國立臺灣大學生物資源暨農學院食品科技研究所 碩士論文
Graduate Institute of Food Science and Technology College of Bio-Resources and Agriculture
National Taiwan University Master Thesis
桑椹花青素粗萃物對人類皮膚纖維母細胞光老化之保護 Protective Effect of Crude Anthocyanin Extract from Mulberry on
Ultraviolet-Irradiated Human Skin Fibroblasts
陳彥伶 Yen-Ling Chen
指導教授：吳瑞碧 博士 指導教授：游若篍 博士
Advisor: James Swi-Bea Wu, Ph.D.
Roch-Chui Yu, Ph.D.
中華民國 103 年 7 月
誌謝
真是令人激動，終於畢業了。謝謝游若篍博士、吳明昌博士、沈賜川博士、
廖慧芬博士願意撥空參加我的口試，並給我許多寶貴意見，使學生論文更趨完整。
兩年來有說不盡的感謝，其中特別謝謝吳老師把我收到門下當您的學生，您 給我們所有的關心與照顧，包含聽我們 meeting 報告實驗進度，改 IFT 摘要和改論 文，都讓學生感恩在心，您的恩澤學生無以回報。這段時間裡學到的東西比能夠 想像的多太多了。除了學習對學問的態度和設計實驗的思路和邏輯，也學習如何 在團隊裡與別人合作，同患難共進退。謝謝實驗室裡的大家！文昌學長，如果沒 有你我一定一直都只是一隻小魯蛇，謝謝你實驗的指導和耐心的鼓勵，本來期待 可以一直受你照顧一起畢業的沒想到你竟然…只能說你真的太強了三年半就跑走 了。謝謝淑親，急性子的你一定對我多般忍受吧，謝謝你常提醒我忘記了的事情，
還常分我們吃許多美味的小點心！謝謝勤巧，你的馬來西亞點心好好吃，肉骨茶 更是超級超級好吃無敵美味～謝謝明勳，在許多沒注意的細節上提醒我，也總是 有話直說，從你口中才能得到真正的評價。謝謝雅筑、紫瑜、Doggy、天使甄雯、
小柏、家銘，你們在我還不熟悉時在實驗和生活各事上多方指導與包容。謝謝柔 安、瑀芳、佑瑋、盈盈，許多我弄不好的事情多虧你們幫忙，貼心的你們明明課 業也很忙碌卻願意分憂解勞，有你們真是太好了！謝謝蔣老師實驗室的大家，常 常跟你們借東西你們也從不吝嗇，沒有你們我畢不了業，謝謝你們！也謝謝同屆 的大家，和其他家的學長姐學弟妹們，你們所有的鼓勵都是支持我繼續加油的力 量。謝謝吃飯夥伴 Amy 和安安，你們真是我的精神支柱，謝謝你們在吃飯時間還 願意聽我發牢騷，和你們吃飯是我一整天最快樂最輕鬆的時光之一。謝謝和我一 起住的姊妹們，包容我的晚歸和壞脾氣，還願意在我心情最低落時陪我禱告，感 謝主把我放在妳們中間。
最後感謝我的家人，謝謝爸爸總是無條件的支持我所有開銷，謝謝媽媽每當 回高雄時總不缺一桌的食物，謝謝弟弟當我提出許多任性要求時也都總是幫助 我；謝謝你們做我生活的支柱和後盾，研究所期間總是忙忙碌碌，在重要的日子
中文摘要
皮膚長時間曝曬於紫外線 (ultraviolet, UV) 中，可能會造成光老化，其主要症 狀包括產生皺紋及黑色素沉澱等，其中皺紋的產生與膠原蛋白減少有關。UVA 能 穿透至皮膚真皮層，刺激真皮纖維細胞內的活性氧物質 (Reactive oxygen species, ROS) 增加，經一連串訊息傳遞路徑，最終抑制膠原蛋白生成並促進基質金屬蛋白 酶 (Matrix Metalloproteinase-1, MMP-1) 表現，進而促進膠原蛋白之降解。抗氧化 物質能藉由抑制細胞內 ROS 生成，達到減緩皮膚膠原蛋白流失之保護功效。桑椹 (Morus alba) 是台灣抗氧化活性最高的常見水果之一，富含花青素，有很強的抗氧 化功效，能降低細胞內氧化壓力。本研究目的為探討桑椹花青素粗萃物對紫外線 造成皮膚光老化之保護功效。桑椹經均質、離心、冷凍乾燥，製得桑椹汁粉末 (mulberry juice powder, MJP)，MJP 再經固相萃取管柱分離，凍乾後得桑椹花青素 粗萃物 (anthocyanin crude extract from mulberry juice, AEMJ)。將 MJP 和 AEMJ 回 溶後，測定其花青素含量、酪胺酸酶活性之抑制、及 DPPH、ORAC 等抗氧化力。
結果顯示，AEMJ 中花青素含量約為 MJP 之 15 倍，清除 DPPH 能力也由 119 μmol TE/gDW 增為 2506 μmol TE/gDW，而 500 g/mL MJP 對酪胺酸脢之抑制率約為 38%。細胞試驗部分，以人類皮膚纖維母細胞 CCD-966SK 作為細胞模式，先以含 MJP 或 AEMJ 之培養液培養 24 小時後，測定其存活率、氧化壓力、原膠原蛋白、
抗氧化酵素及膠原蛋白酶生成量，以評估桑椹汁及其花青素粗萃物對細胞暴露於 UVA 造成傷害之保護功效。結果顯示，細胞經 UVA 照射後存活率降低而 ROS 增 加，然而先以含 MJP 或 AEMJ 培養液培養之細胞存活率則顯著提升，其中 1000
g/mL MJP 可提升細胞存活率至 102%，而 50 g/mL MJP、AEMJ 則顯著減緩 ROS 增加。UVA 照射使細胞 SOD 降低，而 50 g/mL AEMJ 之 SOD 活性與未照射者無 顯著差異。人類皮膚纖維母細胞與含 MJP 或 AEMJ 之培養液培養後可提高原膠原 蛋白生成量並降低膠原蛋白酶 MMP-1 生成，延緩細胞受 UVA 刺激後原膠原蛋白 降解。研究結果顯示，桑椹汁能減輕細胞因 UVA 造成之存活率下降，並可能藉由 提升細胞內抗氧化酵素活性而提升細胞抗氧化力，降低細胞內氧化壓力，減少膠 原蛋白之降解，進而達到對光老化之保護功效。
ABSTRACT
Exposure to ultraviolet (UV) radiation may cause skin photoaging, including pigmentation and wrinkling. The latter is relevant to degradation of collagen. UV radiation promotes the generation of reactive oxygen species (ROS) in skin fibroblasts, and therefore induce signal pathways to accelerate the degradation of collagen.
Antioxidants protect cells from UV-induced oxidative stress. Mulberry (Morus alba) fruit is rich in anthocyanin with great antioxidative properties. The present study aimed at investigating the protective effect of mulberry juice and anthocyanin crude extract from mulberry on UV-induced photoaging in human skin using fibroblasts as the model.
Mulberry fruit were bought from Hualien, Taiwan, homogenized, centrifuged to recover the juice, and lyophilized to obtain mulberry juice powder (MJP). Anthocyanin crude extract from mulberry juice (AEMJ) was separated from MJP by solid phase extraction (SPE). MJP and AEMJ were re-dissolved to determine the anthocyanin content, anti-tyrosinase and antioxidant activities. The anthocyanin content of AEMJ is about 15-fold that of MJP. The DPPH scavenging activity of AEMJ is 2506 μmol TE/gDW, while that of MJP is 119 μmol TE/gDW only. The anti-tyrosinase activity of 500 g/mL MJP reached 38%. Human skin fibroblasts CCD-966SK were used as the model, cultured in medium containing MJP or AEMJ for 24 h, and then exposed to UVA. After exposure, MTT assay was performed to determine the cell viability. The production of ROS, procollagen, the activities of superoxide dismutase (SOD) and matrix metalloproteinase (MMP)-1 of irradiated-fibroblasts were also measured for assessing the protective activities of MJP and AEMJ on UV-induced cell injury. After the exposure
increased, while incubating with 50 g/mL MJP or AEMJ significantly alleviated the increment. The SOD activity of fibroblasts after exposure to UVA decreased, while that of fibroblasts incubated with 50 g/mL AEMJ didn’t. Incubation with MJP or AEMJ decreased MMP-1 and increased the procollagen production, and alleviated the UVA-induced collagen degradation. The results showed that the mulberry extract may alleviate the UV-induced reduction of cell viability and the collagen loss by activating antioxidative enzymes to decrease the oxidative stress. The potential for mulberry to attenuate UV-induced oxidative stress and to protect skin from photoaging is supported.
