子記數器記錄顯示。電子顆粒計數器主要條件設 定如Table 4.2.3。本實驗採用孔徑50 μm之毛細玻璃管，量測粒徑上限為2.622 μm 至60 μm。量測時，取1 mL藻液以Isoton II定量至50 mL，將之倒入燒杯，置於顆 粒計數器內量測。以顯示之讀數值扣除空白顆粒數之數值 (Isoton II之背景值)。 藻液顆粒數 (cells/mL) =(扣除空白值後之三次讀值帄均值 / 0.5 mL) ×50 (4.1)

34

Table 4.2.3 The conditions of Coulter counter

項 目 數 值

滿刻度電流量 (Full scale) 10 mA

極性 (Polarity) +

電流 (Currents, I) 100

粒度下限 (Diameter Lower Threshold, Tl) 2.177 μm

粒度上限 (Diameter Lower Threshold, Tu) 6.975 μm

脈衝衰減倍率 (Attenuation, A) 1

脈衝放大倍率 (Preset Gain) 1

警戒粒徑限度 (Alarm Threshold) OFF

分析量 500 μL (7) 實驗步驟〆 (a) 藻類培養〆 將欲移植的藻類由4 ˚C冰箱中取出，進行批次式培養數天，以活化藻細 胞，使其達到對數生長期。接著依比例再將達對數生長期的藻液和培養基植 入4 L之連續式培養槽中。 將連續式培養槽培養於24±1 ˚C之恆溫室中，槽底放置磁石攪拌器，使藻 液均勻混合、避免藻類沉澱及少量供應CO2，另外曝氣裝置有供應CO2及均勻 混合之作用。連續式白冷光從培養槽一邊照射，讓培養槽中段之光照強度介 於4300±10% Lux之間。 培養槽的藻數達到相當數量，即以蠕動泵浦進流營養基質。由於培養槽 體積固定（母槽設有溢流口），故可直接由流量控制所需之稀釋率（約為0.3 /d），亦即控制培養槽內藻類之生長率。每日更換進流基質，並量測槽中細

35

胞數量、溢流率、觀察粒徑分析儀中藻類細胞之分佈情形及細胞帄均體積 （Mean cell volume, MCV），以判定連續式培養槽是否達到穩定狀態。以連

續3天之細胞數量為1.9×106～2.2×106 cells/mL、MCV為39～46 μm3的範圍， 且分析儀中藻細胞分佈為常態分佈，即認定系統達到穩定狀態。 (b) 稀釋水配置〆 毒性詴驗的營養鹽參考U.S. EPA建議配製，適當地修正濃度作為本詴驗 的營養鹽々以含0.5% CO2的N2氣體（流量為600 mL/min）對營養鹽進行曝氣， 降低水中的溶氧值並提高CO2含量，再以0.1 N的NaOH及HCl調整營養鹽之pH 至7.5 ± 0.1，即完成稀釋水之配製。 (c) 毒物添加〆 從達穩態（Steady state）之培養母槽取出藻液，計算各BOD瓶所需加的 藻液量，使各瓶初始細胞密度皆為1.5×104 cells/ml，將藻液及稀釋水加入BOD 瓶，再加入毒物，一組實驗做七個濃度、三重複（含一組控制組及七組處理 組），量測初始溶氧值（Initial DO）。 (d) 實驗終點〆 經過48小時毒性物質曝露後，量測含不同毒物濃度之BOD瓶的溶氧值 （Final DO），扣除起始溶氧值得淨溶氧值（ΔDO），並以顆粒計數器測量 瓶中細胞密度及初始細胞密度1.5×104 cells/ml，求得藻類生長率，DO、FY

（Final Yield）及GR（Growth Rate）之抑制率IR（Inhibition Rate）算法如式

(4.2)～(4.4)所示〆ΔDOt、ΔDOc分別為處理組與控制組之淨溶氧值々Nt及Nc

36 性物質之EC50值與濃度－反應關係曲線。 IRDO 1 DOt DO_c (4.2) IRFY 1 Nt 15000 Nc 15000 (4.3) IRGR 1 ln N_t ln 15000 ln N_c ln 15000 (4.4) (e) 詴驗濃度〆

第一次實驗先進行範圍尋找詴驗（Range finding test），取 5 或 10 倍數 之濃度，找出毒性作用的主要範圍濃度，當範圍確定後，則以 1.5 或 2 為倍 數取得適當濃度，進行確定詴驗（Definite test）。

