第三章 : 結果
第二節、 松杉靈芝萃取物對 SKOV-3 細胞株的影響
壹、松杉靈芝萃取物對 SKOV-3 細胞株形態的影響
如圖 4.1 所示，SKOV-3 細胞株原本形態規則，似菱形或紡錘形，略圓，飽 滿，排列緊密。投予靈芝(甲醇或乙醇)萃取物 0，100，500，1000 μg/ml 後，隨 著給予靈芝萃取物濃度的增加，SKOV-3 細胞形態越顯狹長且不規則，細胞數量 也漸次減少，至最高濃度時細胞全部死亡，顯微鏡下只見小碎片般的殘骸。由此 可知靈芝甲醇及乙醇萃取物對SKOV-3 細胞株有生長抑制，甚至具毒殺作用。
貳、松杉靈芝萃取物對 SKOV-3 細胞株移動能力的影響
創傷癒合試驗(Wound closure assay)結果如圖 4.2 所示，松杉靈芝甲醇及乙醇 萃取物對SKOV-3 細胞傷口癒合的影響大致相同。投予 30 μg/ml(小劑量)靈芝甲 醇及乙醇萃取物的組別，則觀察到其傷口癒合速度較control 組為快，48 小時就 已完全癒合。投予100 μg/ml(大劑量)靈芝甲醇及乙醇萃取物的組別其傷口癒合速 度明顯較慢，第48 小時以後幾乎不見任何進展，第 72 小時可見到靠近傷口中心
的細胞部份出現形態變異，在第96 小時，靠近傷口中心細胞形態變異的情形益
加明顯，甚至有部分細胞死亡，導致傷口復又擴大。由實驗結果可知靈芝甲醇及
乙醇萃取物在30 μg/ml(小劑量)下會促進 SKOV-3 細胞傷口癒合速率，表示可能 增加SKOV-3 細胞移動速率；在 100 μg/ml(大劑量)下，會抑制 SKOV-3 細胞傷口 癒合速率，表示可能降低SKOV-3 細胞移動速率或移動能力。
參、松杉靈芝萃取物對 SKOV-3 細胞株的半數抑制濃度(IC
50
)利用 CCK-8 assay (其原理與 MTT 相似)，松杉靈芝甲醇及乙醇萃取物對 SKOV-3 細胞株的半數抑制濃度(IC
50
) 如圖 5 所示。松杉靈芝甲醇萃取物對細胞 株之IC50
約為300 μg/ml；松杉靈芝乙醇萃取物對細胞株之 IC50
約為200 μg/ml。且由生長抑制曲線可看出，松杉靈芝甲醇萃取物對SKOV-3 細胞株的生長抑制作 用濃度範圍為100-800 μg/ml，而松杉靈芝乙醇萃取物則為 100-300 μg/ml，明顯 比松杉靈芝甲醇萃取物窄。
第三節、SKOV-3 細胞株對松杉靈芝萃取物的基因體生物反應
指紋圖譜
利用 PhytoViewerBR 2.2 分析 SKOV-3 細胞株投予松杉靈芝萃取物 24 小時之 Affymetrix 人類微陣列基因表現資料，得到生物反應指紋圖譜(Bioresponse fingerprint) 如圖 6 所示。圖上每一橫紋即代表一個 gene，顏色表示投予松杉靈 芝萃取物後，此genes 之 mRNA transcripts 量與 control 組相比增加或減少的程 度。(圖 6a) 經過連集分析(得到出現於各組 data 中的所有 genes)得到 671 個 genes，由圖可看出投予松杉靈芝甲醇萃取物(MeGt：600 μg/ml)的組別(Me2~Me4) 與投予松杉靈芝乙醇萃取物(EtGt：400 μg/ml)的組別(Et6、Et7)，其 gene expression 具有不同但相似的顏色profile。 (圖 6b) 經過連集分析得到 376 個 genes，比(圖 6a)分析得到的基因數少，代表(Me2~Me4)間的重疊性更高。 (圖 6c)經過交集分 析(篩選同時在各組 data 中皆有出現的 genes)得到 139 個 genes。 (圖 6d)
(Me2~Me4)經過交集分析得到 198 個 genes，比(圖 6c)分析得到的基因數多，同 樣代表投予松杉靈芝甲醇萃取物的三組間其重疊性更高。