Key words: mulberry, ultraviolet radiation, ROS, collagen, skin fibroblast
目錄
誌謝 ...i
中文摘要 ... ii
ABSTRACT ... iii
目錄 ... v
圖目錄 ... vii
表目錄 ...ix
第一章 引言... 1
第二章 文獻探討... 2
第一節 皮膚光老化... 2
(1) 皮膚自然老化與光老化 ... 2
(2) 皮膚構造 ... 2
(3) 紫外光與皮膚損傷 ... 3
(4) 老化機制 ... 3
第二節 桑椹... 12
(1) 保健功效 ... 12
(2) 機能性成分 ... 12
第三章 材料與方法 ... 13
第一節 實驗目的與架構... 13
(3) 實驗藥品與試劑 ... 18
(4) 實驗儀器設備 ... 19
(5) 統計分析 ... 20
第三節 實驗方法... 21
(1) 總花青素含量測定 ... 21
(2) 抗氧化能力測定 ... 22
(3) 抑制酪胺酸酶活性測定 ... 25
(4) 細胞試驗 ... 26
第四章 結果與討論 ... 33
第一節 總花青素含量測定... 33
第二節 抗氧化能力測定... 34
(1) 清除 DPPH 自由基能力測定 ... 34
(2) ORAC 值 ... 35
第三節 酪胺酸酶活性之抑制... 38
第四節 細胞試驗... 40
(1) 細胞接種量標準曲線 ... 40
(2) 樣品之細胞毒性 ... 40
(3) UVA 強度試驗 ... 44
(4) 桑椹汁及其粗萃物對紫外光刺激細胞保護功效評估 ... 47
第五章 結論... 62
第六章 參考文獻... 63
圖目錄
圖一、一位六十九歲的男性，已經開了 28 八年的貨運卡車，左臉皺紋較明顯且皮
膚鬆垮。 ... 5
圖二、皮膚大致上可分為表皮層、真皮層、和皮下組織 。表皮層主要由角質細胞 所組成，黑色素細胞位於表皮層的基底層。 ... 6
圖三、年輕肌膚 (younger skin) 與老化肌膚 (older skin) 比較圖。年輕肌膚的真皮 層 (dermis) 有較健康的膠原蛋白，而老化肌膚之真皮層中膠原蛋白被 降 解 而 減 少 且 不 完 整 ， 無 法 提 供 足 夠 支 撐 力 而 使 表 皮 形 成 皺 紋 (wrinkles)。 ... 7
圖四、皮膚組成及紫外線穿透示意圖。 ... 8
圖五、活性氧類。 ... 9
圖六、抗氧化酵素降低氧化壓力機制及含養活性物質傷害細胞機制。 ... 10
圖七、UV 造成皮膚光老化之路徑示意圖。 ... 11
圖八、實驗架構。 ... 14
圖九、桑椹汁凍乾粉末製備流程。 ... 16
圖十、桑椹汁花青素粗萃取製備流程。 ... 17
圖十一、Trolox standards 螢光衰減圖。Blnk 之螢光值迅速衰減，而 500μM trolox 溶液則到時間結束螢光依然無明顯衰減。 ... 36 圖十二、序列稀釋之 MJP 螢光衰減圖。Blnk 之螢光值迅速衰減，而 1000 μg/mL MJP
圖十四、細胞數與 MTT 存活率試驗之 570 nm 吸光值。 ... 41
圖十五、MJP 對人類皮膚纖維母細胞毒性試驗。 ... 42
圖十六、AEMJ 對人類皮膚纖維母細胞毒性試驗。 ... 43
圖十七、不同強度 UV 照射後皮膚纖維細胞之存活率。 ... 45
圖十八、不同強度 UV 照射後皮膚纖維細胞之 ROS 相對產量(%)。 ... 46
圖十九、人類皮膚纖維母細胞與 MJP 培養後於 UVA 照射之存活率。 ... 53
圖二十、人類皮膚纖維母細胞與 AEMJ 培養後於 UVA 照射之存活率。 ... 54
圖二十一、人類皮膚纖維母細胞與 MJP 或 AEMJ 培養後之 ROS 相對產量(%)。 55 圖二十二、人類皮膚纖維母細胞與 MJP 或 AEMJ 培養後於 UVA 照射之 ROS 相對 產量(%)。 ... 56
圖二十三、人類皮膚纖維母細胞與 MJP 或 AEMJ 培養後於 UVA 照射之 SOD (U/mg protein)。 ... 57
圖二十四、人類皮膚纖維母細胞與 MJP 或 AEMJ 培養，再於 UVA 照射後，細胞 中 procollagen (mg/mL)含量。 ... 58
圖二十五、人類皮膚纖維母細胞與 MJP 培養，再以 UVA 照射後，細胞培養液中 procollagen (ng/mL)之含量。 ... 59
圖二十六、人類皮膚纖維母細胞與 AEMJ 培養，再以 UVA 照射後，細胞培養液中 procollagen (ng/mL)之含量。 ... 60
圖二十七、於含不同濃度 MJP 之培養液中培養後，人類皮膚纖維母細胞中 MMP-1 表現量。 ... 61
表目錄
表一、桑椹汁與桑椹汁花青素萃取物之花青素含量。 ... 33
表二、桑椹汁與桑椹汁花青素萃取物和 Trolox 之 DPPH 清除清除力。 ... 34
表三、MJP 對酪胺酸酶之抑制。 ... 39
表四、不同 UVA 強度照射下細胞之存活率和 ROS 相對產量。 ... 44
第一章 引言
「歲月的痕跡」常被用來當作皮膚皺紋的代稱，可見人類在逐漸衰老的過程 中，幾乎無人能免於皮膚產生皺紋與變得鬆垮，歲月是皮膚無法抵擋的最大敵人；
然而除了年歲增高之外，生活中若是過度曝曬於陽光中，也會使皮膚加速老化，
皮膚被紫外線刺激而出現加速老化的症狀，就稱為光老化 (Kligman et al., 1986)。
皮膚光老化最重要的特徵為產生皺紋、皺紋增多且加深和黑色素累積，嚴重甚至 可能導致惡性黑色素瘤等病症。陽光中的紫外線會刺激皮膚真皮層之纖維細胞，
導致其氧化壓力提高，啟動一連串訊息傳遞路徑而使膠原蛋白產量減少，並加速 細胞間基質的膠原蛋白降解，使真皮層基質對皮膚支撐力下降，無法維持平滑表 面，因而產生皺紋。為減緩光老化，除了日常對皮膚外在的物理或化學防護，亦 可補充抗氧化物質，提升細胞抗氧化力。桑椹富含花青素，為台灣常見水果中抗 氧化力最強者之一，可降低細胞內被紫外線刺激而生成的活性氧物質，減緩其引 發的訊息傳導。本研究室曾指出桑椹花青素能藉由提升細胞內抗氧化酵素活性，
而達到對 C6 大鼠神經保護之功效。本研究藉由細胞模式，探討桑椹汁對人類真皮 纖維母細胞之抗氧化力提升，及對紫外線引起之光老化保護功效。
第二章 文獻探討
第一節 皮膚光老化
(1) 皮膚自然老化與光老化
Gordon & Brieva (2012) 以一張照片解釋自然老化與光老化之差異 (圖 一)。照片中是一位 69 歲的男性，已經開了 28 年的貨運卡車，其左臉與右臉 分別可以做為光老化與自然老化之實例。男子的右臉是自然老化的結果，皺 紋較細且紋路較淺，然而由照片可清晰看出，左臉皺紋之紋路相當深而明顯，
且眼周及臉頰皮膚鬆垮，其皮膚皺紋與鬆弛的情況使得若單看左臉，彷彿比 實際年齡更老的多 (Gordon & Brieva, 2012)。隨著歲月增長，自然代謝產生的 ROS (reactive oxygen species) 增加，使皮膚細胞內的氧化壓力提高而引發訊息 傳遞路徑，對真皮層細胞基質中膠原蛋白同時抑制生成並促進降解，造成膠 原蛋白減少，皮膚表面不均而產生皺紋，這個現象即為自然老化 (Vaillant &
Callens, 1996)。光老化則是因為環境中尤其來自陽光之紫外線刺激皮膚，使皮 膚內 ROS 增加，最終同樣造成膠原蛋白減少。自然老化與光老化除了引發皮 膚真皮層中纖維母細胞 ROS 增加的原因不同外，造成皮膚老化現象之機制類 似，因此光老化之研究不僅可針對皮膚受到陽光中紫外線危害而產生的徵 狀，也可以紫外光作為刺激，加速引發老化現象，作為老化的研究模式 (Rittié
& Fisher, 2002)。
(2) 皮膚構造
皮膚是人體最大的器官，具有隔離外界環境的保護作用，並為影響外貌 的 重 要 因 素 ( 周 燕 輝 ， 1977) 。 皮 膚 大 致 可 分 為 三 部 分 ， 分 別 為 表 皮 (epidermis) 、真皮 (dermis) 和皮下 組織 (subcutaneous tissue) (Shai et al.,
素可保護真皮以免受到紫外線更嚴重之傷害 (圖二)。表皮層底下為真皮層，
主要由纖維細胞 (fibroblast) 和細胞基質 (matrix) 所組成 (圖三)。膠原蛋白 (collagen) 是細胞基質的主要成分之一，為皮膚提供支撐力，使皮膚表面光滑 飽滿 (Brincat et al., 2005)。老化皮膚中，較高的氧化壓力會使膠原蛋白被降 解，而使真皮層細胞基質中膠原蛋白減少並結構不完整，無法提供表皮足夠 支撐力，使得皮膚表面不平整，也就是老化皮膚之鬆弛、皺紋的特徵。
(3) 紫外光與皮膚損傷
日常生活中皮膚接觸到陽光中的紫外線 (ultraviolet, UV) 主要由 UVA 與 UVB 組成。UVB 波長範圍為 275~320，是波長較短強度較強之射線，但其到 達地表前大部分都已被臭氧層所吸收，只有不到 2%能達到地球表面，穿過透 明玻璃也會被部分吸收。UVB 雖量少，但其光子活性較高，對皮膚之傷害而 言，為造成皮膚曬傷之主要因素，然而因其對皮膚穿透力較低，只能達到表 皮層，非造成真皮層細胞損傷之主要因素。而 UVA 波長範圍為 320~400，雖 然波長較長，光子強度較低，但日光中絕大多數之 UVA 可通過臭氧層到達地 表，且其穿透力強可達到真皮層 (圖四)。人類皮膚真皮層主要由纖維母細胞 與胞外基質組成，提供皮膚支撐力與維持其光滑平整。UVA 會刺激真皮層的 纖維細胞，造成其 ROS 增加，氧化壓力提升，而引發訊息傳遞路徑，最終造 成膠原蛋白流失。因此 UVA 為光老化之主要因素，對皮膚之影響力不容忽視，
並為本次試驗中刺激細胞所使用的紫外光波段 (Krutmann & Gilchrest, 2006)。
(4) 老化機制
A. ROS
