實驗方法

(1) 細胞培養 (Cell culture)

實驗使用細胞株為人類口腔鱗狀上皮細胞癌 SCC4 以及 Cal 27，

屬於貼附型細胞。培養在含有 10% 胎牛血清(FBS)及 1% 抗生素 Penicillin 和 Streptomycin 的 DMEM/F-12 培養液，環境為 37^oC、

5% CO2之培養箱，約 2~3 天繼代培養一次。

繼代培養:將培養皿中細胞培養液吸除，加入 3~5 ml 的 PBS (Phosphate buffered saline)(0.02% KH2PO4、0.02% KCl、0.8% NaCl、

0.21% NaHPO4)緩衝液沖洗兩次，加入 1ml 的 Tripsin 至於 37^oC、5%

CO2之培養箱作用 2~3 分鐘，待細胞變圓後並輕拍培養皿幫助細胞脫 落，加入適量培養液均勻混和，種入細胞培養皿中。

解凍細胞:將細胞由液態氮桶取出，置於 37^oC 水浴槽迅速回溫，

將細胞取出並且和 5ml 的細胞培養液混和，置於 15ml 離心管，以 1200rpm 離心 10 分鐘後，將上清液吸除，加入適量培養液均勻混和，

放入 10 公分細胞培養皿中，於 37^oC、5% CO2之培養箱培養。

(2) 細胞爬行分析 (Cell migration assay)

細胞爬行分析是利用 transwell (Costar, Corning Life Science, Acton, MA; pore size 8 μm) 24 孔盤為材料。在 transwell 上層加入處理 過抑制劑或抗體 30 分鐘的 2x10⁴細胞，在下層放置 300 μl 含有 1% FBS

培養液，並加入 30 ng/ml WISP-1，之後放至 37^oC、5% CO2之培養箱 16~18 小時，將上下層培養液吸除，以 3.7%福馬林固定 15 分鐘，PBS 清洗後用 0.05% crystal violet 染色 30 分鐘後，再以 PBS 清洗，用棉 花棒擦拭上層細胞，即可利用顯微鏡觀察並計數爬行過的細胞數，將 計得數量進行統計分析。

(3) 傷口癒合檢測 (Wound healing assay)

研究細胞移動能力的方法，模擬傷口形成時細胞移動的狀態，藉 此方法觀察細胞移動到人造傷口的能力。將細胞培養在 6 孔盤，放至 細胞培養箱培養 24 小時，利用黃色 tip 刮一條直線於 6 孔盤上，形成 人造傷口，接著換新的培養液並加入不同濃度的 WISP-1，利用顯微 鏡拍攝細胞狀況，然後將 6 孔盤放至培養箱培養 16 小時，再用顯微 鏡拍攝細胞狀況，計數細胞爬行的顆數，將計得數量進行統計分析。

(4) 細胞侵犯分析 (Cell invasion assay)

將含有 polycarbonate membrane 的 transwell 置於 24 孔盤，加入 30~50 μl matrigel 於 polycarbonate membrane 上，待 matrigel 凝固後，

將 2 萬顆細胞與無 FBS 的培養液混合並種於 transwell 上，而 24 孔盤 裡則加入含有 1%FBS 培養液與不同濃度的 WISP-1，之後放至 37^oC、

5% CO2之培養箱 16~18 小時，將上下層培養液吸除，以 3.7%福馬林

固定 15 分鐘，利用棉花棒將上層 matrigel 清除，以 PBS 清洗後用 0.05%

crystal violet 染色 30 分鐘後，再以 PBS 清洗，用棉花棒擦拭上層細 胞，即可利用顯微鏡觀察並計數爬行過的細胞數，將計得數量進行統 計分析。

(5) 免疫螢光實驗 (Immunofluorescence)

免疫螢光實驗是根據抗原抗體反應的原理，在螢光色素物質結合 抗體的幫助下，使特異的抗原抗體複合物 (Antigen-antibody complex) 顯現在細胞中。將細胞培養在玻片上，並經由 WISP-1 處理 2 小時之 後，吸去培養液並加入 3.7%福馬林固定細胞 10 分鐘，接著用 PBS 清洗兩次，加入 0.25% triton-X100 將細胞膜打洞，作用 5 分鐘後以 PBS 清洗兩次，加入稀釋 50 倍的一級抗體(c-Jun)反應 1 小時，以 PBS 清洗兩次，接著利用帶有螢光的二級抗體避光反應 1 小時，以 PBS 清洗兩次，最後加入 DAPI 染細胞核，反應 5 分鐘，再以 PBS 清洗兩 次，將玻片取出並利用 mount solution 於載玻片上進行封片，利用 zeiss fluorescence microscope 拍攝。

