第二章 : 材料與方法
第二節、 實驗方法
壹、細胞株培養 (附錄六)
(參照「高銘欽教授實驗室細胞培養標準操作程序」, 編撰者:李宜臻) 一、解凍細胞
二、繼代培養及分盤 三、凍存細胞
貳、細胞株生長曲線
1. 將細胞用 1X TE 自細胞培養盤打下，加 9 ml 細胞培養液均勻打散，置於 15 ml 離心管中。
2. 取出 1ml 細胞懸浮液放入已有 9 ml DPBS 的 15 ml 離心管中(10 倍稀釋)，準 備計算細胞數目，其餘 9 ml 細胞懸浮液以 1000 rpm 離心 5 分鐘。
3. 自 10 倍稀釋的細胞懸浮液取出 1 ml，加入已有 19 ml Isoton 的小杯中(10×20 ＝200 倍稀釋)，用 Coulter Counter 計算細胞數。
4. 於 96 孔盤中分別種入 1×10
4
，3×104
，1×105
cells/well 三種細胞濃度，各 24 wells(8 天×3 重複＝24 well)5. 將 96 孔盤置於恆溫培養箱中培養。
6. 第二天(day 1)，先用顯微鏡觀察細胞生長狀況，用 1 ml 1X TE 將三種細胞濃 度各打下 3 個 well，均勻打散後分別置於 9 個微量離心管(eppendorf)
7. 將 96 孔盤放回恆溫培養箱中培養。
8. 自各 eppendorf 取細胞懸浮液 1 ml，分別加入已有 19 ml Isoton 的小杯中(20 倍稀釋)，用 Coulter Counter 計算細胞數，並紀錄之。
9. 第三天(day 2)的相同時間點，重複 day 1 的實驗操作至 day 8。
10. 整理 day 1~day 8 的數據，繪製細胞株生長曲線。
參、松杉靈芝甲醇萃取 (如圖三)
1. 秤取 2g 松杉靈芝粉末於 500 ml 錐形瓶，加入無水甲醇 200 ml，Parafilm 密封 瓶口。
2. 室溫下震盪(約 160~200 rpm) 24 小時。
3. 抽氣過濾 2 次，將靈芝粉末不溶的顆粒濾除，保留澄清濾液。
4. 利用減壓濃縮的原理使濾液之溶媒蒸發，最終得到硬膠狀或塊狀的靈芝甲醇 萃取物。
5. 精秤所得的靈芝甲醇萃取物，每 100 mg 萃取物以 1 ml 無水甲醇回溶之。
6. 回溶的靈芝甲醇萃取物通過 0.22 μm 濾膜，分裝於 eppendorf，-30°C 儲藏。
(stock: 100 mg/ml)
肆、創傷癒合實驗(Wound closure assay) 1. 於 24 孔盤中種入 3×10
5
cells/well(全滿)。2. 第二天，抽掉細胞培養液，改用只含 0.1% FBS 的細胞培養液。
3. 第三天，配製含不同濃度靈芝甲醇萃取物的細胞培養液(0.1% FBS)
4. 顯微鏡觀察 24 孔盤細胞生長情況，確定細胞生長及形態正常，抽掉細胞培養 液(留下少許 medium 在 well 中)
5. 用 tip 在每個 well 底部畫出一條中分直線(wound)，並在 24 孔盤底部做記號(作 為每次顯微鏡觀察位置的基準)
6. 用 DPBS 將每個 well 輕輕沖洗一次之後吸去
7. 加入含不同濃度靈芝甲醇萃取物的細胞培養液(0.1% FBS)，將 24 孔盤放回恆 溫培養箱中培養。
8. 於不同時間點用顯微鏡觀察各 well 細胞創傷(wound)癒合的情形，並照相。
9. 根據相片來分析不同濃度的靈芝甲醇萃取物對於細胞株創傷癒合的影響。
伍、靈芝萃取物對細胞株半數抑制濃度(IC
50
)的測量(CCK-8 assay)1. 將 96 孔盤劃分為 4 區(附錄七)，第一列及第八列為 blank，只有 medium，
不種細胞，其餘每 well 種入 3×10
3
cells/90 μl medium。2. 第二天，於各 well 中加入 10 μl 不同濃度之靈芝萃取物以及靈芝萃取物溶媒(作 為對照組)。(總體積 100 μl)
3. 72 小時後(第四天)，於各 well 中加入 10 μl CCK-8，將 96 孔盤放回恆溫培養箱。
4. 2 小時後將 96 孔盤取出，用 ELISA reader 測吸光値。(最大吸光波長：450 nm) 5. 經過換算得到細胞生長抑制百分比，以及靈芝萃取物對細胞株之半數抑制濃 度(IC
50
)。陸、細胞 RNA 的抽取、Affymetrix 人類微陣列分析以及基因體生物反應指紋 圖譜(Genomic Bioresponse Fingerprint)
一、均質化(Homogenization)
1. 將細胞培養盤(Petri dish)中細胞培養液吸去，DPBS 輕輕沖洗一次之後吸去，
細胞培養盤倒置於擦手紙上，使殘餘液體滴下。
2. 加入 1.2 ml TRIZOL 均勻的潤濕細胞，進行細胞裂解(cell lysis)。
3. 用 cell scrapper 將細胞刮下。
4. 用針筒及 NO.18 針頭將 cell lysate 反覆抽吸 15 次，再將 cell lysate 移到 eppendorf 中，靜置 5 分鐘。