氧氧 (oxygen) 是維持生命所需的重要分子，以安定的三態氧 (triplet state oxygen, 3O2) 存在於大氣中。每種分子外圍通常都有偶數電子，然而一旦產生 不成對電子，便失去原有的穩定性而成為自由基。自由基外圍不成對電子之 高活性來自易從週遭搶奪其他分子之電子，得到電子後的自由基雖變得較穩
連鎖反應 (free radical chain reactions)。氧在代謝過程中經由電子轉移及能量 轉移兩種途徑的活化成為反應性較強的含氧分子，稱為活性氧 (activated oxygen)。其中有些活性氧具不成對電子，稱為氧自由基 (oxy radicals)。氧自 由基和其他非自由基活性氧合稱為具反應性含氧物種 (reactive oxygen species, ROS)。體內生成之主要 ROS 包括單態氧 (singlet oxygen, 1O2)、超氧自由基 (superoxide radical, O2•¯)、羥基自由基 (hydroxyl radical, • OH) 及過氧化氫 (hydrogen peroxide, H2O2) (圖五) (蔡，2006 )。皮膚暴露於日光中時，UVA 會 刺激皮膚纖維細胞使其代謝過程中產生之 ROS 增加，經一連串訊息傳遞路徑 最終將導致膠原蛋白降解並抑制其生成 (Rittié & Fisher, 2002)。
過量之 ROS 一般可被細胞內之抗氧化酵素如 Superoxide Dismutase (SOD)、catalase、glutathione 代謝掉而減緩細胞損傷 (圖六)，本研究也將進行 細胞試驗，針對桑椹及其花青素粗萃物是否能提升細胞內氧化酵素活性，評 估其對 UV 造成細胞氧化壓力提升之保護潛力。
B. 訊息傳遞路徑
如圖六，UVA 穿透皮膚表皮層，刺激真皮層纖維母細胞，造成細胞內 ROS 增加，氧化壓力提升而引發訊息傳遞路徑，最終使轉錄因子(activating protein, AP)-1 活性提升，增加基質蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMP)-1 表現。
MMP-1 是一種膠原蛋白酶，會降解膠原蛋白。因此細胞受 UV 刺激生成之 ROS 越多，MMP-1 表現越高，越能促進膠原蛋白降解。另一方面，當皮膚暴露於 日光中，UV 會抑制人類皮膚纖維細胞之細胞膜上轉化生長因子 (transforming growth factor, TGF)-活性。TGF-與第一型原膠原蛋白 (procollagen I) 生成 有關，其活性被 UV 抑制後將導致 procollagen I 生成量降低，使膠原蛋白生成 減少 (Rittié & Fisher, 2002)。
由以上訊息傳遞路徑可知皮膚經日光曝曬，膠原蛋白被加速降解同時抑 制生成。皮膚真皮層之纖維細胞受 UV 反覆刺激，最終導致真皮層基質中膠
圖一、一位六十九歲的男性，已經開了 28 八年的貨運卡車，
左臉皺紋較明顯且皮膚鬆垮。
Fig. 1. A 69-year-old man had driven a delivery truck for 28 years.
The wrinkle on his left face is obvious and the skin is not tight.
(Gordon & Brieva, 2012)
圖二、皮膚大致上可分為表皮層、真皮層、和皮下組織 。表皮層主要由角質細 胞所組成，黑色素細胞位於表皮層的基底層。
Fig. 2. Skin contains three parts, including epidermis, dermis, and subcutaneous tissue. Epidermis majorly constructed by keratinocyte, and melanocyte locates at the basal layer of epidermis.
http://www.melblok.com/hyperpigmentation.php
圖三、年輕肌膚 (younger skin) 與老化肌膚 (older skin) 比較圖。年輕肌膚的真 皮層 (dermis) 有較健康的膠原蛋白，而老化肌膚之真皮層中膠原蛋白被降解而 減少且不完整，無法提供足夠支撐力而使表皮形成皺紋 (wrinkles)。
Fig. 3.The difference between younger and older skin. The dermis of younger skin is constructed by healthier collagen, while the collagen in dermis of older skin were degraded and became incomplete, were not able to support the epidermis, result in wrinkled skin.
http://www.perfectlyyounger.com/content/Wrinkle_Reduction.htm
圖四、皮膚組成及紫外線穿透示意圖。
Fig. 4. Depth of UV rays and the structure of skin.
http://www.dermatology.ca/skin-hair-nails/skin/%20photoaging/#!/skin -hair-nails/skin/photoaging/what-is-photoaging/
圖五、活性氧類。
Fig. 5 . Reactive oxygen species (ROS).
http://www.biotek.com/assets/tech_resources/ROS%20Application%20Guide.pdf
圖六、抗氧化酵素降低氧化壓力機制及含養活性物質傷害細胞機制。
Fig. 6. The mechanism of oxidative enzyme and cellular damage.
(Morón and Castilla-Cortázar, 2012)
圖七、UV 造成皮膚光老化之路徑示意圖。
Fig. 7. UV-induced signaling cascade.
(Rittié & Fisher, 2002)
第二節 桑椹
桑椹 (Morus alba) 是小型落葉喬木，原生於中國北部，廣植於世界各地。
桑葉可用於養蠶，其嫩枝、根及果實也可入藥。其果實即為桑椹，初生時為 白色，成熟後轉紅，隨熟度增加果實轉為深紫色 (Wu et al., 2013)。
(1) 保健功效
在先前的研究中，桑椹被證實具有多種生理活性，包含抗氧化 (Liu et al., 2008)、抗血栓 (Chen et al., 2005)、抗發炎 (Lin and Tang, 2008) 和神經保護功 效 (劉威廷，2010)。
(2) 機能性成分
桑椹富含維生素 C 和酚類物質如花青素，為台灣常見水果中抗氧化力最 高的水果種類之一 (陳彩雲，2005)。花青素為桑椹顏色之主要來源，並為桑 椹之主要活性成分 (Oki et al., 2006)。
花青素是一種抗氧化物質，其生理活性之主要機制為降低細胞氧化壓 力。外界物質刺激體內細胞產生 ROS，ROS 會造成 DNA 損傷，並啟動多種 發炎路徑，為各種疾病之潛在因素。花青素可藉由提高細胞抗氧化酵素活性，
或消耗活性氧物質，降低細胞氧化壓力而達到保護功效 (Seeram, 2008)。
第三章 材料與方法
第一節 實驗目的與架構
實驗架構如圖八。本實驗目的為評估桑椹汁及其花青素萃取物對 UVA 造 成人類皮膚纖維母細胞光老化之保護功效。以桑椹汁及其花青素粗萃物為原 料，實驗大致上可分為三個主要部分。第一部分為測定桑椹汁及其花青素粗 萃物的抗氧化物質含量，如總花青素含量測定。第二部分則進行抗氧化力試 驗及抗酪胺酸酶活性試驗，以評估其抗氧化活性及抑制黑色素生成之潛力。
第三部分則以人類皮膚纖維母細胞進行細胞試驗，評估桑椹汁及其花青素粗 萃物對其光老化之保護功效。細胞以添加桑椹汁及其花青素粗萃物之培養液 培養一天後進行 UV 照射，並測定其存活率、氧化壓力、膠原蛋白含量、抗 氧化酵素、及基質金屬蛋白酶表現。
圖八、實驗架構。
Fig. 8. Protocol of experiments.
第二節 實驗材料
(1) 實驗原料
試驗使用之桑椹為台農 19 號，其凍藏果實於 102 年八月購自桑樂實業有限公 司，花蓮，台灣。
A. 桑椹汁製備
購入之桑椹為當年採收之果實，經冷凍貯藏，然後於 102 年 11 月製成桑 椹汁凍乾粉末。製備流程如圖九。冷凍桑椹果實置於冷藏庫中解凍一晚後，加 入相當於果實重量 1/3 之去離子水，以果汁機均質。所得之果泥以豆漿布過濾 除渣後，於 4°C 下轉速 8000g 離心五分鐘得桑椹果汁。所得桑椹果汁於-20°C 冷凍一夜後進行冷凍乾燥，得桑椹汁凍乾粉末 (mulberry juice powder, MJP) (Skrede et al. 2000)。
B. 桑椹汁花青素粗萃液製備
製備流程如圖十，花青素粗萃物由桑椹汁凍乾粉末以去離子水回溶後，經 固相萃取管柱 (solid- phase extraction, SPE) 分離取得。SPE 管柱先以甲醇活 化，注意操作全程液面均不低於管柱填充物，再加入去離子水。秤取桑椹汁凍 乾粉末 2.5 g 以 20 mL 去離子水回溶後，接著甲醇後的去離子水加入管柱。待 液面降至接近管柱填充物時，以共 40 mL 去離子水進行沖提，去除萃取液雜 質。接著以共 40 mL 含 0.1% HCl 的酸化甲醇進行沖提，並以褐色濃縮瓶收集 沖提液。沖提液經減壓濃縮移除甲醇，以適量去離子水回溶後移至褐色樣品 瓶，冷凍乾燥後即得桑椹汁花青素粗萃物 (Mazza et al., 2004)。
圖九、桑椹汁凍乾粉末製備流程。
Fig. 9. The production of mulberry juice powder (MJP).
