實驗結果釋論

經過一系列實驗，找到了 51 個因投予松杉靈芝甲醇萃取物而表現量改變的 蛋白質(表 2)，再經整理分析後，挑出了當中相關性較高的幾個蛋白質，推測可 能的路徑機轉(圖 11)。下面以蛋白質功能性作分類並討論松杉靈芝甲醇萃取物抑 制SKOV-3 生長的可能機轉。

1. Chaperones

Chaperones 的功能在幫助蛋白質的摺疊，或維持蛋白質的構造及功能。大多 數的chaperones 是 heat shock proteins (HSPs)，這些蛋白質會在細胞遭受高溫或其 他壓力(stress)時增加，以保護蛋白質的構造與功能。一般而言 HSPs 的增加會使 細胞逃離程式性凋亡。本實驗51 個蛋白質中的 chaperone 包括 HSP90，HSP70

及HSP27，它們的蛋白質表現量在投予松杉靈芝甲醇萃取物後都增加了，這應該

是由於靈芝萃取物對細胞造成stress 所致。

HSP90 分子量 90kDa，負責維持許多與細胞增生及存活有關的蛋白質的構造

及功能，包括Raf, Akt, ErbB2, Bcr-Abl, HIF-1, p53 等。也因此，許多種癌症治療 皆可由抑制HSP90 來著手。譬如 HSP90 抑制劑 tanespimycin (KOS-953，17-AAG) 作為癌症治療藥物已進入臨床第二期試驗，而其與Herceptin 合併治療

HER2/neu-positive 乳癌也進入了臨床第二期試驗，據研究，tanespimycin 與 Herceptin 併用可降低 HER2/neu-positive 乳癌細胞的抗藥性。目前進入臨床試驗 的HSP90 抑制劑大多由天然物 geldanamycin 經結構修飾而成，但研究人員仍在 尋找更小分子的抑制劑，以期有更安全的therapeutic index。

HSP70 是一種 cell cycle-dependent chaperone，它在 G1/S 期是最多的，且受 到c-Myc 調控 (Kao et al., 1985; Wu and Morimoto, 1985)。HSP70 尚會穩定 caspase-3 & -7 的 precursor 構造，使 caspase 不能被切割成活化態 (Komarova et al., 2004)，從而使 vimentin (一種主要的 intermediate filament)不致被 caspas-7 降解。

HSP27 會與 vimentin 結合，穩定其可溶型態(soluble type) (Lee et al., 2005a)。

可溶態的vimentin 能與活化態(phosphorylated)的 Erks、importin β、及 dynein 等 組合成一個向核運送的單位(a retrograde transport unit) (Perlson et al., 2005)。另有 文獻指出，HSP27 可作為上皮卵巢細胞癌患者預後的指標 (Geisler et al., 1998)。

綜合而言，HSP90，HSP70 及 HSP27 的增加應會使細胞存活及增生，但實 際觀察下來，SKOV-3 細胞的生長及存活數量確實受松杉靈芝萃取物抑制。另外，

Western Blotting 結果顯示 HSP90 的 clients，如 p-ERK2 及 ErbB-2，蛋白質表現 量皆被靈芝抑制 (圖 10b, 10d)。故松杉靈芝甲醇萃取物雖使 HSP90，HSP70 及 HSP27 的蛋白質表現量增加，但可能沒有正常的活性，抑或是無法與 clients 結 合。但當然也有其他可能，靈芝萃取物是經由其他機轉抑制ErbB-2 及 p-ERK2 的產生，而非影響chaperones 的功能，本實驗室郭漢鵬學長的研究中就曾指出，

松杉靈芝萃取物能經由抑制c-erbB2 的 promotor 使 ErbB-2 蛋白質表現減少 (郭 漢鵬，2006)。故尚需用 IP-Western 針對 HSP90，HSP70，HSP27 與其 client proteins 的結合做進一步確認。

2. Transcription factors/mRNA processing proteins/Tranlation factors HNRPK，HNRPH1，FUBP1，KHSRP(FUBP2)，TRRAP，EEF2 等，都是位 於細胞中負責調控轉錄，RNA processing 及轉譯的蛋白質 (Chou et al., 1999; He

et al., 2000; Sakamuro and Prendergast, 1999)。c-Src，c-Myc (Michelotti et al., 1996;

Ritchie et al., 2003) 的蛋白質表現量深受它們的調控。於本實驗中觀察到，

HNRPK，HNRPH1，FUBP1，KHSRP(FUBP2)，TRRAP，EEF2(elongation factor 2) 的蛋白質表現量在投予松杉靈芝甲醇萃取物後一致減少。

TRRAP (transformation/transcription domain-associated protein) 會做為輔因 子，與c-Myc 或 E2F1 (E2F transcription factor 1) 的 transactivation domain 結合，

促進它們的transactivation activity (Sakamuro and Prendergast, 1999)。

由於松杉靈芝甲醇萃取物使 HNRPK，HNRPH1，FUBP1，KHSRP(FUBP2)，

TRRAP，EEF2 的表現皆減少，因此理論上 c-src，c-myc 及其下游基因的表現量 也應該會減少。由Western Blotting 的結果的確可看出 c-Myc oncoproteins & c-Src 表現量有降低之趨勢(圖 10a, 10c)。這提供了一個松杉靈芝甲醇萃取物抑制 SKOV-3 生長的可能機轉。

