實驗方法

一、 Bee venom (BV)藥物配製：

BV 由 Sigma-aldrich. Inc 購得，一瓶為粉狀混合物藥物，重 100 mg。

本實驗加入 10 ml 1%DMSO 配成 10 mg/ml 為 stock solution。再分別加入 1%DMSO 配製成不同濃度，最後將蜂肽加入 Medium 中稀釋一百倍的濃 度為 2.5、5、7.5、10、20、30 μg/ml。

表 3-2-1 蜂肽濃度配製表

BV 濃度 (mg/ml) 0.25 0.5 0.75 1 2 3 10 mg/ml 5 10 15 20 40 60 1%DMSO 195 190 185 180 160 140 Final solution (μg/ml) 2.5 5 7.5 10 20 30

二、 人類膀胱癌細胞株 TSGH-8301 細胞培養

TSGH-8301 所使用的培養基為 RPMI-1640 medium modified，額外添 加胎牛血清 (FBS)、抗生素 (Penicillin-Streptomycin, PS)與 L-Glutamine，

使細胞培養基最終含有 10 %FBS、1 %PS 與 2 ml L-Glutamine。細胞培養

於 5% CO₂及 37℃環境下的無菌細胞培養箱中，且約 2 至 3 天更換一次培 養基，當細胞長至八分滿時進行繼代培養或分盤供實驗用。

繼代或分盤時，先以磷酸緩衝溶液 (Phosphate buffer saline，PBS)清 洗細胞，再以 0.05 mg/ml Trypsin-EDTA 處理 3 至五分鐘，接著加入培養 基減緩 Trypsin-EDTA 的作用，並轉至離心管中離心 1500 rpm，五分鐘。

離心後，加入培養基稀釋並回種於新的培養瓶或培養品中進行繼代；分盤 則以少量培養基稀釋，利用血球計數東與 Trypan blue 計算細胞數 (死細 胞會被 Trypan blue 染上，在計數東上呈現藍色、活細胞則否)、之後接種 需要的細胞數至培養品或培養盤內以備實驗用。

三、 TSGH-8301 cells 細胞冷凍保存與活化

細胞經大量培養後需給予保存，以維持最正常的狀態，避免影響日後 實驗結果。因此，細胞經數次繼代後，以 Trypsin 收下，經血球計數東計 算細胞數，將細胞數調為 2-510⁵ cell/mL，再以含有 7 %DMSO (在此做 為抗凍劑)支 FBS 混勻，並分裝置冷凍小管中。分別於 4℃存放 30 分鐘，

-20℃存放 60 分鐘，最後於-80℃存放隔夜，翌日再轉放於液態氮桶中以 備日後使用。

活化細胞時，以快速解凍為最佳，如此可避免冰晶生成影響細胞存 活。故自液態氮桶取出細胞後，以 37℃恆溫水浴槽快速回溫，待其溶解 後以培養基稀釋凍液中 DMSO 濃度，並離心除去抗凍劑。移去上清液後 加入新鮮的培養基，並接種於培養瓶中進行活化。

四、 細胞存活率 (Viability)分析

⁽¹⁰⁰⁾

PI 染劑的配製

先配製出濃度為 2 mg PI/100 ml PBS 作為 PI stock，於要進行實驗時再利用 PBS 將 PI stock 稀釋五倍，最後是以 0.4 mg PI/100 ml PBS 作為使用濃度。

Phosphate Buffer Saline (PBS)的配製

1PBS(一倍的磷酸鹽緩衝鹽溶液)其成分組成為 (1) NaCl︰8.0 g (2) KCl︰0.2 g

(3) Na2HPO4︰1.44 g (4) KH2PO4︰0.24 g

(5)最後以 DDW (distilled, deionized water；去離子水)將定量至 1000 ml。

圖 5-1 流式細胞儀存活率分析圖。

五、 細胞週期 (Cell cycle)之分析

⁽¹⁰¹⁾

(1)

實驗原理：

本實驗利用 PI 染劑標定 DNA，當細胞膜完整時 PI 是無法與細胞 內核酸做鍵結，故利用酒精固定 (Fixed)細胞與增加膜的通透性，利用 PI 與細胞內核酸鍵結一起後，於流式細胞儀進行分析，經由 DNA 之狀 態進行細胞週期之分析。

圖 5-2 流式細胞儀細胞週期分析圖。

表 3-5-1 Cell Cycle PI 染劑配製 (2)Cell Cycle PI 染劑：配法如下

20 mg/100 ml PBS CAT PI stock 1 ml 5 %Triton X-100 10 ml RNase(10 mg/ml in PBS) 2 ml

1 X PBS 加至 50 ml

(3)步驟：將人類膀胱癌細胞 TSGH-8301 細胞，接種於 12-well 培養盤 中，其每 well 所含細胞數為 210⁵ cell/ml/well，細胞培養於 37℃、5 % CO2培養箱中，再分別給予不同濃度之蜂肽 (2.5、5、7.5、10、20 μg/ml)，

及不同的培養時間為 24、48、72 小時後將細胞收集於離心管中，用 1 X PBS 清洗一次，離心 1500 rpm 五分鐘，倒掉上清液、再用 1 X PBS 清 洗兩次，離心 1500 rpm 五分鐘，倒掉上清液後，將細胞打散，於震盪 器上以 shake 3 速度震盪，緩緩加入 4℃的 70%酒精，已進行細胞固定，

