WISP-1 促進人類口腔鱗狀細胞癌的爬行

已經有研究指出 WISP-1 可以刺激癌細胞爬行及侵入鄰近組織 (Chen, P.P., et al, 2007; Xie,D., et al, 2004)，然而 WISP-1 影響人類口腔 鱗狀細胞癌的爬行仍未有研究報導，為了探討 WISP-1 跟人類口腔鱗 狀細胞癌的爬行能力是否有關，所以我們利用 Transwell assay 檢測癌 細胞爬行的能力，結果顯示人類口腔鱗狀上皮癌細胞株(SCC4 和 CAL27)在 WISP-1 的誘導下，癌細胞爬行能力增加(Fig. 9A)，此外，

利用 Wound healing assay 檢測細胞爬行的能力，給予 WISP-1 不同濃 度刺激細胞 16 小時之後，發現 SCC4 爬行能力會隨著 WISP-1 的濃度 上升而增加(Fig. 9B)；另外，我們亦發現 WISP-1 可促進 SCC4 侵襲 能力增加(Fig. 9C)。由以上結果顯示，WISP-1 可以促進促進人類口腔 鱗狀上皮癌細胞的爬行。

第二節 ICAM-1 參與在 WISP-1 調節人類口腔鱗狀上皮癌細 胞的爬行

我們想探討 WISP-1 如何促進人類口腔鱗狀上皮癌細胞的爬行，

所以利用即時聚合酶連鎖反應檢測不同基因的表現，當細胞經由 WISP-1 處理後，我們發現 ICAM-1 mRNA 的表現增加(Fig. 10A)，根

胞的爬行及轉移(Yang,S.F., et al, 2010)，所以我們假設 ICAM-1 會參與 在 WISP-1 調節人類口腔鱗狀上皮癌細胞的爬行，首先我們給予不同 濃度的 WISP-1 蛋白至細胞培養液裡，利用西方墨點法及即時聚合酶 連鎖反應檢測 ICAM-1 蛋白及 mRNA 的表現，我們發現無論是 ICAM-1 蛋白及 mRNA 的表現都會隨著 WISP-1 處理的濃度上升而增 加表現(Fig. 10B-C)，接著，我們更進一步利用 ICAM-1 siRNA 檢驗 ICAM-1 是否有參與在 WISP-1 調節癌細胞爬行，將 ICAM-1 siRNA 轉染至癌細胞裡，結果可以有效地抑制 ICAM-1 蛋白表現以及降低 WISP-1 調節癌細胞爬行(Fig. 10D)，為了更加確定 WISP-1 可以調節 ICAM-1 的表現及癌細胞的爬行，所以我們利用病毒感染細胞的方 式，將 WISP-1 shRNA 送至 SCC4 裡，利用西方墨點法顯示，當細胞 的 WISP-1 蛋白表現下降時，ICAM-1 蛋白表現亦下降了(Fig. 10F)，

接著一樣用此細胞利用 Transwell assay 檢測癌細胞爬行的能力是否有 改變，結果顯示癌細胞 WISP-1 下降時，癌細胞爬行能力也下降了(Fig.

10E)。根據以上結果得知 WISP-1 調節人類口腔鱗狀上皮癌細胞的爬 行必須透過增加 ICAM-1 的表現。

WISP-1 已知可以跟細胞膜上的 integrin 結合，藉此傳遞訊息至細 胞內並調控細胞功能(Brigstcok,D.R, 2003)，所以細胞前處理 WISP-1 後，利用 Real-time RT PCR 檢測不同及次單元的 mRNA 表現，結

果確定v 及3 的 mRNA 表現有增加的現象(Fig. 10G)，所以預先給 予 integrinv單株抗體至細胞內處理 30 分鐘，可以有效地降低 WISP-1 促進癌細胞的移行及 ICAM-1 的表現(Fig. 10H-J)。所以，

WISP-1 促進人類口腔鱗狀細胞癌的爬行及 ICAM-1 的表現必須透過 integrin v3。



第三節 ASK1 參與在 WISP-1 調節癌細胞的爬行及 ICAM-1 的表現

Apoptosis signal-regulating kinase 1(ASK1)是 MAPKKK 家族的其 中一員，參與在 mitogen-activated protein kinase 訊息路徑裡(Lu,K.W., et al, 2011)，且 ASK1 已被證實可以參與在腫瘤細胞的爬行及轉移裡 (Sun,Y., et al, 2002)。我們假設 ASK1 也許有參與在 WISP-1 調節癌細 胞的爬行，結果顯示，前給予 ASK1 抑制劑(Thioredoxin)至細胞裡，

可有效地抑制 WISP-1 調節癌細胞的爬行及 ICAM-1 的表現(Fig.