二、相分離(Phase separation)
5. 加入 240 μl chloroform，震盪 15 秒 6. 離心 12,000×g，30 分鐘，4°C
7. 用 P200 pippetment 小心將水層(最上層)移到新的 eppendorf 三、RNA 沉澱
8. 將 600 μl IPA 加入水層，混合，靜置 30 分鐘，4°C 9. 離心 12,000×g，30 分鐘，4°C
10. 用 P200 pippetment 移除上清液
11. 沿 eppendorf 管壁輕輕加入-20°C 預冷的 75%乙醇(in RNase-free H
2
O)，輕輕 搖晃eppendorf，使 pellet 晃動。12. 用 P200 pippetment 移除上清液 四、RNA 回溶
13. 將 pellet 及管壁上殘留的液體吹乾(不要全乾，會不好回溶)。
14. 用 30-50 μl RNase-free H
2
O 將 pellet 回溶(輕輕 pipette 數次)。五、RNA 品質控制(quality control) z RNA 純度(quality)檢測
1) 分光光度器檢測(Spectrophotometric analysis) — A
260
/ A280
＝ 1.9 ~ 2.1 2) 1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析(Agarose gel electrophoresis analysis)— 28S rRNA: 5 kb (4.5 kb) 18S rRNA: 2 kb (1.9 kb) 5S tRNA: 0.1 ~ 0.3 kb
z RNA 含量(quantity)檢測
分光光度器檢測(Spectrophotometric analysis)
— A
260
× 40 × Dilution factor ＝ ng/μl RNA六、利用PhytoViewerBR 2.2 分析 Affymetrix 人類微陣列基因表現資料得到生物 反應指紋圖譜(Bioresponse fingerprint)
1. 開啟 PhytoViewerBR 2.2 軟體，將 Affymetrix data 匯入(import)
2. Filter by gene name－將有 AFFX 開頭的 gene(用於 gene chip calibration)去除 3. Filter by gene signal－將訊號 300 以下的 gene 去除
4. Filter by detection call－將各組 data 中有偵測到(at least one present)的 gene 留下 5. Filter by change call－將與 control 組相比，mRNA 量有變化(Increase or Decrease)的 gene 挑出
6. Filter by ratio－將 mRNA 變化(Increase or Decrease)量大於 4.5 倍的 gene 挑出 7. Intersect－將經過一連串 filter 後所得的 data 作交集分析，得到各組 data 中都 有出現的 gene，並做 PSI(phytomics similarity index)分析。
8. Union－將經過一連串 filter 後所得的 data 作連集分析，得到所有出現於各組 data 中的 gene，並做 PSI 分析。
柒、二維凝膠電泳(2-Dimension Gel Electrophoresis) (參考：鄒宛玲，2006) 一、樣品製備(Sample preparation)
1. 將加藥(對照組：1% MeOH，實驗組：600 μg/ml MeGt) 24 小時之 SKOV-3 細 胞收成 pellet
2. 加入 pellet 體積 3 倍的 2-DE lysis buffer(使用前加 Bio-Lyte 3/10 Ampholyte 0.2%，及 50mM DTT)
3. 超音波震盪 3 分鐘
4. 離心 13,000 rpm, 4 ºC, 20 分鐘 5. 取上清液
※ TCA/Acetone 蛋白質沉澱純化(protein precipitation) 6. 加入 10%TCA/Acetone(使用前加 20 mM DTT)，vortex
(10%TCA/Acetone 與 protein sample 的體積比為 TCA/Acetone : sample = 9 : 1 ) 7. 使 protein 在 -20 ºC 沉澱 45分鐘至2 小時
8. 離心 13,000 rpm, 4 ºC, 10 分鐘 9. 用 P200 將上清液盡量移除
10. 加入-20°C 預冷的 Acetone 500 µl (使用前加 20 mM DTT)，vortex 11. spin down
12. 用 P200 將上清液盡量移除 13. 重複 10~12 步驟 3 次