3. Cytoskeletons / Cytoskeleton-binding proteins

本實驗中發現因靈芝而改變的細胞骨架及相關結合蛋白有 keratin (2, 3, 8, 9, 74)，actin (α1, β, γ1)，beta-tubulin (2b, 2c, 4)，Cnn3，LASP1，nebulin，CAPG，

PKM2，dynein，Tara (TRIO binding protein)，CAPZB，Vimentin 等。這些 keratin，

actin 及 tubulin 當中有部份出現之前有討論過的表現增減不一致的情形，故在分 子機轉分析時actin，tubulin，keratin 並不在考慮之列；這些細胞骨架蛋白絕對不 是不重要，只是需要更多更精確的實驗結果以作為判斷依據。

細胞骨架可分為 microfilament，microtubule 及 intermediate filament 三大類。

Microfilament 由 F-actin，G-actin 構成，G-actin 相互聚集便形成 F-actin。CapG，

CAPZB，nebulin 會與 F-actin，穩定 F-actin。PKM2 則具有促進 F-actin 聚合的作

用。Microtubule 由 α-tubulin，β-tubulin 構成，功用在提供機械支援力，並且為細 胞內的「公路」，提供胞內運輸的途徑，亦會形成紡綞體與星狀體。Dynein 是胞 內主要的運輸蛋白之ㄧ，他能攜帶vesicle，沿著 microtubule 進行運送。Intermediate filament 是最穩定的細胞骨架成分，主要起支撐作用，並維持細胞核形態的穩定 性，亦與包內物質的運輸密不可分。Keratin 及 vimentin 都屬於 intermediate filament。

HSP27 具有穩定 vimentin 可溶性的作用。Intermediate filament 對於活性態 ERK/MAPK 的運輸是必要的 (Perlson et al., 2005)，並且能防止 p-ERK 被去磷酸 化 (Perlson et al., 2006)。根據 2-DE 影像分析，HSP27 及 vimentin 在投予靈芝後 都有上升，則其下游的c-Myc 表現量可能會增加。西方墨點法結果卻顯示，c-Myc 表現下降雖不顯著，但的確有減少的趨勢。因此，如同之前所猜測的，松杉靈芝 萃取物或許抑制了HSP27 的功能，使 vimentin 的可溶構造不穩定，無法進行運 輸。又或者，靈芝萃取物純粹是如先前所推測，經由抑制HNRPK，HNRPH1，

FUBP1，KHSRP，TRRAP 蛋白質表現量從而抑制 c-Myc 蛋白質表現。

4. Metabolic proteins

根據實驗結果，Enolase，LDHB，EFABP (fatty acid-binding protein, epidermal) 的蛋白質表現量下降，ECHS1，PKM2 則是上升。Enolase 為醣解作用的第九個

酵素，而LDHB 掌管無氧醣解作用的最後一個步驟。當此二者同時下降，細胞

產能減少，可能因而抑制了細胞生長。但PKM2，醣解作用的第五個酵素，於本

實驗中是上升的。有關這部分尚有待釐清。

Enolase 的轉錄受 HIF1 所調控，而 HIF1 的下游 gene 還包括 VEGF (vascular endothelial growth factor)，PDGF-β (platelet-derived growth factor β)，TGF-α (transforming growth factor-α)，EPO (Erythropoietin)等。Kimura 等人在 2002 年發 表，靈芝三萜類化合物能抑制由VEGF 誘發的血管新生(angiogenesis) (Kimura et

al., 2002)。因此推測，松杉靈芝萃甲醇取物可能經由抑制 HIF1 及 VEGF，而具

有抗血管新生的作用。但此推測仍需進一步的證實。

5. Detoxification proteins

GSTP1 (pi-class glutathione transferase)是具有解毒功能的蛋白質，在遇到有 毒物質時，能發揮細胞保護的功效。GSTP1 能催化親核性攻擊使 glutathione (GSH) 還原，再利用還原態的glutathione 與內生性或外生性的疏水親電子型化合物相接 合，使其親水性增加，有利於被代謝或排除 (Hayes and Strange, 1995; Rushmore and Pickett, 1993)。GSTP 能對抗的外生性毒物包括烷化基抗癌藥物及抗生素類抗 癌藥物，例如chlorambucil 及 doxorubicin 等。許多研究都證明，GSTP1 過表現 與人類癌症的發生，發展，以及藥物抗性有關，並與病患存活率呈反向相關 (Black and Wolf, 1991; Shah et al., 1997; Tew, 1994)。而在許多人類癌症中都被報

告出有GSTP 表現上升的情形，包括肺癌，大腸癌，卵巢癌，睪丸癌，膀胱癌，

口腔癌，和腎臟癌等 (Green et al., 1993; Katagiri et al., 1993; Zhang et al., 1994)。

投予松杉靈芝甲醇萃取物後，發現 GSTP 蛋白質表現降低，這對於抗癌細胞 生長而言，無疑是個好消息。更值得深思的是，GSTP 降低，意味著靈芝與其他

抗癌藥併用的價值。此外，若是對於靈芝抑制HSP90 功能的推測能被證實，其

對於減低癌細胞抗藥性的能力將會是靈芝運用在臨床上的重點。