11A-C)；此外，將 ASK1 shRNA 轉染至癌細胞內，亦可抑制 WISP-1 調 節 癌 細 胞 的 移 行 及 ICAM-1 的 表 現 (Fig. 11A-D) 。 給 予 細 胞 WISP-1(30 ng/ml)處理不同時間點，發現 ASK1 在 Thr⁸⁴⁵位點有磷酸 化現象(Fig. 11E)，且前處理 integrin

v3 單株抗體至細胞內可抑制

WISP-1 增加 ASK1 磷酸化(Fig. 11F)。因此，WISP-1 透過 integrin v3

第四節 JNK 和 p38 訊息路徑參與在 WISP-1 調節癌細胞的 爬行及 ICAM-1 的表現

ASK1 屬於 MAPKKK 家族的一員，且可活化下游的 JNK 和 p38 訊息路徑(Tan,T.W., et al, 2009；K Tobiume., et al. 2001)，所以我們給 予細胞 JNK(SP600125)和 p38(SB203580)的抑制劑前處理 30 分鐘，發 現可以有效地降低 WISP-1 調節癌細胞的爬行及 ICAM-1 的表現(Fig.

12A-C)，更進一步地確認 JNK 和 p38 訊息路徑有參與在 WISP-1 調節 癌細胞的爬行，我們利用西方墨點法檢測 JNK 和 p38 蛋白磷酸化的 表現，結果顯示，細胞處理 WISP-1 不同時間點時，JNK 和 p38 蛋白 在 30 分鐘有最高磷酸化的表現(Fig. 12D)，接著我們想探討 integrin

v3、ASK1 和 JNK 及 p38 之間上下游的關係，所以前處理 integrin

v3 單株抗體或 ASK1 抑制劑(Thioredoxin)，結果發現可以抑制

WISP-1 調節 JNK/p38 蛋白磷酸化(Fig. 12E)。根據以上結果顯示，

WISP-1 透過 integrin

v3 接受器、ASK1 和 JNK/p38 訊息路徑促進

人類口腔鱗狀細胞癌的爬行及 ICAM-1 的表現。

第五節 AP-1 參與在 WISP-1 調節癌細胞的爬行及 ICAM-1 的表現

根據先前的研究指出，activator protein 1 (AP-1)活化可以調節人 類口腔癌細胞的爬行及 ICAM-1 的表現(Min R., et al, 2012)。首先用

AP-1 抑制劑(Curcumin 和 Tanshinone)前處理至細胞裡，結果發現 WISP-1 調節癌細胞爬行及 ICAM-1 表現的能力下降了(Fig. 13A-C)，

接下來利用西方墨點法、染色質免疫沉澱法以及免疫螢光法，檢測 AP-1 是否有被活化，所以利用 c-Jun siRNA 轉染至細胞裡，降低 c-Jun 表現後發現可以抑制 WISP-1 誘導癌細胞的爬行及 ICAM-1 的表現 (Fig. 13A&B)，且外加 WISP-1 處理不同時間點下，可以清楚發現 c-Jun 蛋白有磷酸化現象(Fig. 13D)，此外，給予 integrin

v3 單株抗體、

ASK1 抑制劑(Thioredoxin)、p38 抑制劑(SB203580 和 JNK 抑制劑 (SP600125)，可以抑制 WISP-1 調控 c-Jun 蛋白磷酸化(Fig. 13E)。