(6) 即時聚合酶連鎖反應 (Quantitative Real-Time PCR)

Quantitative Real-Time PCR 是利用專一的 primer 在 PCR 過程中 發螢光，利用螢光探測系統來偵測每個循環所釋放出來的螢光量，進

而推算每個循環產生的產物。將 6 孔細胞培養皿盤中加入 500 μl TRIzol，作用 5~10 分鐘後移至 1.5ml 的微量離心管中，加入 100 μl Choroform 震盪 1 分鐘，並置於室溫 5 分鐘，於 4^oC、13200 rpm 離心 15 分鐘，取上清液置新的微量離心管中，再加入 500 μl isopropanol alcohol 並溫和混和後靜置室溫 10 分鐘，於 4^oC、13200 rpm 離心 10 分鐘，此時可見 RNA 沉澱在管底，吸除上清液後加入 1ml 75%過濾 酒精，輕晃幾下後以 4^oC、7500 rpm 離心 5 分鐘，最後移除酒精，風 乾；加入 10~30 μl DEPC 水，回溶 RNA，存於-80^oC 冰箱。

將 RNA 利用 Beckman DU-800 UV/Visible spectrophotometer 測 RNA 濃度，將定量完的 RNA 利用 MMLV kit 將 RNA 轉成 cDNA，

取出 1 μl cDNA 加入 1 μl primesr 及 5 μl 2x supermix，然後補 DEPC 水至 20 μl，將樣本至於 Applied BiosystemStepOne 進行 95^oC 10 分鐘，

95^oC 15 秒，60^oC 1 分鐘，共 40 個循環。所得相對值即為我們所求與 控制組相差倍數。

Primer 序列:

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)：

(Forword) 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’

(Reverse) 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’

ICAM-1：

(Forword) 5’-AAAGCTATGTATGTATGTGCTGCAT-3’

(Reverse) 5’-AACCGAGAGAACCTTCCTTTTTAT-3’

(7) 染色質免疫沉澱法 (Chromatin Immunoprecipitation)

其原理為福馬林在 DNA 與蛋白質交互作用時產生共價鍵結，再 利用超音波震盪將 DNA 打斷成小片段，之後利用抗體進行免疫沉 澱，接著將 DNA 與蛋白質分離，得到 DNA 再進行 PCR 反應，即可 知道 DNA 和蛋白質間交互作用。

將 SCC4 細胞株前處理抑制劑 30 分鐘，隨後加入 WISP-1(30 ng/ml) 作用 1 小時，加入 135 μl 的 37% 福馬林在室溫下作用 10 分鐘，之後 加入 500 μl 1M glycine 5 分鐘，藉此停止福馬林作用，吸除細胞培養 液後，以 PBS 清洗兩次，並加入 500 μl SDS lysis buffer 作用 10 分鐘，

將細胞刮取下來後進行超音波震盪，以 13200rpm 離心 10 分鐘，取 上清液，分別取 50 μl 當作 input、另取 450 μl 加入 15 μl protein A/G 和 10 μl 的 c-Jun 抗體作用 24 小時。將樣品以 13200rpm 離心 1 分鐘後 去除上清液，依序加入 Low salt immune complex buffer、High salt immune complex buffer、Lizl salt immune complex buffer 及 TE buffer 各 500 μl，分別均勻搖晃後以 13200rpm 離心 1 分鐘後去除上清液，

最後加入 200 μl 的 Elution buffer 室溫作用 30 分鐘，以 13200rpm 離

心 1 分鐘後取上清液。

Input 和 IP 樣品加入 8 μl 5M NaCl，65^oC 加熱反應 4~5 小時；

接著加入 1 μl RNase A 在 37^oC 作用 30 分鐘，最後加入 4 μl 0.5M EDTA、8 μl 1M Tris-HCl 及 1 μl Protease K 在 45^oC 作用 1~2 小時。