14. 用微量吸管尖(tip)伸入 eppendorf 吹至無液體或半乾即可, 過乾則不易回溶 15. 加適量二維凝膠電泳細胞裂解液(2-DE lysis buffer)將蛋白質回溶(必要時使 用超音波震盪)
16. 離心 13,000 rpm, 4 ºC, 10 分鐘 17. 取上清液
18. Bradford 蛋白質定量
19. 取已定量好的蛋白質樣品 105.6 µg(for pH 3-10 strip) or protein sample 144 µg (for pH 4-7 strip), 加 2-DE lysis buffer (with fresh DTT, IPG buffer)將體積補足 到 320 µl, 再加微量 bromphenol blue (sample concentration : 99 µg/300µl or 135µg/300µl)
二、一維等電點聚焦(Isoelectric Focusing)
1. 將IPG strips從-20 ºC 冰箱拿出來在室溫下稍回溫
2. 用去離子水沾濕的小濾紙片覆蓋等電點聚焦盤(IEF focusing tray)兩旁的電極 線，輕壓使濾紙片與電極線密合無氣泡。
3. 取 300 µl 蛋白質樣品溶液，均勻加入等電點聚焦盤中(兩旁靠近電極約 1 cm 處不要加)，切勿有氣泡。
4. 用鑷子撕去 IPG strips 表面的塑膠片，將凝膠面朝下，標有 pH 值的一端朝正 極，覆於蛋白質樣品溶液上，切勿有氣泡。
5. 靜置 1 小時
6. 緩慢滴加 2 ml 礦物油，將 strips 完全覆蓋。
7. 等電點聚焦盤置於 PROTEAN IEF cell，開使進行 Rehydration(水合)及蛋白質 等電點聚焦。(IEF Program 之設定如附錄十二)
8. IEF 結束後，用去離子水輕輕沖洗 strips 背面，拭鏡紙吸去多餘水分、礦物油 及多餘樣品。
三、第二維SDS-PAGE
1. 配膠 (18 cm×18 cm×1.5 mm, 12 % acrylamide gel, 49 ml, 凝膠時間約 2 小 時)，可暫存於 4ºC, 使用前切記要回溫
2. 低熔點瓊脂糖凝膠(overlay agarose)用水浴加熱溶解，將 gel 底部補平, 以防氣 泡影響電流
3. 將 strips 凝膠面朝下，置於 rehydration(水合)/equilibration(平衡) tray，加入 equilibration buffer I (4 ml/strip)
4. 搖晃 20分鐘
5. 用去離子水輕輕沖洗 strips 背面，拭鏡紙吸去多餘水分、equilibration buffer I，
加入 equilibration buffer II (4 ml/strip)。
6. 搖晃 20分鐘
7. 用 running buffer 將 strip rinse(要避免泡泡)
8. 先加些許 running buffer(要避免泡泡)幫助 strip (gel side in)滑入兩玻璃片間 (strip 與 acrylamide gel 間不可有氣泡)
9. 倒出 running buffer，用濾紙將 well 間多餘的液體吸去
10. 濾紙片沾 5 µl protein ladder, 放於 strip 旁 (勿放太邊緣, marker 會不清楚) 11. 用 Overlay agarose(＜60ºC)進行封膠
12. 設定冷卻循環水槽的 cooler 於 15℃
13. 跑膠 (要 stir)
四、膠體內蛋白質固定(Gel fixation)
1. 跑膠結束後，將膠泡在 running buffer 中搖晃 5 分鐘 2. 將膠泡在 fixation buffer 中搖晃 0.5~1 小時進行膠體固定 3. 用去離子水 wash，10 分鐘，三次
五、膠體染色(VisPRO stain)
1. 將膠泡在 30 ml solution (1)中搖晃 15 分鐘 2. 用去離子水洗 2 次，倒掉去離子水
3. 迅速倒入 30 ml solution (2)，均勻搖晃至膠體呈白色 4. 用去離子水洗 2 次
5. 將膠體影像掃描存檔以待分析(PDQuest Image Analysis software；Biorad) 6. 用 PE 保鮮袋將膠體及少許去離子水以封口機密封，存於 4ºC
捌、膠體內蛋白質水解(In-gel digestion) 一、退染(Destain)
1. 將從 2D gel 截切下的 spots 裝在用甲醇浸泡過，烘乾的 1.5 ml 微量離心管 2. 加入 1 ml 去離子水，震搖 10 分鐘
3. 移除液體
4. 加入 100 μL 的 50% ACN / 25 mM Ammonium bicarbonate，震搖 15 分鐘 5. 移除液體
6. 重複一遍 4，5 步驟 二、脫水(Dehydrate)
1. 加入 100 μL 的 100% ACN，震搖 5 分鐘 2. 移除液體
3. 旋轉真空乾燥約 5-10 分鐘(至 gel 變成白色粒狀，能在微量離心管中彈跳方可) 三、胰蛋白酶水解(Digest)