圖十、桑椹汁花青素粗萃取製備流程。
Fig. 10. The production of anthocyanin extract from mulberry juice (AEMJ).
(2) 實驗細胞
人類皮膚纖維母細胞 (CCD-966SK, Human skin fibroblast)，購自生物資源 保存及研究中心，食品工業研究所，新竹，台灣。
(3) 實驗藥品與試劑
Bio-Rad Laoboratories (Richmond, VA, USA) Bio-Rad protein assay dye reagent
biowest (Miami, FL, USA) Fetal bovine serum, FBS Trypsin
Cayman chemistry company (Ann Arbor, MI, USA) GSH assay kit
SOD assay kit
GIBCO (Grand Island, NY, USA)
Minimum Essential Medium Alpha, MEM-
Penicillin streptomycin, Pen Strep Merck KgaA (Darmstadt, Germany)
Hydrochloric acid, HCl Methanol
Sodium chloride, NaCl Sulfuric acid, H2SO4
Tween-20
Sigma (St. Louis, MO, USA)
2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride, AAPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, DPPH
Dimethyl sulfoxide, DMSO
Disodium hydrogen phosphate, Na2HPO4
Potassium acetate, CH3COOK Potassium chloride, KCl
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4
Sodium acetate, C2H3NaO2
Sodium bicarbonate, NaHCO3
Sodium carbonate, Na2CO3
Sodium fluorescein, FL Sodium hydroxide, NaOH
Sodium phosphate dibasic, Na2HPO4
Trypan blue Tyrosinase
Takara (Otsu, Japan)
Procollagen type I C-peptide EIA kit 林純製藥 (Osaka, Japan)
Aluminium nitrate, Al(NO3)3
Carbonate (NaHCO3) 景明化工 (苗栗, 台灣) Ethanol
Methanol
(4) 實驗儀器設備
-20°C refrigerator (CH-401, 進信, 台北, 台灣) Autoclave (HL-341, 雙鷹, 台北, 台灣)
Balance (HR-200, A&D, San Jose, CA, USA)
CO2 incubator (Model 310, Thermo Fisher Scientific Inc., Watham, MA, USA) Discovery® DPA-6S SPE Tube (SUPELCO, St. Louis, MO, USA)
Electric multichannel pipettor (pipetman Cx8x300, Gilson, Middleton, WI, USA) Inverted light microscope (Eclipse TE300, Nikon, Tokyo, Japan)
Laminar flow (炬安, 台北, 台灣)
Microplate spectrophotometer (Epoch, Biotek, Australia) Mili-Q-ultrapure water system (Milipore, Bedford, MA, USA) Orbital shaker (TS-500, 祥態, Taipei, Taiwan)
pH meter (HI 9017, Hanna instruments, fondata, Italy)
Photomicroscope system (CoolPix 990, Nikon, Tokyo, Japan)
Pipetting-aid (Matrix, Themo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) Pipettor (pipetman P, Gilson, Middleton, WI, USA)
Reciprocating shaker bath (BT-15D, 盛隆實業, 台灣) Ultra high speed centrifugatoe (Hitachi, Japan)
Ultra-low temperature freezer (MDF-U6086S, Sanyo, Torrance, CA, USA) UV/VIS spectrophotometer (Helios Alpha, Spectronic Unicam, Cambridge, UK)
(5) 統計分析
實驗結果以 SAS v 9.2 版 (SAS Institute Inc., Cary, NY, USA)軟體執行統計 分析，以 one-way ANOVA 判定有無差異性，再以鄧氏新多變預測驗法 (Duncan’s New Multiple Range Test) 檢定兩兩之間是否有顯著差異，以 p<0.05 作為有顯著性差異之標準。
第三節 實驗方法
(1) 總花青素含量測定
原理
以花青素在不同 pH 值下吸光值差異，計算得花青素含量。
試劑配製
pH1.0 buffer:
0.2M KCl + 0.2N HCl (25:67,v/v)
0.2M KCl: 0.7455 g KCl + 500 mL 去離子水
0.2N HCl: 取 8.3 mL 12N HCl 加入適量去離子水，再水定容至 500 mL pH4.5 buffer:
1N Sodium acetate + 1N HCl + dH2O (100:60:90, v/v)
1M Sodium acetate: 取 8.203 g 以去離子水溶解並定容至 100 mL 1N HCl: 取 41.7 mL 12N HCl 加入適量去離子水，再定容至 500 mL 實驗步驟
秤取 Mulberry Juice Powder (MJP)和 Anthocyanin extract form Mulberry Juice (AEMJ)各 5 mg，以 1.2 mL 去離水回溶後，各取 500uL，分別以 pH1.0 buffer 和 pH4.5 buffer 定量至 100 mL 與 50 mL，以分光光度計測定 520 nm 吸光值分 別 得 A1 (pH1.0) 和 A2 (pH4.0) ， 帶 入 下 列 公 式 即 可 求 得 總 花 青 素 含 量 (mg/mL) 。此方法參照 Cheng & Breen (1991)。
Total anthocyanin (mg/mL) = ((A1 x F1 –A2 x F2) x (1000/V) x MW)/
F1和 F2pH1.0 buffer 和 pH4.0 稀釋體積，分別為 100 mL 和 50 mL
V: 樣品體積(0.5 mL)
MW:花青素標準品分子量，如 cyanidin-1-glucoside 為 484g/mol
: 花青素之莫耳吸光係數(2.96 x 104)
(2) 抗氧化能力測定
A. 清除 DPPH 自由基能力測定
原理
DPPH•+AH→ DPPH+HA•
DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 為深紫色之自由基物質，在 517nm 有較 高吸收。抗氧化劑 (上式中 AH) 能提供氫離子，抑制自由基之單電子進行氧 化鏈鎖反應，而得到氫離子後的 DPPH 顏色由深紫轉為淡黃，因此測定 517nm 吸光值，越低代表樣品對 DPPH 清除效果越佳 (沈 et.al., 2010)。
試劑配製
1.5 mM DPPH stock (-20°C 保存一週) 秤取 0.0059 g DPPH，溶於 10 mL 甲醇 20 mM trolox stock
秤取 0.015 g trolox，溶於 3 mL 乙醇 20 mM ascorbic acid stock
秤取 0.0352 ascorbic acid。溶於 10 mL 去離子水
實驗步驟
Mulberry Juice Powder (MJP) 和 Anthocyanin extract form Mulberry Juice (AEMJ) 以去離子水回溶後，配成序列濃度。從 20 mM trolox stock 中取 100 μL 至 9.9 mL 去離子水中，得 200 μM trolox，再對半稀釋五個濃度製作標準曲線。
於 96well 中，加入樣品或標準品 50uL，再加入 150uM 之 DPPH，等待反應 30 分鐘或至顏色穩定。DPPH 為紫色之物質，被抗氧化物質還原後顏色由紫 轉為淡黃色，測定 570nm 之吸光，對照標準曲線求 IC50值。此方法參照 Saha et al. (2004)。
B. ORAC 值
原理
ORAC (oxygen radical absorbance capacity) 值又稱抗氧化能力指數，為利用 2,2’-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) 產生自由基使螢光消 失，而抗氧化物質能減緩螢光消失速率，最後以螢光分光光度計記錄吸光曲 線，計算曲線下面積對照標準品 Trolox 得總抗氧化能力值，抗氧化能力以 µmole Trolox 當量/克表示 (鄭，2011)。
試劑配製
Phosphate buffer (75 mM, pH7.4)
秤取 2.338 g sodium phosphate monobasic 和 15.56 g sodium phosphate dibasic 溶於適量去離子水後定量至 1 L
Trolox stock solution (20 mM)
秤取 25 mg Trolox 溶於 5 mL 乙醇，分裝避光-20°C 保存。
AAPH (400 mM)