另外，同樣利用 PhytoViewerBR 2.2 分析 SKOV-3 細胞株投予松杉靈芝萃取 物之Affymetrix 人類微陣列基因表現資料，進一步將各組間之 bioresponse 的相 似度做統計分析，得到各組間之PSI matrix ((phytomics similarity index；PSI value，0：complete difference，1：complete similarity) 如表 1 所示。結果顯示投 予松杉靈芝甲醇萃取物的三組間之bioresponse 極相似(PSI value＞0.95)，而投予 松杉靈芝甲、乙醇萃取物的兩大組間之bioresponse 相似但不同。
第四節、以二維電泳、質譜分析以及資料庫比對推測靈芝對 SKOV-3
細胞株蛋白質表現的影響
壹、利用二維凝膠電泳及介質輔助雷射脫附游離飛行時間式質譜分析投予松杉 靈芝甲醇萃取物後表現量有差異的蛋白質
一開始使用 pH3-10 linear 及 non-linear 的等電點 pH 梯度膠來進行二維凝膠 電泳，目的是先觀察大pH 值範圍中，投予松杉靈芝甲醇萃取物(MeGt)後表現量 有差異的蛋白質大都出現在哪個pH 值範圍，如圖 7a，7b 所示。經二維膠體影 像分析軟體PDQuest Image Analysis software 處理，表現量有差異的蛋白質點大 都出現在pH4-7 範圍中。為了將 pH4-7 範圍間的蛋白質點看的更清楚，採用 pH4-7 linear 的等電點 pH 梯度膠如圖 7c 所示。
經 PDQuest 分析得 106 個差異蛋白質點，將蛋白質點切取下來，作膠體內 蛋白質水解(In-gel digestion)，用 MALDI-TOF 分析，經過 MASCOT 資料庫比對 (MOWSE Score＞65 are significant，p<0.05)，得到 51 個不同的蛋白質(詳見表二)。
有少部份蛋白質點經MALDI-TOF/MASCOT 分析含有相同蛋白質(皆為 tubulin 及keratin)，但 PDQuest 分析這些蛋白質點並非一致增加或下降。
貳、匯整所有經2D-MS/MASCOT 分析所得之蛋白質
表 3 中將 SKOV-3 細胞投予靈芝甲醇萃取物之 2D-MALDI/TOF (蛋白質表現) 及 Affymetrix (基因表現)分析結果做對照，結果在兩種分析中表現量皆上升的蛋 白質(或基因)有 4 個，分別為 HSPA5 (heat shock 70kDa protein 5；HSP70)，SLC3A2 (lymphocyte activation antigen 4F2 large subunit)，HSP90B1 (heat shock protein 90 kDa beta member 1；HSP90)，P4HB (prolyl 4-hydroxylase subunit beta)；而在兩種 分析中表現量皆下降的蛋白質(或基因)有 5 個，分別為 CAPG (actin-regulatory protein CAP-G)，LASP1(LIM and SH3 protein 1)，TUBB4 (tubulin, beta 4)，
HNRPK(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K)，Cnn3 (calponin 3)。另外，
ECHS1(short chain enoyl-CoA hydratase)，CAPZB (capping protein (actin filament) muscle Z-line, beta)，PKM2 (pyruvate kinase, pyruvate kinase 3)的 microarray 數據 顯示其基因表現下降，與蛋白質的上升表現相反。
