實驗方法

一、腦缺血動物模式

以 Nagasawa （1989） 方式改良⁽⁷⁾，做為腦缺血模式。將大 鼠以 sodium pentobarbital （45 mg/kg，I.P.） 麻醉，將左右兩側之頸 總動脈分離出，之後將大鼠固定於立體定位儀上，在眼框及外耳道中 間作皮膚切開，拉開顳肌，在顳骨以電動鑽頭打一個小洞，找出前中 腦動脈以 10-0 的縫合線將前中腦動脈結紮，同時以顯微動脈夾夾閉 兩側頸總動脈，以「雷射度普勒」監測前中腦動脈血流，以確定血管 結紮完全，同時計時，在 90 分鐘後移除前中腦動脈結紮及兩側頸總 動脈之顯微動脈夾，讓血管重新再灌流血液，全部過程將大鼠置於熱 墊（37±1 ℃）上保溫；假手術組，將血管分離但不結紮。治療藥物 在手術前 30 分鐘給予一次，之後每天給予，直到實驗結束

Fig.3 實驗流程圖

二、自發性運動量實驗

本實驗利用自發性運動量測定儀來進行自發性運動量測試，

記錄大鼠 30 分鐘運動量及 0~5 分鐘探索能力，所有大鼠移動時間及 探索次數均由電腦自動記錄。

三、水迷宮實驗

本實驗利用 Morris Water Maze 來進行學習記憶測試⁽⁷¹⁾，其訓 練過程如下：

第一天至第三天：將泳池分成四個象限，逃逸平台固定置於 第四象限的 B 區，而大鼠依序分別置入四個象限，每天訓練 4 次，

每次 2 分鐘；若大鼠於 2 分鐘內即找到逃逸平台，讓大鼠於逃逸平台 休息 30 秒鐘後，抓出泳池休息 30 秒鐘，再進行下一次之訓練；但 若大鼠於 2 分鐘尚未找到逃逸平台，則將大鼠抓到逃逸平台，休息 30 秒鐘後，抓出泳池休息 30 秒鐘，再進行下一次之訓練；共訓練 3 天，此三天稱之為「空間操作（spatial performance）」⁽⁷²⁾。

第四天：第四天將逃逸平台自水面下取走，再將大鼠置於第 三象限，連續測定 60 秒鐘，記錄大鼠於泳池內游泳之軌跡及於原逃 逸平台所花之時間及游泳距離，此階段稱之為「參考記憶（reference memory）」⁽⁷³⁾。

第五天及第六天前段：於第五天及第六天前段將逃逸平台置 於第二象限，加水使其沈入水面 1 cm，大鼠先置入第一象限，連續 測定 120 秒鐘或至大鼠找到逃逸平台，稱之為「再學習（reacquisition）」

(74)。

第五天及第六天後段：前段結束後休息 5 分鐘，再將大鼠先

置入第三象限，亦連續測定 120 秒鐘或至大鼠找到逃逸平台，此稱之 為「記憶再現（retrieval）」⁽⁷⁴⁾。第五天及第六天前段與後段總稱為「工 作記憶（working memory）」。

第七天：於第七天再將逃逸平台置入第四象限並使其露出於 水 面 1 cm， 訓 練 4 次 ， 稱 之 為 「 非 空 間 性 操 作 （ non-spatial performance）」⁽⁷²⁾。所有大鼠游泳之軌跡及實驗資料均由電腦自動記 錄。

四、腦組織之處理及蛋白質之測定 1. 腦組織之處理

實驗完成後，將老鼠斷頭取腦，按 Glowinski 方法⁽⁷⁵⁾分成 cortex、hippocampus、striatum 區域，分別加入 10 倍量 4 ℃ 50 mM Tris buffer solution（pH＝7.4）均質之，並在 4 ℃中離心（14,000 rpm ， 30 min）。保存於-80℃的冰箱中，待需要時解凍離心（10,000 rpm ， 5 min，4 ℃），取上清液使用。

2. 蛋白質之測定

採 Lowery 之方法⁽⁷⁶⁾，以 bovine serum albumin 為標準 品，將 protein standard 以 50 mM phosphate buffer 稀釋 3 到 5 個濃度，

取 5 μl sample 和 standard 分別置入 microplate 中，每一小格中先後 加入 25 μl 試劑 A 及 200 μl 試劑 B（試劑購自 Bio-RAD）混合均 勻，靜置 15 分鐘後，於波長 750 nm 下測其吸光值。爾後以吸光度求 出標準檢量線及公式，再將 sample 的 slope 帶入反推 protein 含量。

五、腦組織氧化損傷標的物之測定 1. Malonyldialdehyde 濃度之測定⁽⁷⁷⁾

將 50 μl standard （MDA） 或 sample 各別加入 plate 的 well 中。加入 160 μl 新鮮配製的 10 mM N-methyl-2-phenylindole 後，再加入 40 μl 的 37 % HCl 後，以 586 nm 波長來測其吸光值。

2. Superoxide dismutase 活性之測定

採 NBT 之方法⁽⁷⁸⁾，每小格加入200 μl反應液（內含 5 mM riboflavin 20 μl、14.9 mg methionine 及 1.22 mM NBT 820 μl，以 50 mM，pH=7.8 的 phosphate buffer 補到 8 ml），及 50 μl 稀釋成不 同濃度的樣品液（每樣品至少稀釋 3~5 個濃度），並以 50 mM phosphate buffer 當對照組，將此微量分析盤置於波長 570 nm 測其吸 光值。光照 10 秒後，測定吸光值，同樣測定第 45 秒、90 秒、135 秒、180 秒、225 秒、270 秒的吸光值。算出對照組與各稀釋濃度七 次分析時間內吸光值變化的斜率，並計算樣品的抑制程度，以能抑制 50%NBT 還原的酵素量定義為 1U。帶入回歸公式，算出抑制 50%NBT 還原需多少樣品溶液，再換算成每μl 樣品相當多少 Total-SOD 活性，

爾後將求得的值除以蛋白質的量。

3. Glutathione 濃度之測定

將 50 μl standard (GSH)或 sample 各別加入 plate 的 well 中。再加入 150 μl 新鮮配製的 assay cocktail (內含 MES buffer 11.25 ml、reconstituted cofactor mixture 0.45 ml、reconstituted enzyme mixture 2.1 ml、water 2.3 ml、reconstituted DTNB 0.45 ml)後，以 405 nm 波 長來測其吸光值，5 分鐘測定一次，測定 30 分鐘⁽⁷⁹⁾。