ICAM-1 在-284 至-279 的位置為 AP-1 結合位置，可以調控 ICAM-1 基因的表現，接下來我們想了解 c-Jun 在 WISP-1 的刺激之下 是否會結合到 AP-1 結合位，並促進 ICAM-1 的表現，所以我們做了 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) 的 實 驗 ， 結 果 顯 示 細 胞 在 WISP-1 的處理下，可以誘導 c-Jun 入核並結合到 AP-1 結合位上調控 ICAM-1 表現，然而給予上游抑制劑後，可以有效地抑制 c-Jun 入核 和結合到 AP-1 結合位(Fig. 13F&G)。綜合以上結果，這些資料顯示 WISP-1 透過 integrin

v3 接受器、ASK1 和 JNK/p38 訊息路徑促進

c-Jun 活化並入核調節 ICAM-1 表現，藉此調控人類口腔鱗狀細胞癌 的爬行。

第六節 WISP-1 和 ICAM-1 的表現跟口腔癌病患的腫瘤分期 有相關性

我們將口腔癌病患的組織微陣列切片進行免疫組織染色，染 WISP-1 及 ICAM-1 蛋白，結果發現 WISP-1 和 ICAM-1 在腫瘤組織裡 的表現比正常組織多(Fig. 14A-C)，此外，WISP-1 及 ICAM-1 的高度 表現跟腫瘤分期有相關性，隨著病患腫瘤分期的增加，WISP-1 和 ICAM-1 在腫瘤組織裡的表現也有增加的現象(Fig. 14A-D)。結論，

WISP-1 和 ICAM-1 的表現跟口腔癌病患的腫瘤分期有相關性。

第五章 結論

本研究證明 WISP-1 會增加人類口腔鱗狀上皮細胞癌的移行能 力，WISP-1 會透過 integrin v3、ASK1、p38/JNK 訊息路徑傳遞訊 息，促進轉錄因子 c-Jun 入核調控 ICAM-1 的表現，進而影響人類口 腔鱗狀上皮癌細胞的移行能力；在未來可作為口腔癌轉移的指標。

Integrinαvβ3 WISP-1

ASK1

p38 JNK

c-Jun

c-Jun

ICAM-1 expression

Cancer migration AP-1 bindind site

第六章 討論

口腔癌絕大部分是由上皮細胞惡化所形成的腫瘤，少部分是由小 唾液腺體惡化所形成的腺癌，口腔癌的發生和嚼檳榔、抽煙、喝酒息 息相關，這些致癌因子會讓口腔形成白斑或紅斑甚至惡化成口腔癌；

口腔癌屬於高度侵蝕與高度轉移至頸部淋巴結的癌症，當口腔癌發生 轉移時，無法利用手術切除，使得治療更加困難，且病人癒後能力也 較差(Alvi and Johnson, 1997)，所以探討口腔癌細胞的分子機制越顯 重要。

近幾年有文獻指出 WISP-1 跟許多腫瘤的生成有密切關係，在乳 癌及肺癌的研究中發現，如有 WISP-1 過度表現在腫瘤細胞裡，則顯 示 口 腔 癌 有 較 高 的 侵 襲 能 力 且 病 人 癒 後 效 果 較 差 (Perbal., et al.

2008；Sin., et al. 2009 ; D Xie., et al. 2001)，但是，WISP-1 跟口腔癌 之間的關係仍不清楚。在本文研究中發現，我們證實 WISP-1 藉由促 進 ICAM-1 的表現而增加口腔癌細胞的爬行，而且 WISP-1 誘導 ICAM-1 的表現量上升是經由活化 integrin v3、ASK1、p38/JNK 和 AP-1 訊息路徑。

WISP-1 為 CCN 家族中的成員之一，與細胞增生、黏附、爬行和 腫瘤生長有關，在乳癌、肺癌及軟骨肉瘤等癌症中，發現 WISP-1 會 大 量 表 現且 和腫瘤 惡 性 程度 呈正比 。 在 本篇 研究中 ， 我 們利 用

Migration assay 證明 WISP-1 會促進口腔癌細胞(SCC4 及 CAL27)的爬 行(Fig. 9A-B)，我們利用組織微陣列亦發現口腔癌組織有較高的 WISP-1 表現，且 WISP-1 的表現跟腫瘤分期呈正相關(Fig. 14)，由於 組織微陣列中口腔癌病患只含 3 例有淋巴結轉移，且沒有遠端轉移的 病患，所以導致日後分析 TNM 跟 WISP-1 及 ICAM-1 是否有相關性 時，則無法進行統計。

ICAM-1 屬於免疫球蛋白家族中的一員，主要由五個 extracellular immunoglobulin G-like domains 和一個 short cytoplasmic tail 所組成，

與細胞骨架蛋白相關聯(Diamond., et al.1991)，多種研究指出 ICAM-1 對於細胞的移動性和侵襲能力中扮演重要角色(Chen., et al. 2010)，且 已 被 指 出 跟 腫 瘤 生 成 及 轉 移 有 關 (Jay S. Desgrosellier ,David A.