每次使用新鮮配製。秤取 542.4 mg AAPH 溶於 5 mL phosphate buffer。
FL solution
Srock A: 0.0119 g Sodium fluorescein (FL) 溶於 10 mL phosphate buffer。
Stock B: 從 Srock A 取 200 μL 以 phosphate buffer 定量至 100 mL。
新鮮配製: 從 Srock B 取 200 μL 以 phosphate buffer 定量至 40 mL。
實驗步驟
此法參照鄭 (2011)。從 trolox stock solition (20 mM) 取 100 μL，加 9.9mL phosphate buffer 配 成 20 μM 標 準 品 。 Mulberry Juice Powder (MJP) 和 Anthocyanin extract form Mulberry Juice (AEMJ) 以 phosphate buffer 回溶後，
配成序列濃度。於黑盤 96well 中，加入樣品或標準品 20 μL，接著避光加入 200 μL 之 FL solution，靜置 30 分鐘，等待期間先將螢光偵測儀設定完畢。30 分鐘後接著加入 10 μL 之 AAPH，立刻於螢光偵測儀以 485/538 之激發/發散 波長測定其螢光強度。0 分鐘時測定為第零次，接下來兩分鐘測定一次，直至 螢光強度降至底線。結果換算至單位μmolTE/g dry weight。
計算:
起始點螢光強度: fo 各時間點螢光強度: fi 相對螢光直: fi/fo
AUC (Area under curve) = 0.5+f1/fo+f2/f0+…+f34/fo+0.5(f35/f0) 標準曲線: AUCtrolox - AUCblank= net AUC trolox
計算所得之 net AUC trolox與其濃度作圖，可得標準品的線性回歸方程式 y=ax+b ORAC (μmolTE/gDW) = ((net AUC trolox - b)/a)/sample dilute
(3) 抑制酪胺酸酶活性測定
原理
酪胺酸酶會將多巴 (L-3,4-dihydroxyphenylalanine, L-dopa) 轉變成黑色素，在 波長 475 nm 有較高吸光值。藉由樣品抑制酪胺酸酶活性，再加入 dopa 使酪 胺酸酶將之轉化為黑色素，測定 475 nm 吸光值，經計算後可知樣品抑制酪胺 酸酶活性能力 (Tomita et al., 1990)。
實驗步驟
此法參照 Tomita et al. (1990)。Mulberry Juice Powder (MJP)和 Anthocyanin extract form Mulberry Juice (AEMJ)以 buffer 回溶後，配成序列濃度。於 96well 中，避光下加入樣品或標準品 20 μL，與 40 μL 之 tyrosinase，靜置 10 min，再 加入 20 μL 之 dopa，靜置 20min。測 475 nm 吸光。計算抑制能力以百分率表 示：
(A-A0)-(B-B0)/(A-A0)×100%
A：為空白組所得之吸收值 A0：為空白組背景值
B： 為實驗組或對照組所得之吸收值 B0：為實驗組或對照組背景值
(4) 細胞試驗
試劑配製
(以下藥品為細胞級試劑)
Phosphate buffer saline, PBS
8g NaCl, 1.15g Na2HPO4, 0.2g KH2PO4, 0.2g KCl, 取適量去離子水溶解後 定量到 1L。
Minimum Essential Medium Alpha, MEM-
取一包可配製 1 L MEM-粉末，以適量現取去離子水溶解並加入 1.5g NaHCO3後定量至 1 L，以 6N HCl 調整酸鹼值至 pH 7.3，經 0.22 m 濾杯 過濾後添加 10% FBS 與抗生素。
MTT stock solution
秤取 0.1g MTT 溶於 50mL PBS，溶解後以 0.22m 濾膜過濾避光保存。
DCFDA stock solution (10 mM)
秤取 50 mg 2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate + 1026 μL dH2O
細胞凍管活化
人類皮膚纖維母細胞 (human skin fibroblast) CCD-966SK (BCRC no.60153) 購 自食品工業發展研究所生物資源保存及應用中心 (新竹，台灣)。購得之凍管 先保存於-80°C 冰箱中，三天內活化，否則置於液態氮桶中做長期保存。
先取一新的 10 公分 dish，寫上細胞名稱、代數與日期後，加入 9 mL 新鮮培 養液，並將此 dish 放置於含 5% CO2，具充分濕度之 37℃培養箱中，使因保 存期間提高之培養液 pH 值降回正常範圍。另準備一 15 mL 離心管，添加約 5 mL 之培養液後插冰預冷。接著從-80°C 冰箱中取出凍管，於 37℃水域槽內搖
細胞培養
人類皮膚纖維母細胞 CCD-966SK (human skin fibroblast) 於含不去補體之 10% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 之培養液 Minimum Essential Medium Alpha (MEM-)中，培養於含 5% CO2，具充分濕度之 37℃之培養箱。
細胞繼代
細胞於 10 公分 dish 中培養至九分滿時，進行繼代培養 (subculture)。吸除上 層培養液後以 5 mL PBS 緩衝液清洗細胞兩次。每盤加入 1 mL trypsin，搖勻 靜置一分鐘後吸除，於 37℃培養箱培養三分鐘。等待期間先取新的 10 公分 dish，寫上細胞名稱、代數與日期後各加入 9 mL 新鮮培養液。細胞經 trypsin 作用後以顯微鏡確認已離盤，每盤以 3mL MEM-打下並打散細胞，相當於 1:3 之比例，均勻分配至三盤已添加 9 mL 培養液之培養皿。
細胞凍管
因本研究所使用之 CCD-966sk 細胞株為正常細胞，為確保實驗之細胞代數相 近，且不因為代數過高導致細胞老化而使細胞表現改變，購買之新細胞凍管 活化培養繼代三至六代後製作凍管。細胞於 10 公分 dish 中培養至九分滿時即 可製作凍管，原則上一盤凍一管。
事先將冷凍小管寫上細胞名稱、代數、培養液種類、日期、和製作凍管者姓 名，並準備漸凍盒與一盒碎冰。計算所需培養液及占培養液 7% (v/v) 之 DMSO，以離心管將一半培養液預先與 DMSO 混和後插冰預冷。吸除細胞上 層培養液後以 5 mL PBS 緩衝液清洗細胞兩次，每盤加入 1 mL trypsin，搖勻 靜置一分鐘後吸除，於 37℃培養箱培養三分鐘。以另一半不含 DMSO 之培養 液將細胞打下並打散，與預冷之含 DMSO 培養液混和均勻後移入冷凍小管 中，並迅速插冰。細胞全數移入凍管後，將凍管置入漸凍盒中，移入-80°C 冰 箱中慢速冷凍，三天後即可移入液態氮桶中長期保存。
A. 細胞接種量標準曲線
在以不同樣品處理細胞以測試樣品毒性之前，先以 MTT assay 建立細胞 濃度標準曲線以確認最適細胞接種量。
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 呈色 法常用於檢驗細胞之生長。活細胞內粒腺體中的琥珀酸去氫脢 (succinate dehydrogenase) 將 MTT 中的 tetrazolium 還原為藍紫色產物 formazan，因此 formazan 之形成量與活細胞數目呈正比 (Mosmann, 1983)。
此法參照 Ni & Hollander (1996)。將細胞以培養基配成不同細胞量，接種 於 96well 中培養一天待其貼盤。吸除上清後，避光加入 125 μL MTT 試劑 (500 μg /mL) 培養 3.5 h。吸除試劑，加入 100 μL DMSO 將細胞內藍紫色產物 formazan 溶出，輕拍使其均勻後，以 ELISA reader 測定 570 nm 吸光值。以各 細胞濃度與相對吸光值繪圖，可得細胞量之標準曲線。後續以 96 well 進行之 實驗，其吸光值必須落在此圖之線性範圍內方為有效細胞量。
B. 樣品對細胞之生長與毒性試驗
為確認樣品對細胞是否有毒性，以 MTT assay 測試不同濃度樣品培養細 胞 24h 後之細胞存活率。
細胞以濃度 1x104/200 μL 接種於 96well 中培養一天待其貼盤。吸除上清 後，避光加入以培養液調整濃度之 MJP 與 AEMJ 再培養 24h。吸除培養液後，
避光加入 125μL 500 μg/mL MTT 試劑培養 3.5h。吸除試劑，加入 100μL DMSO，輕拍使其均勻後，測 570nm 吸光值 (Ni & Hollander, 1996)。
確認吸光值落在標準取曲線之線性範圍內，以各濃度吸光值除以無加樣之 吸光值後乘以 100%，即可得到細胞存活率。
C. 最適 UVA 強度試驗
為使細胞在 UVA 照射後能顯著造成氧化壓力提升，測試不同 UVA 強度 照射後之 ROS 提升及細胞存活率。參考歐陽 (2012)，細胞以培養液調整濃度 為 1x104/200 μL，接種於黑盤及透明之 96well 中各四盤，培養一天待其貼盤。
吸除培養液，以 50 μL PBS 洗兩遍，再加入 50μL PBS，一盤不照射當對照組，
剩餘三盤分別照射不同劑量 UVA。
四盤透明盤，照射後吸除 PBS，加入無血清之 MEM-再培養一天，以 MTT 試驗測試其存活率 (Ni & Hollander, 1996)。
四盤黑盤則於照射後吸除 PBS，避光加入 100μL 10 μM/mL DCFDA 試劑 培養一小時，於螢光偵測儀測定其螢光強度 (Haliwell et al., 2004)。DCFDA 被 細胞內 ROS 氧化後成為螢光物質，在激發/散射波長為 485/538 nm 時可偵測 到其螢光強度 (Dooley et al., 2010)。當細胞內 ROS 越多，所偵測到之螢光強 度就越強。實驗組與對照組所得之螢光強度經下式計算，可得以無照射無加樣 組之 ROS 相對產量 (relative production, RP) 為 100%時，其餘組別 ROS 之 RP 值。
ROS (%) = (((Inx - In0) / In0) +1) x 100 無照射無加樣組之螢光強度(control ) : In0
有加樣、有照射組之螢光強度(experimental) : Inx
D. 桑椹汁及其粗萃物對紫外光刺激細胞保護功效評估