表 4 中將 2D-MALDI/TOF 分析得到的 51 個蛋白質依功能分類，大致分為 chaperone，代謝相關蛋白，細胞骨架蛋白，細胞骨架結合蛋白，與胞內物質運 輸相關之蛋白質，異質性細胞核醣核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein, hnRNP)，轉錄因子，調節 mRNA splicing 的蛋白質，轉錄活化的輔因子，轉譯因 子，生長因子，溶酶體及蛋白酶體相關蛋白，具解毒功能的蛋白質，具抗氧化功 能的蛋白質，甲狀腺素結合蛋白，一般性酵素蛋白，以及其他蛋白質。
較引人注意的是，表4 中出現的 hnRNP，轉錄因子，調節 mRNA splicing 的 蛋白質，轉錄活化的輔因子及轉譯因子的蛋白質表現量都是下降的，值得去探討
它們之間的關聯性以及是否與靈芝甲醇萃取物抑制SKOV-3 細胞生長機制有
關。另外，表4 中出現的所有 chaperone 的蛋白質表現量都是上升的，這也有進 一步探討的必要。
參、受松杉靈芝甲醇萃取物影響的蛋白質間的相互作用
本實驗室使用 GeneGo Meta Core
TM
(http://portal.genego.com)繪出各蛋白質 相互關係之圖譜(signaling networks)以作為後續研究方向的參考。圖 8a，8b 是套 用不同模式所繪製出的signaling networks，分別有 23 個及 12 個受靈芝影響表現 量改變的蛋白質被繪入signaling networks。綜觀此二圖，對照二維凝膠電泳及直譜儀分析數據，挑選出與生長相關且互 具關聯性的蛋白質，繪出SKOV-3 細胞內表現量受靈芝甲醇萃取物所改變之部分 生長相關蛋白質間的相互關係網路圖(圖 9)。
由圖 9 中可以發現數個與細胞內重要生長訊息傳導有關的蛋白質，會被受靈 芝影響表現量的蛋白質所調控，包括c-Myc，c-Src，HER2，AKT/PKB，
ERK/MAPK， AKT，HIF1A 等。投予靈芝甲醇萃取物的組別中，具有促進 c-Myc，
c-Src oncoprotein 表現之功能的 hnRNPK(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K)，FUBP1(myc far upstream element-binding protein)，KHSRP(KH-type splicing regulatory protein)，TRRAP(transformation/transcription domain-associated protein) 蛋白質表現量皆減少，暗示c-Myc，c-Src 表現可能也會減少。但相反的，同時 也見到HSP90，HSP70，HSP27 等 chaperone 表現量增加，這些 chaperone 會使 c-Myc，c-Src，HER2，AKT/PKB，ERK/MAPK，vimentin 等訊息傳導相關的重 要蛋白質結構穩定具活性的功能。
本實驗須確認的是，在投予靈芝甲醇萃取物後，c-Myc，c-Src，HER2，
AKT/PKB，ERK/MAPK 等蛋白質表現及其活性究竟是上升抑或下降。若能證明 這些蛋白質的確受靈芝甲醇萃取物抑制，則就可能揭露松杉靈芝甲醇萃取物抑制 SKOV-3 細胞生長的部分分子機轉。
第五節、推測並驗證靈芝甲醇萃取物抑制細胞生長之可能分子機轉
壹、以西方墨點法確認松杉靈芝甲醇萃取物能抑制細胞內重要訊息傳導和生長 相關蛋白質(c-Myc，ERK2，c-Src，HER2)之表現量
由圖 10 a-d 可看出，c-Myc，ERK2，c-Src，HER2 及其磷酸態(活性態)蛋白 質表現在松杉靈芝甲醇萃取物較小劑量(150 μg/ml MeGt
，
即0.5 個 IC50
)下會稍微 升高，但劑量升高到300 μg/ml MeGt (即 1 個 IC50
)，以及 600 μg/ml MeGt (即 2 個IC50
)時，c-Myc，ERK2，c-Src，HER2 及其磷酸態(活性態)蛋白質表現均有不 同程度的減少，其中表現量受抑制最為顯著的是p-ERK2。Western Blotting 的結果初步顯示 c-Myc，c-Src，HER2，AKT/PKB，