Cheresh, 2010)。我們發現 WISP-1 可以促進 ICAM-1 的表現增加(Fig.

10A-C)，且 WISP-1 調節口腔癌細胞爬行需依賴 ICAM-1 的幫忙(Fig.

10D)，此外，利用病毒感染細胞的方式，將 WISP-1 shRNA 送至 SCC4 裡，將 SCC4 裡的 WISP-1 剃除表現，顯示細胞的 WISP-1 蛋白表現 下降時，ICAM-1 蛋白表現也下降，而且口腔癌細胞爬行能力亦降低 了(Fig. 10E-F)。根據目前結果顯示，口腔癌細胞或許會自分泌 WISP-1 來幫助癌細胞本身的爬行，不過我們的研究還無足夠證據證明此現 象 ， 所 以之 後可以 利 用 免疫 組織染 色 去 染口 腔癌組 織 切 片有 無

integrin v3 的表現，而且也可以檢測口腔癌細胞是否有表現較高的 WISP-1 mRNA，進而補強實驗數據，證明癌細胞會自分泌 WISP-1。

Integrin 為細胞膜上的蛋白，可以跟細胞外基質結合，調節細胞

黏附、訊息傳遞和細胞移動，Integrin 已知可以做為 CCN 蛋白的接受 器，且 WISP-1 已知可以結合至 integrin

v3 並增加細胞爬行

(Brigstock, D.R. , 2003)。在本篇研究中，細胞前處理 WISP-1 後，利 用 Real-time RT PCR 檢測不同及次單元的 mRNA 表現，結果確定

v 及3 的 mRNA 表現有增加的現象(Fig. 10G)，此外預先給予 integrin

v3 單株抗體至細胞內處理 30 分鐘，抑制 WISP-1 跟 integrin v3

結合，結果口腔癌細胞爬行能力下降(Fig. 10H)，表示 integrin v 在 WISP-1 誘導癌細胞爬行及 ICAM-1 表現中扮演相當重要的角色。

ASK1 參 與 在 mitogen-activated protein kinase 訊 息 路 徑 裡 (Lu,K.W., et al, 2011)，且 ASK1 已被證實可以參與在腫瘤細胞的爬行 及轉移裡(Sun,Y., et al, 2002)。根據本次研究，WISP-1 可以誘導 ASK1 磷酸化(Fig. 11E)，再者，ASK1 shRNA 拮抗 WISP-1 誘導細胞爬行能 力以及 ICAM-1 的表現(Fig. 11A-B)，這些結果顯示 WISP-1 調節口腔 癌細胞爬行需透過 ASK1 的活化；目前已知 ASK1 會活化下游的 p38 及 JNK 蛋白，所以我們認為 p38/JNK 訊息路徑有參與在 WISP-1 調 節 口 腔 癌 細 胞 爬 行 及 ICAM-1 表 現 裡 ， 利 用 JNK(SP600125) 和

p38(SB203580)的抑制劑前處理 30 分鐘，可以有效地抑制 WISP-1 調 節口腔癌細胞爬行及 ICAM-1 的表現(Fig. 12)，綜合以上結果，WISP-1 促進 ICAM-1 表現及幫助口腔癌細胞爬行需經由 integrin

v3、

ASK1、p38/JNK 訊息路徑。

根據先前的研究指出，AP-1 活化可以調節人類口腔癌細胞的爬 行及 ICAM-1 的表現(Min R.,et al, 2012)，在本篇研究中，細胞轉染 c-Jun siRNA 後，可以抑制細胞爬行的能力以及 ICAM-1 的表現，接 著利用染色質免疫沉澱法證實 WISP-1 可促進 c-Jun 和 ICAM-1 啟動 子上的 AP-1 結合位結合，而細胞前處理 integrin

v3 單株抗體、

ASK-1 和 p38/JNK 抑制劑 30 分鐘後，可有效地抑制 c-Jun 和 AP-1 結 合(Fig. 13)。由以上結果證實，WISP-1 藉由促進 c-Jun 活化並入核結

ASK-1 和 p38/JNK 抑制劑 30 分鐘後，可有效地抑制 c-Jun 和 AP-1 結 合(Fig. 13)。由以上結果證實，WISP-1 藉由促進 c-Jun 活化並入核結

在文檔中 中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/50336 (頁 43-0)