a. 存活率試驗
為評估樣品對受紫外光刺激細胞之保護能力，細胞預先和樣品一起培養 後照射紫外光，再以 MTT assay 測試存活率 (Ni & Hollander, 1996)。
細胞以培養液調整濃度為 1x104/200 μL 接種於兩盤 96well 中，24h 後吸 除上清液，避光加入含不同濃度 MJP 或 AEMJ 之培養液再培養 24h。接著以 50uL PBS 洗兩遍以去除樣品殘留而干擾，再加入 50uL PBS，一盤不照射當對 照組，另一盤則照射UVA。照射後立即吸除 PBS，加入無血清 MEM- 再培 養 24h。吸除培養液，避光加入 500 μg/mL 125 μL MTT 試劑培養 3.5h。吸除 試劑，加入 100 μL DMSO，輕拍使其均勻後，測 517nm 吸光值。確認吸光值 落在標準取曲線之線性範圍內，以各照射度與各濃度吸光值除以無照射無加 樣之吸光值後乘以 100%，即可得到細胞存活率 。
b. 細胞內氧化壓力測定
為評估樣品抑制受紫外光刺激細胞氧化壓力提升之能力，細胞預先和樣 品一起培養後照射紫外光，再測試細胞內 ROS。
細胞以含 10%FBS 之 MEM-a 調整濃度為 1x104/200 μL 接種於兩盤黑盤 96well 中，培養 24h。吸除上清液，避光加入含 MJP 或 AEMJ 濃度為 50、25、
12.5、6.25、0 μg/mL 之 MEM-，濃度 0 μg/mL 者為 control。再培養 24h 後，
以 50 μL PBS 洗兩遍，再加入 50uL PBS，一盤不照射當對照組，另一盤照射 UVA。照射後立即避光加入 100 μL 10 μM 之 DCFDA，並於 37°C 培養一小時。
以螢光 ELISA 測定激發光/散射光波長為 485/538 之螢光強度 (Haliwell et al., 2004)。實驗組與對照組所得之螢光強度經下式計算，可得以無照射無加樣組 之 ROS 相對產量 (relative production, RP) 為 100%時，其餘組別 ROS 之 RP 值。
c. SOD 活性
此試驗以桑椹汁對 UVA 照射前後皮膚纖維細胞中 SOD 活性之影響，探 討其抗細胞光老化之可能保護機制。
此法參照劉 (2010)。細胞以含 10%FBS 之 MEM-接種於 10cm dish 中，
培養一天待其貼盤。以 5 mL PBS 洗兩遍，避光加入含 MJP 或 AEMJ 濃度為 50、0 μg/mL 之 MEM-，再培養 24h。以 5 mL PBS 洗兩遍，再加入 3 mL PBS 照射 UVA，其中至少留一盤不照射當對照組。以 scraper 在 PBS 中將細胞刮 下，4°C 離心 2000xg 10 分鐘。去除上清液，加入 150 μL HEPES，以超音波 細胞破碎機震破細胞。接著 4°C 離心 1500xg 5 分鐘使用，取上清液分裝，-80°C 可保存至少六個月。以 SOD kit (cayman) 並參照其說明書步驟，測定各組細 胞之 SOD 活性。
d. 細胞原膠原蛋白 (procollagen I) 含量
此試驗測定與桑椹汁及其花青素粗萃物培養之皮膚纖維母細胞，以 UVA 照射後細胞內及細胞所分泌至培養液之 procollagen I 含量，探討其對細胞光老 化之保護。
細胞以含 10%FBS 之 MEM-接種於 10cm dish 中，培養一天待其貼盤。
以 5 mL PBS 洗兩遍，避光加入含 MJP 或 AEMJ 濃度 50、0 μg/mL 之 MEM-， 再培養 24h。以 5 mL PBS 洗兩遍，再加入 3 mL PBS 照射 UVA，其中至少留 一盤對照組。以 scraper 在 PBS 中將細胞刮下，4°C 離心 2000xg 10 分鐘。去 除上清液，加入 150 μL HEPES，以超音波細胞破碎機震破細胞。接著 4°C 離 心 1500xg 5 分鐘使用，取上清液分裝，-80°C 可保存至少六個月。以 procollagen type I C-peptide (PIP) EIA kit (TaKaRa) 測定各組細胞之 procollagen I 濃度。
此法參照歐陽 (2012)。細胞以培養液調整濃度為 1x104/200 μL 接種於兩 盤 96well 中，24h 後吸除上清液，避光加入含 MJP 或 AEMJ 濃度為 50、25、
0 之培養液再培養 24h。接著以 50uL PBS 洗兩遍，再加入 50uL PBS，一盤不 照射當對照組，另一盤則照射 UVA。照射後立即吸除 PBS，加入無血清 MEM-
e. 皮膚纖維細胞 MMP-1 表現
將細胞預先以含 MJP 之培養液培養，測定樣品對皮膚纖維細胞中 MMP-1 活性之影響，探討桑椹汁及其花青素粗萃物抗細胞光老化之可能保護機制 (Fagot et al. 2002)。
此法參照 Bae et al. (2009)。細胞以培養液調整濃度為 1x104/200 μL 接種於 兩盤 96 well 培養 24h。吸除上清液，避光加入含 MJP 濃度為 100、50、25、0 μg/mL 之 MEM-，濃度 0 μg/mL 者為 control。再培養 24h 後，收集上層培養 液，以 ELISA 測定各濃度樣品處理並照射後細胞釋放之 MMP-1 濃度。
所得 MMP-1 活性需除以上述 MTT assay 所得之細胞存活率，方得單位細 胞釋放之 MMP-1 濃度，並比較各濃度樣品處理之結果，探討桑椹汁對細胞產 生 MMP-1 之影響。
第四章 結果與討論
第一節 總花青素含量測定
以酸鹼度差額法 (Cheng & Breen, 1991) 測定桑椹汁凍乾粉末 (mulberry juice powder, MJP) 中花青素含量為 8.25 mg/g dry weight。經過 SPE 管柱初步 分離後所得之粗萃物 (anthocyanin extract from mulberry juice, AEMJ) 中花青 素含量為 126.7 mg/g dry weight。經過萃取後，AEMJ 中花青素含量約為 MPJ 之 15.4 倍 (表一)。
Jiang 等人 (2013) 分析桑椹汁及榨汁後殘渣之花青素粗萃物中花青素含 量。該試驗材料桑椹亦先以凍藏保存，經解凍、破碎、分離果汁後，所得之 上層液及殘留果渣皆以管柱 (Diaion HP 2 MGL) 分離得花青素及其他酚類物 質，以酸鹼差法測定花青素含量，發現不同品種之桑椹中花青素含量有所差 異，其中果汁部分之花青素含量分布為 24.1-150.5 mg/g，而殘渣部分為 26.3-383.5 mg/g。本試桑椹汁經粗萃後之花青素含量為 126.7 mg/g，與該文獻 比較，算是較高的品種，但也有可能是萃取管柱不同，萃取純度高低所造成 之差異。
表一、桑椹汁與桑椹汁花青素萃取物之花青素含量。
Table 1. The anthocyanin content of MJP and AEMJ.
MJP AEMJ
Anthocyanin
8.25 126.7
(mg/g dry weight)
第二節 抗氧化能力測定
(1) 清除 DPPH 自由基能力測定
DPPH 為一種自由基，當其帶有單電子時為深紫色，在 517nm 有較強吸 光；然而當抗氧化劑提供氫離子給 DPPH 後，顏色便由深紫轉為淺黃，故測 定 517nm 吸光值即可知樣品提供氫離子的能力。
MJP 清除 DPPH 的 IC50 (concentration of 50 % inhibition)為 574.56±31.38 μg/mL，而 AEMJ 為 27.31±1.96 μg/mL。IC50是清除率達 50%時所需的濃度，
越低的 IC50代表越低濃度就能達到 50%的清除能力，即是 DPPH 清除能力越 佳，抗氧化效果越佳。而將 MJP 與 AEMJ 之 DPPH 清除力與 trolox 比較換算，
可得每克 MJP 和 AEMJ 分別相當於 118.97±6.51 和 2505.97±173.06 μmol trolox (表二)。
表二、桑椹汁與桑椹汁花青素萃取物和 Trolox 之 DPPH 清除清除力。
Table 2. The DPPH scavenging activities of MJP, AEMJ, and trolox.
MJP AEMJ Trolox
IC50 (μg/mL) 574.56±31.38 27.31±1.96 17.08±0.30 μmolTE/gDW 118.97±6.51 2505.97±173.06 -
(2) ORAC 值
ORAC 值又稱抗氧化能力指數，為利用 2,2’-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) 產 生 過 氧 自 由 基 ， 自 由 基 使 螢 光 物 質 Sodium fluorescein (FL)之螢光隨時間逐漸減弱，而當有抗氧化物質存在時，可延緩螢 光物質之減弱，以螢光強度對時間作圖，可得一遞減之曲線。
將有添加 trolox (圖十一) 之曲線下面積 (Area under curve, AUC) 與 blank 之 AUC 相減可得 net AUC，將不同濃度與所得之 net AUC 作圖可得 trolox 標準曲線。樣品 (圖十二) 以相同方法測定，再對照標準曲線換算至單位為每 克乾重(dry weight, DW)相當於之 trolox 微莫耳，為 691.61 μmolTE/gDW。
圖十一、Trolox standards 螢光衰減圖。Blnk 之螢光值迅速衰減，而 500μM trolox 溶液則到時間結束螢光依然無明顯衰減。
Fig. 11. The decrease of fluorescence intensities of trolox standard. The fluorescence intensity of blank decreased quickly, while that of 500 μM trolox solution barely decreased.
圖十二、序列稀釋之 MJP 螢光衰減圖。Blnk 之螢光值迅速衰減，而 1000 μg/mL MJP 溶液則到時間結束螢光依然無明顯衰減。
Fig. 12. The decrease of fluorescence intensities of doubling dilution of MJP. The fluorescence intensity of blank decreased quickly, while that of 1000 μg/mL MJP solution barely decreased.