ERK/MAPK 等蛋白質表現及其活性的確受靈芝甲醇萃取物抑制。
貳、靈芝甲醇萃取物抑制SKOV-3 細胞生長之可能分子機轉
根據上述所有實驗結果，推測出一部分靈芝甲醇萃取物(MeGt)抑制 SKOV-3 細胞生長之可能分子機轉，如圖11 所示。
(1) MeGt 使具有促進 c-myc 及 c-src DNA 轉錄的 hnRNPK，KHSRP，FUBP1 蛋白表現量減少，可能從而抑制c-Myc 及 c-Src oncoproteins 及其下游基因的表 現，達到抑制癌細胞增生的作用。
(2) 由於 MeGt 促使 heat shock protein 表現，但同時卻看到 HER2，c-Src，
ERK2 等蛋白表現量減少，因此推測，MeGt 可能抑制了 HSP90，HSP70 及 HSP27 穩定其client proteins，包括 HER2，c-Src，ERK2，AKT，HIF1A(hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit)，vimentin 等，的功能，使其 client proteins 不具功能性，
或無法被運送，甚至被降解，達到抑制癌細胞survival 的作用。
(3) MeGt 直接或間接抑制 enolase 及 LDHB(L-lactate dehydrogenase B chain) 蛋白質的表現，使醣解作用下降，細胞產能下降，因而降低了癌細胞的增生能力。
第四章、討論
第一節、基因體生物反應指紋圖譜分析結果之意義
本實驗結果顯示(圖 6，表 1)，松杉靈芝甲、乙醇萃取物使 SKOV-3 細胞株 產生不同但部份相似的反應，表示松杉靈芝甲、乙醇萃取物可能具有部份相似或 相同生物反應成分。而投予松杉靈芝甲醇萃取物的三組重複實驗間之bioresponse 極相似 (PSI value＞0.95)。
Bioresponse fingerprint 顏色分布圖，可一眼看出不同藥物所造成的
bioresponse profile，當多批藥物同時測驗時，差異性大的組別可立即被分辨。而 PSI 分析，是以統計方式呈現細胞對各批藥物的 bioresponse 相似程度，PSI 數據 為判斷各批藥物間成份相似度的最大依據。由此可知，Bioresponse fingerprinting 分析平台極有潛力做為中草藥品質鑑定的利器。
第二節、蛋白質體學研究方法討論
本實驗使用蛋白質體學的研究方式，篩選出被松杉靈芝所改變的 51 種蛋白 質。可預測，若經由等電點pH 梯度膠種類的改變，SDS-PAGE 膠體比例的調整，
2-DE / MALDI-TOF / MASCOT 將能近乎全方面的篩選出被松杉靈芝所改變的各 種蛋白質。但是，蛋白質體學研究方式所帶來的大量結果數據及相關資訊的分析 處理和判讀，甚至比實驗操作本身更為艱難費時。並且，2-DE / MALDI-TOF / MASCOT 研究結果必須配合其它實驗方式，例如 Western blotting，Q-PCR，螢 光染色等，以驗證2-DE 結果及推論。
從二維凝膠電泳開始一直到MASCOT 資料庫比對是一連串環環相扣的實驗
操作，當中任一步驟的差錯都可能造成樣品污染或最後數據判讀的困擾。在本實 驗中，經由數次挖取不同膠上的相對蛋白質點，對照其最後資料庫比對結果，確 認每次操作具有良好的重複性。表二中凡是具有兩個編號的點即為經過重複挖取
者，如編號(3-7101，5-7104)，(4-0208，5-1301)，(8-5705，10-5705)及其他數對 蛋白質點的資料庫比對結果，幾乎是相同的蛋白質。
但是有少部份蛋白質點經 MALDI-TOF/MASCOT 分析含有相同蛋白質，但
但是有少部份蛋白質點經 MALDI-TOF/MASCOT 分析含有相同蛋白質，但