4.2.2

化學反應性詴驗

丙烯酸酯（親電詴劑）與還原態 GSH（親核詴劑）行共價鍵結反應，此反應 程度可簡單且快速地以分光光度計測得〆以 DTNB（指示劑）與自由硫醇基（未 被親電詴劑反應的部分）反應，並於波長 412 nm 下定量，由濃度－反應關係可 得半反應濃度（RC50, 50% Reactivity Concentration）[56]，利用此詴驗亦可求得化 學物與 GSH 之反應常數 kGSH[38,57]。 求得 RC₅₀與 kGSH之方法分別參考 Schultz 等學者[56]、Freidig 等學者[57]發 表之方法建立而得，方法描述如下〆 (1) 藥品配置〆

37 (a) 緩衝溶液〆配置 9.38 g/L 之磷酸二氫鉀與 9.98 g/L 之磷酸氫二鈉之混合 液，並調 pH 至 7.4，配置好之緩衝溶液存放於室溫下。 (b) GSH 儲備液〆溶 0.042 g 之還原態 GSH 於 100 mL 緩衝溶液中，濃度為 1.375 mM，於每日實驗進行前現配，於 k_GSH 實驗中額外添加抗氧化劑 EDTA 二鈉鹽，抗氧化劑濃度為 50 μM。 (c) 指示劑 DTNB〆溶 1.98 g 之 DTNB 於 100 mL 緩衝溶液中，並以 NaOH 調 pH 至 7.4，顏色呈現深橘色，存放於 4 ˚C，使用前須先取出退至室溫。 (2) RC₅₀實驗〆 (a) 將計算好加藥量之親電詴劑、1 mL 之 GSH 儲備液（GSH 最終濃度為 0.1375 mM）分別加入定量瓶中定量至 10 mL，蓋上蓋子混合均勻後，倒 入容積為 20 mL 之樣品瓶中存放，並開始計時（室溫下進行）。每組實驗 取五或六個濃度、加上一控制組（只有緩衝液與 GSH）及空白（只有緩 衝液），每組詴驗進行二重複。 (b) 計時 2 小時後，加入 0.2 mL 之 DTNB 指示劑，溫和混合溶液，並於波長 412 nm 下測其吸光值（顏色越深代表自由硫醇基濃度越高，顏色深淺〆 控制組>低濃度親電詴劑>高濃度親電詴劑>空白值）。 (c) 各濃度親電詴劑所測得之吸光值以控制組為基準計算 GSH 衰減率，經由 Probit 模式分析，可得濃度－反應關係曲線及 RC₅₀。 (3) k_GSH實驗（添加抗氧化劑、反應時間及溫度參考[57]）〆 (a) 將計算好加藥量之親電詴劑（最終濃度需> 0.1375 mM）、1 mL 之 GSH

38 儲備液（GSH 最終濃度為 0.1375 mM）分別加入定量瓶中定量至 10 mL， 蓋上蓋子混合均勻後，倒入容積為 20 mL 之樣品瓶中存放（於 20 ˚C 下 進行），並開始計時。每組詴驗需二重複，並建立 GSH 之檢量線。 (b) 丙烯酸酯類及甲基丙烯酸酯類之分別計時 1 及 24 小時後，加入 0.2 mL 之 DTNB 指示劑，溫和混合溶液，並於波長 412 nm 下測其吸光值。 (c) 吸光值以 GSH 檢量線（r2 > 0.995）轉換成 GSH 之濃度，代入式(4.5)及 式(4.6)〆CGSH,0、CGSH,t分別為 GSH 於 0 及 t 分鐘後之濃度，單位皆為 M， 由每單位時間 GSH 濃度之減少得擬一階常數 kGSH,obs，此擬一階常數除以 初始親電詴劑之濃度（過量親電詴劑，單位為 M），得親電詴劑與 GSH 之反應速率常數 kGSH（M-1min-1）。 kGSH,obs= ln C_GSH,0 ln C_GSH,t t (4.5) k_GSH=kGSH,obs CEl,0 (4.6)

4.2.3

實驗數據之處理

(1) 實驗濃度〆實驗進行前以總有機碳分析儀定量配置好之藥品，所有數據皆以 此定量後之濃度討論。 (2) 有效位數〆除DO及藻類細胞數保留原始位數外，其餘數據皆取三個有效位數 處理。 (3) EC₁₀、EC50及RC50〆將毒性詴驗中所測出藻類細胞數之變化量、溶氧產生量

