實驗方法

秤取 Mulberry Juice Powder (MJP)和 Anthocyanin extract form Mulberry Juice (AEMJ)各 5 mg，以 1.2 mL 去離水回溶後，各取 500uL，分別以 pH1.0 buffer

MW:花青素標準品分子量，如 cyanidin-1-glucoside 為 484g/mol

: 花青素之莫耳吸光係數(2.96 x 10⁴)

(2) 抗氧化能力測定

A. 清除 DPPH 自由基能力測定

原理

DPPH•+AH→ DPPH+HA•

DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 為深紫色之自由基物質，在 517nm 有較 高吸收。抗氧化劑 (上式中 AH) 能提供氫離子，抑制自由基之單電子進行氧 20 mM trolox stock

秤取 0.015 g trolox，溶於 3 mL 乙醇 20 mM ascorbic acid stock

秤取 0.0352 ascorbic acid。溶於 10 mL 去離子水

實驗步驟

Mulberry Juice Powder (MJP) 和 Anthocyanin extract form Mulberry Juice (AEMJ) 以去離子水回溶後，配成序列濃度。從 20 mM trolox stock 中取 100 μL

B. ORAC 值

原理

ORAC (oxygen radical absorbance capacity) 值又稱抗氧化能力指數，為利用 2,2’-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) 產生自由基使螢光消 失，而抗氧化物質能減緩螢光消失速率，最後以螢光分光光度計記錄吸光曲 線，計算曲線下面積對照標準品 Trolox 得總抗氧化能力值，抗氧化能力以 µmole Trolox 當量/克表示 (鄭，2011)。

試劑配製

Phosphate buffer (75 mM, pH7.4)

秤取 2.338 g sodium phosphate monobasic 和 15.56 g sodium phosphate dibasic 溶於適量去離子水後定量至 1 L

Trolox stock solution (20 mM)

秤取 25 mg Trolox 溶於 5 mL 乙醇，分裝避光-20°C 保存。

AAPH (400 mM)

每次使用新鮮配製。秤取 542.4 mg AAPH 溶於 5 mL phosphate buffer。

FL solution

Srock A: 0.0119 g Sodium fluorescein (FL) 溶於 10 mL phosphate buffer。

Stock B: 從 Srock A 取 200 μL 以 phosphate buffer 定量至 100 mL。

新鮮配製: 從 Srock B 取 200 μL 以 phosphate buffer 定量至 40 mL。

實驗步驟

此法參照鄭 (2011)。從 trolox stock solition (20 mM) 取 100 μL，加 9.9mL phosphate buffer 配 成 20 μM 標 準 品 。 Mulberry Juice Powder (MJP) 和 Anthocyanin extract form Mulberry Juice (AEMJ) 以 phosphate buffer 回溶後，

配成序列濃度。於黑盤 96well 中，加入樣品或標準品 20 μL，接著避光加入 200 μL 之 FL solution，靜置 30 分鐘，等待期間先將螢光偵測儀設定完畢。30 分鐘後接著加入 10 μL 之 AAPH，立刻於螢光偵測儀以 485/538 之激發/發散 波長測定其螢光強度。0 分鐘時測定為第零次，接下來兩分鐘測定一次，直至 螢光強度降至底線。結果換算至單位μmolTE/g dry weight。

計算:

起始點螢光強度: fo 各時間點螢光強度: fi 相對螢光直: fi/fo

AUC (Area under curve) = 0.5+f1/fo+f2/f0+…+f34/fo+0.5(f35/f0) 標準曲線: AUCtrolox - AUCblank= net AUC trolox

計算所得之 net AUC trolox與其濃度作圖，可得標準品的線性回歸方程式 y=ax+b ORAC (μmolTE/gDW) = ((net AUC trolox - b)/a)/sample dilute

(3) 抑制酪胺酸酶活性測定

原理

酪胺酸酶會將多巴 (L-3,4-dihydroxyphenylalanine, L-dopa) 轉變成黑色素，在 波長 475 nm 有較高吸光值。藉由樣品抑制酪胺酸酶活性，再加入 dopa 使酪 胺酸酶將之轉化為黑色素，測定 475 nm 吸光值，經計算後可知樣品抑制酪胺 酸酶活性能力 (Tomita et al., 1990)。

實驗步驟

此法參照 Tomita et al. (1990)。Mulberry Juice Powder (MJP)和 Anthocyanin extract form Mulberry Juice (AEMJ)以 buffer 回溶後，配成序列濃度。於 96well 中，避光下加入樣品或標準品 20 μL，與 40 μL 之 tyrosinase，靜置 10 min，再

(4) 細胞試驗

試劑配製

(以下藥品為細胞級試劑)