第三節 酪胺酸酶活性之抑制
酪胺酸酶會將多巴 (L-3,4-dihydroxyphenylalanine, L-dopa) 轉變成黑色 素，在波長 475 nm 有較高吸光值 (Tomita et al., 1990)。藉由樣品抑制酪胺酸 酶活性，再加入 dopa 使酪胺酸酶將之轉化為黑色素，測定 475 nm 吸光值，
經計算後可知樣品抑制酪胺酸酶活性能力。圖十三顯示，MJP 濃度為 500 μg/mL 時抑制率幾乎已達到最高 37.97±1.38%，濃度提升至 1000 μg/mL 時抑 制率為 38.63±2.43，無顯著提升 (表三)。可知桑椹汁雖然抗氧化能力強，但 對酪胺酸酶活性抑制能力並不明顯。
雖然前人研究指出桑椹含有豐富維生素 C (ascorbic acid)，而維生素 C 具 有良好酪胺酸酶抑制活性，但可能因為本試驗之桑椹冷凍保存過程中或凍乾 粉末製備過程中過多維生素 C 降解，導致對酪胺酸酶活性之抑制能力有限。
其詳細因素仍需進一步研究，就本試驗結果，桑椹汁凍乾粉末將不進一步進 行抑制黑色素生成之細胞試驗。
圖十三、MJP 對酪胺酸酶之抑制。
Fig. 13. Tyrosinase inhibitory effect of MJP.
表三、MJP 對酪胺酸酶之抑制。
Table 3. Tyrosinase inhibitory effect of MJP.
MJP concentration
(μg/mL) 1000 500 250 125 62.5 15.625
Tyrosinase inhibitory
effect (%) 38.63±2.43 37.97±1.38 30.89±2.81 21.48±6.71 13.4±6.42 9.33±6.18
第四節 細胞試驗
(1) 細胞接種量標準曲線
在以不同樣品處理細胞以測試樣品毒性之前，先以 MTT assay 建立細胞 濃度標準曲線以確認試驗細胞接種量。
由圖十四可看出細胞數超過 2x104後，吸光值與細胞數曲線便超過線性範 圍。然而過低之細胞數會使細胞貼盤後太稀疏而影響正常生長，因此取 1x104 為細胞接種數。
(2) 樣品之細胞毒性
首先以 MTT assay 測試樣品對人類皮膚纖維母細胞之毒性。此試驗目的 在於確認所處理的樣品濃度對細胞不會造成毒性傷害。
圖十五為各濃度 MJP 對細胞之生長與毒性試驗結果，可知除了 2000 μM 以下濃度之 MJP 不會造成細胞毒性。圖十六為桑椹汁花青素粗萃物 AEMJ 對 細胞之生長與毒性試驗結果，因 100 μg/mL 溶於培養基時使培養基顏色明顯 變為暗紫色，故最高濃度使用 50 μg/mL。由 MTT assay 之結果顯示，50 μg/mL 以下 AEMJ 各濃度對人類皮膚纖維母細胞均不造成存活率降低。
Afnan 等人 (2012) 將人類包皮纖維母細胞 (HS68) 培養於含 5-50 M 甘 草酸 (glycyrrhizic acid, GA) (相當於約 4.1-41.1 g/mL) 之培養液中 24 小時 後，測定細胞存活率。結果顯示，GA 會促進約 9-15%之細胞增生，與本試驗 中 MJP 和 AEMJ 促進人類皮膚纖維母細胞增生之結果相似 (圖十五、圖十六)。
圖十四、細胞數與 MTT 存活率試驗之 570 nm 吸光值。
Fig. 14. The absorbance at 570 nm of MTT assay on skin fibroblasts.
圖十五、MJP 對人類皮膚纖維母細胞毒性試驗。
Fig. 15. Cytotoxicity of MJP on human skin fibroblasts.
圖十六、AEMJ 對人類皮膚纖維母細胞毒性試驗。
Fig. 16 Cytotoxicity of AEMJ on human skin fibroblasts.
(3) UVA 強度試驗
以不同 UVA 強度照射細胞，測定其存活率及 ROS，以確認有照射和沒照 射的細胞之間發生差異。
DCFDA 被細胞內 ROS 氧化後成為螢光物質，再激發/散射波長為 485/538 nm 時可偵測到其螢光強度 (Dooley et al., 2010)。當細胞內 ROS 越多，所偵 測到之螢光強度就越強。實驗組與對照組所得之螢光強度經下式計算，可得 以無照射無加樣組之 ROS 相對產量 (relative production, RP) 為 100%時，其 餘組別 ROS 之 RP 值。
ROS RP (%) = (((Inx - In0) / In0) +1) x 100 無照射無加樣組之螢光強度(control ) : In0
有加樣、有照射組之螢光強度(experimental) : Inx
表四為不同 UVA 強度照射下細胞之存活率和 ROS 相對產量。可看出 UVA 強度為 5 J/cm2時，其存活率、ROS 相對產量和未照 UV 組相比已有顯著差異。
圖十七為細胞存活率，可看出隨 UVA 強度提高，細胞存活率隨之降低，但 8 和 10 J/cm2間無顯著差異。圖十八為不同強度 UV 照射後皮膚纖維細胞之 ROS 相對產量(%)，可看出隨提高 UVA 強度，ROS 相對產量(%)也跟著提高。
表四、不同 UVA 強度照射下細胞之存活率和 ROS 相對產量。
Table 4. Viabilities (%) and relative production (RP) of ROS (%) of skin fibroblasts after exposure to different intensities of UVA. (n=3, P<0.05)
UV intensity (J/cm2) 0 5 8 10
cell viability (%) 100±6.70a 87.99±4.03b 78.74±5.36c 74.92±3.28c RP of ROS (%) 100±1.31c 106.61±0.98b 109.79±4.27b 129.31±2.91a
圖十七、不同強度 UV 照射後皮膚纖維細胞之存活率。
Fig. 17. Viabilities (%) of skin fibroblasts after exposing to different intensities of UVA.
圖十八、不同強度 UV 照射後皮膚纖維細胞之 ROS 相對產量(%)。
Fig. 18. Relative production (RP) of ROS (%) of skin fibroblasts after exposure to different intensities of UVA.
(4) 桑椹汁及其粗萃物對紫外光刺激細胞保護功效評估
A. 存活率試驗
測定樣品處理後，UV 照射後之細胞內存活率，評估桑椹汁及其粗萃物保 護皮纖維母細胞抗 UV 照射傷害之功效。
細胞與 MJP 或 AEMJ 培養後，照射前先以 PBS 洗兩次，以確保其保護功 效非因花青素殘留而遮蔽紫外光照射所致。無加樣之組別照射 UV 後存活率 顯著較未照射 UV 之組別低，而預先處理 MJP 之人類皮膚纖維母細胞於 UVA 照射後存活率無顯著差異 (圖十九)。預先處理 AEMJ 之人類皮膚纖維母細胞 於 UVA 照射後存活率較未處理組高，但其存活率仍未提高至未照射 UV 組別 之存活率 (圖二十)。
Bae 等 人 (2009) 以 含 有 豐 富 花 青 素 的 bog blueberry (Vaccinium uliginosum) 萃取物 (anthocyanin-rich extract from bog blueberry, ATH-BBe) 抑 制 UVB 照射真皮纖維細胞之光老化，發現其可有效減輕 UVB 造成之細胞毒 性與 ROS 升高。該試驗結果顯示，未先與 ATH-BBe 培養之細胞，經 100 mJ/cm2 UVB 照射後，存活率降低>30%。預先與 1 mg/mL ATH-BBe 培養之細胞，其 存活率與未先與 ATH-BBe 培養者無顯著差異，而當濃度提升至 5、10 mg/mL ATH-BBe 時則皆可提升存活率至與無照射之組別無顯著差異。本試驗中細胞 先以 0.1 mg/mL MJP 培養時，即可顯著提升存活率，濃度為 1 mg/mL MJP 時 即可提升存活率至與無照射之組別無顯著差異。而以含 AEMJ 培養液培養之 組別，最高濃度只使用到 50 μg/mL，可提升存活率，但仍較無照射之組別為 低。
由上述可知，本研究中桑椹及其花青素粗萃物在以低濃度培養細胞時即 有保護功效，較文獻之 ATH-BBe 改善 UV 造成存活率降低之效果佳，支持 MJP 與 AEMJ 具有保護皮膚纖維母細胞光老化功效之假說。
B. 細胞內氧化壓力測定
此試驗結果分兩部分討論，第一部分為測定與 MJP 和 AEMJ 培養後之細 胞內 ROS 相對產量，評估桑椹汁及其花青素粗萃物降低皮膚纖維細胞氧化壓 力之功效。
DCFDA 被細胞內 ROS 氧化後成為螢光物質，在激發/散射波長為 485/538 nm 時可偵測到其螢光強度 (Dooley et al., 2010)。當細胞內 ROS 越多，所偵 測到之螢光強度就越強，也就是細胞內氧化壓力越高。實驗組與對照組所得 之螢光強度經下式計算，可得以無照射無加樣組之 ROS 相對產量 (relative production, RP) 為 100%時，其餘組別 ROS 之 RP 值。
ROS RP (%) = (((Inx - In0) / In0) +1) x 100 無照射無加樣組之螢光強度(control ) : In0
有加樣、有照射組之螢光強度(experimental) : Inx
結果顯示，有處理樣品組別之細胞內 ROS RP (%)顯著較低，指出樣品可 降低細胞內氧化壓力，增加細胞抗氧化力之潛力 (圖二十一)。