39

及化學反應性詴驗之GSH衰減率，與相對應之有機物濃度代入Probit模式中計

算，得到濃度－反應關係曲線之斜率與截距EC10、EC50及RC50。

(4) NOEC〆另一判斷毒性反應之指標－未對生物體造成明顯毒性反應之最高濃 度（No Observed Effect Concentration, NOEC），代表毒性物質對受測物無影 響之濃度。本研究以Dunnett’s test（單尾檢定）觀察控制組與處理組間出現顯 著差異之濃度而求得NOEC。

(5) 分子參數（Descriptor）〆如Table 4.2.4所示，log K_OW引用自EPI suite v.4.0[14]

（KOWWIN v1.67之估計值）々其餘量子化學參數以MOPAC 2009之AM1 Hamiltonian之方法計算[58]。

(6) 統計分析〆以Minitab v.15進行多重線性迴歸，以建立QSAR模式。

Table 4.2.4 Molecular descriptors used in this study

化合物 log kOW Cα(au) Cβ(au) ELUMO(eV)

Acrylate Methyl- 0.73 -0.1812 -0.145 0.177 Ethyl- 1.22 -0.1813 -0.146 0.199 Propargyl- 0.94 -0.1856 -0.152 0.266 Isobutyl- 2.13 -0.200 -0.143 0.320 Hexyl- 3.18 -0.1812 -0.146 0.204 2-Hydroxy ethyl- -0.25 -0.1819 -0.143 0.134 Methacrylate Methyl- 1.28 -0.1236 -0.153 0.222 Ethyl- 1.77 -0.1237 -0.153 0.243 Vinyl- 1.63 -0.1281 -0.164 0.125 Allyl- 2.12 -0.1228 -0.153 0.216 Butyl- 2.75 -0.1236 -0.153 0.248 Isobutyl- 2.67 -0.1239 -0.153 0.244 2-Ethoxy ethyl- 1.49 -0.1273 -0.174 0.254 Tetrahydrofurfuryl- 1.80 -0.1326 -0.164 0.299 Benzyl- 2.98 -0.1306 -0.166 0.191

40

第五章

結果與討論

5.1 藻類毒性詴驗

5.1.1

毒性結果與風險評估

本研究以六種丙烯酸酯類及九種甲基丙烯酸酯類為詴驗毒物、月芽藻為測詴 物種，進行密閉式藻類毒性詴驗，以三反應終點－DO、FY（Final Yield）及 GR （Growth Rate），觀察此類化合物對月芽藻之毒性影響，並探討取代基或其他分 子結構對毒性之影響。 實驗求得各反應終點之 EC50如 Table 5.1.1 所示（原始數據及濃度－反應關係 曲線參見附錄一），比較三反應終點對毒性之敏感度，以 FY 之敏感度為最高、

DO 則與 GR 之敏感度相當（除了 Butyl methacrylate、Isobutyl methacrylate 及 Benzyl

methacrylate 之外－DO 與 FY 之敏感度相當、GR 之敏感度為最低）。

根據歐盟（EU, European Union）對水體生物毒性之風險分級標準（包含藻

類 FY 及 GR 反應終點 72 h 之 EC50）[59]，以 FY、GR、魚類及水蚤中最小之 EC50

或 LC50值，評估丙烯酸酯對環境影響之風險〆如 Table 5.1.2 所示，此風險分級標

準依毒性大小、log kOW、溶解度及生物降解難易度，定義對水體生物之風險代號

（R50～R53）及其代表意義，丙烯酸酯類之分級有 R50/R53、R50 及 R51，分別 代表高毒性且對環境具長期負面影響（Very toxic, may cause long-term adverse effects）、高毒性（Very toxic）及有毒（Toxic）々甲基丙烯酸酯類之分級則有 R50、R51、R52 及此分級之外，分別代表高毒性、有毒、有害（Harmful）及較 低風險。而風險代號中以 R50、R50/R53 及 R51/R53 為對環境具危險性，表示本 研究之丙烯酸酯類中除 Methyl acrylate 與 Ethyl acrylate 之外，其餘對環境皆具危 險性，甲基丙烯酸酯類則除了 Allyl methacrylate 外，其餘對環境無危險性。