接著利用 Gel/PCR DNA Isolation system 的 kit 來萃取 DNA，將 萃取出的 DNA 進行 PCR，PCR 條件為 7 μl DNA、2 μl primers、0.5 μl 10mM dNTP、1.5 μl MgCl2、2 μl 10x buffer 及 1 μl Taq，總體積加水 至20μl，進行 94^oC 20 秒，54^oC 30 秒，72.3^oC 30 秒，共 40 個 PCR 循環完後進行 DNA 電泳，以 UV 燈照射，將實驗結果以照相系統拍 下。

ICAM-1 promoter primer 序列:

(Forword) 5’-GCAGCCTGGAGTCTCAGTTT-3’

(Reverse) 5’-GCTGCAGTTATTTCCGGACT-3’

(8) 西方墨點法 (Western blot)

藉由抗原抗體的原理來分析特定的蛋白質。樣品經由 SDS-PAGE 電泳分離後再轉印到硝酸纖維膜上，接著以標記的抗體結合。細胞經 不同的藥物處理，37^oC 培養箱反應後，移除細胞培養液，以 PBS 清 洗兩次，加入 100 μl lysis buffer 將細胞溶解，將細胞刮取至微量離心

管中，於 4^oC、13200 rpm 離心 15 分鐘，取出上清液並測蛋白質濃度。

將樣品注入 SDS-PAGE 中分離蛋白質，接著轉印至 PVDF 膜上，把 PVDF 膜至於含有 10% 脫脂奶粉的 TBS-T 的 blocking buffer 中作用 1 小時，然後依序用一級抗體以及二級抗體作用 1 小時，加入 ECL 顯 像，將 PVDF 膜放在底片夾中以底片感光。

(9) 細胞轉染 (Transfection)

將細胞培養在 6 孔盤中培養一天，利用 lipofectamine 轉染法，各 分別取適量的 DNA 質體或 siRNA(總質量 2 ug/well)於微量離心管 中，加入 50 ul 的 serum-free DMEM/F12，並另外準備含有 4ug/well 的 lipofectamine 於 50 ul 的 serum-free DMEM/F12，兩組靜置 5 分鐘 後，兩者相混和反應 30 分鐘，將 6 孔盤中原有的培養液吸除，加入 900 ul 的 serum-free DMEM/F12 與 100 ul 的質體混和液，置於 37^oC 培養箱培養 16~24 小時，再依實驗所需做處理。

(10) 免疫化學組織染色 (Immunohistochemistry staining)

將組織玻片置於 60^oC 烘箱，烘片 20 分鐘，接下來進行脫蠟反應，

將玻片置於 xylene 中，兩次各反應 5 分鐘，之後將玻片放至 100%

ethanol，兩次各反應 5 分鐘，接著 95% ethanol，兩次各反應 3 分鐘，

然後 85% ethanol 反應 3 分鐘，最後 75% ethanol 反應 3 分鐘，將玻片

放至二次水反應 1 分鐘，為了幫助組織結構修復，所以將玻片放入煮 沸的 citrated buffer 15 分鐘，然後以自來水沖洗 10 分鐘，接著利用 3% H2O2處理 10 分鐘，protein block 反應 10 分鐘，加入一級抗體 (WISP-1 或 ICAM-1)於室溫下反應 2 小時，然後加入二級抗體反應 30 分鐘，接著利用 DAB 將帶有抗體的組織進行呈色作用，避光反應 3~5 分鐘，最後用蘇木紫(hematoxylin)進行細胞(核)染色，之後於自來水 下沖洗 10 分鐘並放至烘箱 15 分鐘，最後進行封片。

(11) 組織微陣列 (Tissue microarray)

購買自 US Biomax，其提供全球種類最多 1759 種以上選擇，分 類依據包含器官、腫瘤、型態分期，可應用於對多種腫瘤的多種基因 表達進行分析，也可對從正常組織、癌前病變、良性腫瘤到惡性腫瘤 的發展過程中某些基因變化的動態過程進行連續的觀察，還可應用於 腫瘤的早期診斷、預後分析及藥物篩選等。本研究購買人類口腔鱗狀 細胞癌的組織微陣列切片，其型號為 OR601a，將此組織微陣列切片 進行免疫組織染色，染 WISP-1 及 ICAM-1 蛋白，並統計這兩種蛋白 與腫瘤分期有無相關性。

(12) 統計方法

示，以 ANOVA 及 Student’s t test 進行數據分析，p<0.05 於統計上表 示有顯著差異。