接著是此試驗之第二部分，測定與 MJP 和 AEMJ 培養之細胞經 UV 照射 後細胞內 ROS 相對產量，評估桑椹汁及其花青素粗萃物降低皮膚纖維細胞氧 化壓力之功效。同樣皆無處理樣品之細胞，有照射 UV 組別細胞內之 ROS 較 無照射者顯著高出許多。先與樣品培養之細胞經 UV 照射後，ROS 顯著較有 照 UV 而未處理樣品者低，但仍無法降低至未加樣也未照 UV 細胞之 ROS 相 對產量 (圖二十二)。
Afnan 等人 (2012) 將人類包皮纖維母細胞 (HS68) 培養於含 5-50 M 甘 草酸 (glycyrrhizic acid, GA) (相當於約 4.1-41.1 g/mL) 之培養液中 24 小時 後，以 PBS 覆蓋細胞進行 UVB 照射，接著立即以 PBS 洗兩次後加入 DCFDA 培養三十分鐘，若細胞照射後生成之 ROS 越多，則所測得之螢光強度越強。
而造成皮膚纖維細胞氧化壓力較劇烈之提升。該試驗使用 UVB 而非 UVA，作 者在文中說明，因為在 UV 的各波段中唯有 UVB 能造成生理傷害，且 UVB 被認為是環境中最強之致癌物。但 Krutmann & Gilchrest (2006) 的文獻中則提 到，UVA 的穿透力較 UVB 強，能穿透表皮刺激真皮層中纖維母細胞使其氧化 壓力提高而造成光老化。本試驗為測試桑椹花青素萃取物對皮膚光老化之保 護功效，且使用的細胞為真皮層的纖維母細胞，為使實驗條件與細胞實際所 受刺激相似，選擇 UVA 波段進行照射。本試驗中細胞經 UVA 照射後，先與 MJP 或 AEMJ 培養之組別較未處理組可降低 ROS 之增量，其中 50 g/mL AEMJ 約可降低 20%之 ROS 增量。而 Afnan 等人 (2012) 之試驗中，細胞先與 50 M GA 培養之組別可降低約 39%之 ROS 增量，可推測該試驗甘草酸對細胞氧化 壓力提升之保護效果較桑椹花青素佳。
Pacheco-Palencia 等人 (2008) 以石榴 (Punica granatum L.)多酚萃取物 (Pomegranate extract, PE) 培養人類皮膚纖維細胞，探討其對 UV 照射細胞之 保護功效。實驗結果顯示，不論是以 UVA 或 UVB 照射細胞，皆可顯著升高 ROS 相對產量，而 PE 濃度分別達到 250、100 μg/mL 時才能顯著降低由 UVA, UVB 升高之細胞氧化壓力。與其相較，本研究之 MJP 與 AEMJ 分別在濃度 12.5、6.25 時即可顯著降低其氧化壓力。由此可知，桑椹與其花青素萃取物可 降低由照射 UV 造成細胞之氧化壓力升高。
C. 細胞內抗氧化酵素活性測定
測定有處理樣品及未處理樣品之皮膚纖維細胞，經 UV 照射前後之細胞 內 SOD 活性，以推測桑椹汁及其花青素提升細胞抗氧化能力之可能機制。
試驗結果顯示，無 UV 照射時，有無處理樣品對細胞內 SOD 含量並無顯 著影響。同樣為未處理樣品的組別，有照 UV 者 SOD 活性較未照射 UV 者顯 著降低，而有預先處理過樣品之皮膚纖維細胞經 UV 照射後，SOD 活性並無 顯著改變 (圖二十三)。由結果可推測，桑椹花青素及其萃取物可能藉由提高 細胞內抗氧化酵素活性，抑制 UV 造成之氧化壓力提升。
Lyu & Park (2012) 以两歧五加 (Acanthopanax divaricatus var. albeofructus) 富 含 花 青 素 之 成 熟 漿 果 為 原 料 ， 萃 取 花 青 素 cyanidin-3-galactoside 和 cyaniding-3-lathyroside (CG & CL)，研究其對人類皮膚纖維母細胞光老化之保 護。細胞先與 5、10、50、100 μg/mL 之 CG 和 CL 培養，測定照射 8 J/cm2 UVA 後細胞之 SOD 活性。結果顯示，無加樣組別照射 UV 後 SOD 活性顯著降低，
而先以 50 或 100 μg/mL 之 CG 或 CL 培養後照射 UV 之組別，SOD 活性顯著 較前者高，但仍未回升至與無加樣無照射組別。而在本研究中，花青素粗萃 物 AEMJ 濃度 50 μg/mL 時即可有效回升 SOD 活性至與無加樣無照射組之程 度。由此結果可知，AEMJ 具有提升細胞抗氧化酵素活性之潛力。
D. 細胞內原膠原蛋白 (procollagen I) 含量測定
測定有處理樣品及未處理樣品之皮膚纖維細胞，經 UVA 照射後之細胞內 及細胞所分泌至培養液之 procollagen I 含量，以評估桑椹汁及其花青素對皮 膚纖維細胞光老化之保護能力。
結果顯示，未處理樣品之皮膚纖維母細胞經 UVA 照射後，細胞內 procollagen I 降至未照射組之 24%。而先與 MJP 培養者，細胞內 procollagen I 無顯著降低；先與 50 g/mL AEMJ 培養者，細胞內 procollagen I 含量可回升 甚至高於未照射之組別 (圖二十四)。
以 UVA 照射皮膚纖維母細胞，降低其所分泌至培養液之 procollagen I 含 量。而細胞先以含 MJP 或 AEMJ 之培養液培養後再照射 UVA，其分泌至培養 液之 procollagen I 無法回升至未照射組，但無論有無照射 UVA，先與 MJP 或 AEMJ 培養者皆分泌較多 procollagen I (圖二十五、圖二十六)。由此結果與前 ROS 之結果綜合比較可推測，樣品具有降低細胞內 ROS 能力，藉由降低胞內 氧化壓力，減少 ROS 抑制 procollagen I 生成，因此有處理樣品者 procollagen I 表現量較未處理樣品者高。
Afnan 等人 (2012) 將人類包皮纖維母細胞 (HS68) 培養於含 5-50 M 甘 草酸 (glycyrrhizic acid, GA) (相當於約 4.1-41.1 g/mL) 之培養液中 24 小時 後，以 UVB 照射，再於含 GA 不含血清之培養液中培養 24 小時，測定培養 液中 procollagen I 生成量。結果顯示，無加樣之組別經 UVB 照射後，細胞培 養液中 procollagen I 生成量降至未照射者之 11.6%，而以含 GA 之培養液培養 之組別，其培養液中 procollagen I 生成量可提升約 48-74%。
E. 皮膚纖維細胞 MMP-1 表現
將細胞預先處理桑椹汁，測定樣品對皮膚纖維細胞中 MMP-1 活性之影 響。結果顯示，預先以桑椹汁處理之細胞其 MMP-1 與未處理樣品之組別相比 表現較低 (圖二十七)
此試驗結果之 MMP-1 表現量與前細胞內膠原蛋白含量之結果對照，可推 測桑椹汁可能藉由降低細胞內氧化壓力，減少由 ROS 引發之訊息傳遞路徑，
最終減少膠原蛋白降解並延緩 ROS 抑制膠原蛋白生成，而使得預先處理桑椹 汁之皮膚纖維細胞 MMP-1 表現較低，膠原蛋白含量較高。
Chen 等人(2006) 將人類肺癌細胞 A549 培養於含 25-100 M cyanidin 3-rutinoside 或 cyanidin 3-glucoside 之培養液中 24h (約等於 15-60 g/mL 之 cyanidin 3-rutinoside，或 11-45 g/mL 之 cyanidin 3-glucoside)，接著以明膠酵 素電泳法 (gelatin zymography) 測定細胞 MMP-2 生成量。MMP-2 也是一種基 質金屬蛋白酶，與 MMP-1 不同之處在於，MMP-2 以分解明膠 (gelatin) 為主，
而 MMP-1 則以分解膠原蛋白 (collagen) 為主。該文獻中以 100M 之 cyanidin 3-rutinoside 或 cyanidin 3-glucoside 培養細胞 24h 後，皆可顯著降低 MMP-2 之 活性與 mRNA 表現量，與本試驗中 MJP 可降低人類皮膚纖維母細胞 MMP-1 生成量之結果相似。
圖十九、人類皮膚纖維母細胞與 MJP 培養後於 UVA 照射之存活率。
Fig. 19. Viabilities (%) of fibroblasts incubated with MJP and then irradiated with UVA.
圖二十、人類皮膚纖維母細胞與 AEMJ 培養後於 UVA 照射之存活率。
Fig. 20. Viabilities (%) of fibroblasts incubated with AEMJ and then irradiated with UVA.
圖二十一、人類皮膚纖維母細胞與 MJP 或 AEMJ 培養後之 ROS 相對產量(%)。
Fig. 21. Relative production (RP) of ROS (%) of skin fibroblasts after incubated with MJP or AEMJ.
圖二十二、人類皮膚纖維母細胞與 MJP 或 AEMJ 培養後於 UVA 照射之 ROS 相對產量(%)。
Fig. 22. Relative production (RP) of ROS (%) of skin fibroblasts incubated with MJP or AEMJ and then irradiated with UV.
圖二十三、人類皮膚纖維母細胞與 MJP 或 AEMJ 培養後於 UVA 照射 之 SOD (U/mg protein)。
Fig. 23. SOD (U/mg protein) in skin fibroblasts incubated with AEMJ or then irradiated with UVA (8 J/cm2).
圖二十四、人類皮膚纖維母細胞與 MJP 或 AEMJ 培養，再於 UVA 照 射後，細胞中 procollagen (mg/mL)含量。
Fig. 24. Procollagen (mg/mL) in skin fibroblasts incubated with AEMJ or MJP and then irradiated with UVA.