Phosphate buffer saline, PBS

8g NaCl, 1.15g Na2HPO4, 0.2g KH2PO4, 0.2g KCl, 取適量去離子水溶解後 定量到 1L。

Minimum Essential Medium Alpha, MEM-

取一包可配製 1 L MEM-粉末，以適量現取去離子水溶解並加入 1.5g NaHCO3後定量至 1 L，以 6N HCl 調整酸鹼值至 pH 7.3，經 0.22 m 濾杯 過濾後添加 10% FBS 與抗生素。

MTT stock solution

秤取 0.1g MTT 溶於 50mL PBS，溶解後以 0.22m 濾膜過濾避光保存。

DCFDA stock solution (10 mM)

秤取 50 mg 2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate + 1026 μL dH2O

細胞凍管活化

人類皮膚纖維母細胞 (human skin fibroblast) CCD-966SK (BCRC no.60153) 購 自食品工業發展研究所生物資源保存及應用中心 (新竹，台灣)。購得之凍管

細胞培養

人類皮膚纖維母細胞 CCD-966SK (human skin fibroblast) 於含不去補體之 10% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 之培養液 Minimum Essential Medium Alpha (MEM-)中，培養於含 5% CO2，具充分濕度之 37℃之培養箱。

A. 細胞接種量標準曲線

在以不同樣品處理細胞以測試樣品毒性之前，先以 MTT assay 建立細胞 濃度標準曲線以確認最適細胞接種量。

MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 呈色 法常用於檢驗細胞之生長。活細胞內粒腺體中的琥珀酸去氫脢 (succinate dehydrogenase) 將 MTT 中的 tetrazolium 還原為藍紫色產物 formazan，因此 formazan 之形成量與活細胞數目呈正比 (Mosmann, 1983)。

此法參照 Ni & Hollander (1996)。將細胞以培養基配成不同細胞量，接種 於 96well 中培養一天待其貼盤。吸除上清後，避光加入 125 μL MTT 試劑 (500 μg /mL) 培養 3.5 h。吸除試劑，加入 100 μL DMSO 將細胞內藍紫色產物 formazan 溶出，輕拍使其均勻後，以 ELISA reader 測定 570 nm 吸光值。以各 細胞濃度與相對吸光值繪圖，可得細胞量之標準曲線。後續以 96 well 進行之 DMSO，輕拍使其均勻後，測 570nm 吸光值 (Ni & Hollander, 1996)。

確認吸光值落在標準取曲線之線性範圍內，以各濃度吸光值除以無加樣之 吸光值後乘以 100%，即可得到細胞存活率。

C. 最適 UVA 強度試驗 培養一小時，於螢光偵測儀測定其螢光強度 (Haliwell et al., 2004)。DCFDA 被 細胞內 ROS 氧化後成為螢光物質，在激發/散射波長為 485/538 nm 時可偵測

有加樣、有照射組之螢光強度(experimental) : Inx

D. 桑椹汁及其粗萃物對紫外光刺激細胞保護功效評估

c. SOD 活性 照射後細胞內及細胞所分泌至培養液之 procollagen I 含量，探討其對細胞光老 化之保護。 心 1500xg 5 分鐘使用，取上清液分裝，-80°C 可保存至少六個月。以 procollagen type I C-peptide (PIP) EIA kit (TaKaRa) 測定各組細胞之 procollagen I 濃度。

此法參照歐陽 (2012)。細胞以培養液調整濃度為 1x10⁴/200 μL 接種於兩 盤 96well 中，24h 後吸除上清液，避光加入含 MJP 或 AEMJ 濃度為 50、25、

0 之培養液再培養 24h。接著以 50uL PBS 洗兩遍，再加入 50uL PBS，一盤不 照射當對照組，另一盤則照射 UVA。照射後立即吸除 PBS，加入無血清 MEM-

e. 皮膚纖維細胞 MMP-1 表現

將細胞預先以含 MJP 之培養液培養，測定樣品對皮膚纖維細胞中 MMP-1 活性之影響，探討桑椹汁及其花青素粗萃物抗細胞光老化之可能保護機制 (Fagot et al. 2002)。

此法參照 Bae et al. (2009)。細胞以培養液調整濃度為 1x10⁴/200 μL 接種於 兩盤 96 well 培養 24h。吸除上清液，避光加入含 MJP 濃度為 100、50、25、0 μg/mL 之 MEM-，濃度 0 μg/mL 者為 control。再培養 24h 後，收集上層培養 液，以 ELISA 測定各濃度樣品處理並照射後細胞釋放之 MMP-1 濃度。

所得 MMP-1 活性需除以上述 MTT assay 所得之細胞存活率，方得單位細 胞釋放之 MMP-1 濃度，並比較各濃度樣品處理之結果，探討桑椹汁對細胞產 生 MMP-1 之影響。