1. 加入 3 μL 的 Trypsin solution(20 ng/μL, in 25 mM Ammonium bicarbonate) 2. 於 4 ºC 靜置 1 小時
3. 加入 3-5 μL 的 25 mM Ammonium bicarbonate 4. 將微量離心管密封於 37 ºC 作用 overnight 四、蛋白質提取(Extract)
1. 加入 2-5 μL 的 1% TFA / 100% ACN 2. 超音波震盪 10 分鐘
3. 靜置 10 分鐘 4. 離心 1,000×g , 30 5. 取上清液
玖、介質輔助雷射脫附游離飛行時間式質譜儀(MALDI-TOF)及資料庫應用 1. 點盤 － 取 0.5 μL sample，輕點於 target (Anchor chip)中央，待 sample 自然風 乾後，再點 0.5 μL HCCA matrix 於 sample 上，自然風乾。
2. MALDI-TOF 雷射激發及質譜分析設定
雷射激發設定 － Auto-PMF (auto-run method)
Initial laser power：22% Maximal laser power：30%
Fire initially：3 shots with a laser power of 25%
Peak selection：Use masses from 1,000 Da to 2,500 Da Sum up 500 satisfactory shots in 100 shot steps
質譜分析及 Mascot 資料庫搜尋(protein identification)設定
－ FlexAnalysis Method：Internal Calibration PMF_Yvonne.FAMSMethod BioTools MS Method：Tryptic Map 100ppm
Taxonomy：Homo sapiens (human)
Database：NCBInr Enzyme：Trypsin Global Modifications：Carbamidomethyl(C)
Variable Modifications：Oxidation(M) Missed Cleavages ≦ 1
Mass Tol. MS：100ppm
Mass values：MH＋ Monoisotopic 3. 利用 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，PROXEON ProteinCenter
TM
(http://www.proxeon.com)，ExPASy (http://au.expasy.org)等資料庫搜尋各蛋白質之 相關資訊，並利用GeneGo Meta Core
TM
(http://portal.genego.com)繪出各蛋白質相 互關係之圖譜(signaling networks)拾、西方墨點法(Western blot) 一、樣品製備(Sample preparation) 1. 將細胞收成 pellet
2. 加入約與 pellet 體積等量的 HEPES/NP-40 cell lysis buffer(使用前加 Protease inhibitor Cocktail, Na3VO4, Ser/Thr-PhosphataseInhibitor Cocktail)
3. 超音波震盪 1分鐘
4. 離心 13,000 rpm, 4 ºC, 20 分鐘 5. 取上清液
6. Bradford 蛋白質定量
7. 取已定量好的蛋白質樣品, 加適量 HEPES/NP-40 cell lysis buffer 及 2X sample buffer，將各樣品的蛋白質含量及體積調為一致
8. 水浴法將各樣品沸煮 3 分鐘
9. 待樣品自然冷卻後再置於-20 ºC 儲藏 二、製膠 (可暫存於 4ºC)
凝集膠：5 % acrylamide gel 分離膠：10 % acrylamide gel 三、跑膠
上膠：70V，30 分鐘 下膠：110V，1.5 小時 四、蛋白質轉漬(transfer) 75V，3.5 小時 五、Immunoblotting
1. 將轉漬完成的 PVDF membrane 泡入 5%脫脂牛奶(in TBST)中，室溫下搖晃 1 小時 (或 4 ºC overnight)
2. 取出 PVDF membrane，再泡入含有一級抗體的 5%脫脂牛奶 in TBST(或 5%
BSA in TBST)中，室溫下搖晃 1 小時 (或 4 ºC overnight)
3. 取出 PVDF membrane，泡入 TBST 中，搖晃(wash)10 分鐘，三次
4. 取出 PVDF membrane，再泡入含有二級抗體的 5%脫脂牛奶 in TBST 中，室 溫下搖晃 1 小時
5. 取出 PVDF membrane，泡入 TBST 中，搖晃(wash)10 分鐘，三次 6. 用 Odyssey