細胞固定後至於-20℃隔夜。隔天將細胞取出，離心 1500 rpm 五分鐘，

以 1 X PBS 清洗，再離心 1500 rpm 五分鐘，倒掉上清液後加入 500 μl PI solution，避光反應 30 分鐘後， 再以流式細胞儀來進行偵測、分析，

每秒的細胞數目不超過 200 顆，每個數據收集 10000 顆細胞，且以低流 速來進行分析，數據以 Modfit LT^®軟體來進行分析，紀錄 G0/G1、S、

G2/M phase 及 sub-G1 比例。

六、

Caspase-3, -8, -9 活性分析

⁽¹⁰²⁾ (1) 實驗原理：

^{利 用} Caspase-3 substrate (PhiPhiLux-G1D2

) 、 Caspase-8 substrate

(CaspaLux-L₁D₂)、caspase-9 substrate (CaspaLux-M₁D₂)來監測凋亡細胞相關蛋白 caspase-3, -8, -9 之產生，PhiPhiLux kit 基質是種含有螢光物質之胺基酸序列，而 活化之 caspase-3, -8, -9 可以裂解胺基酸序列之特定位置，史的含有螢光物質釋放 出來，產生綠色螢光，再經由流式細胞儀 (Flow Cytometry) FL-1 detector 偵測後，

CellQuest® 分析、統計後可得知若螢光產量越多則產生 caspase-3, -8, -9 活性亦越 多。

(2) 實驗步驟：

將 人 類 膀 胱 癌 細 胞 (TSGH-8301) 種 植 於 12-well 中 ， 細 胞 依 照 210⁵cell/well 於培養皿中之後加入蜂肽 10 μg/ml，經過 24、48、72 小時處理後，

收細胞，取 10 μM subsrate (for caspase-3, -8, -9)，每管加入 25 μl，再至於 37℃水 浴避光培養 1 小時，後加入 1 ml PBS 洗一次，離心 5 min，倒掉上清液，每管加 入 500 μl Flow Cytometer Buffer，再 transfer 至 FACS 管中，以流式細胞儀進行樣 品 caspase-3, -8, -9 活性分析 (綠色 peak 往右為 caspase-3, -8, -9 產生)。

圖 5-3 流式細胞儀 Caspase-3 分析圖。

七、 人類膀胱癌細胞之細胞核質濃縮現象觀察 DAPI (4-6-diamidine-2-phenylindole)螢光染色

⁽¹⁰³⁾

1. 實驗原理：

DAPI 是一種核酸螢光染劑，其會專一性的結合再 DNA minor groove 上 AT 區，此染劑利用紫外光波長的光線激發，當 DAPI 與雙股 DNA 結合時，最大吸收波長為 358 nm，最大發射波長為 461 nm；當細 胞產生凋亡時，會出現染色質凝結 (chromosomes condensation)、DNA 斷裂(DNA fragmentation)等情形，若細胞凋亡越嚴重，則 DNA 斷裂越多；

相對的 minor groove 上的裸露出來的 AT 區也越來越多，進而使的染上 的 DAPI 染劑越多，其在螢光顯微鏡下觀察，可發現凋亡細胞會發出比 正常細胞高達 20 倍的螢光強度。

2. 實驗步驟：

將人類膀胱癌細胞 (TSGH-8301)分盤並重於 6-well plate 當中，每

well 種 210⁶cell/well，再分別給予不同濃度之蜂肽 (2.5、5、7.5、10、

20 μg/ml)與對照組，培養 24、48 小時後，將上清液抽掉，用 1 X PBS 清 洗兩次，再加入 3 %福馬林/in PBS (蓋過細胞及可)固定 10-15 分鐘，抽 掉福馬林，再以 PBS 清洗數次，再加入 0.1 % Trition X-100/PBS (蓋過細 胞即可)15 分鐘，之後再用 PBS 洗兩次，最後加入已裝 DAPI 染劑溶液 (1 μl/ml)300 μl，至於 37℃培養箱避光反應 30 分鐘後，用 PBS 洗三次後，

於螢光顯微鏡 F200 X 照相。DAPI 結構式：

八、 DNA 彗星拖尾詴驗(Comet assay)

⁽¹⁰⁴⁾ 1. 實驗原理：

單細胞電泳分析 (Single cell gel electrophoresis assay)即是所謂的彗 星詴驗，可用來分析及定量 DNA damage 程度，是一個簡單、快速以及 敏感度高的技術。利用電泳的原理將斷裂成大小不同片段的 DNA 分 開，之後加以染色，DNA 受損越嚴重，斷裂也尌越多，拖尾也尌越明 顯，其外觀形似彗星狀而命名之，由此可藉由拖尾的長短，觀察 DNA 的損傷程度。

2. 詴劑配製：

A. Lysis buffer (需新鮮配製，pH=8~10；配方如下)：其可破壞細胞膜的 結構，以方便之後的 DNA 電泳。

表 3-8-1 Lysis buffer 之配製

組成 體積(ml)

5 M NaCl 100 ml

1 M Tris-HCl 2 ml

0.5 M EDTA 40 ml

Trition X-100 2 ml

DDW 56 ml

Total 200 ml

B. Alkaline buffer (pH=13)：其可將 DNA 雙股螺旋解開成單股 DNA，

當跑電泳時，即可區分出不同片段大小的 DNA。

表 3-8-2 Alkaline buffer 之配製

210⁵cell/well/2 ml，之後加入不同濃度的蜂肽 (2.5、5、7.5、10、20 μg/ml)，另外還需準備 positive control (H2O₂)培養 24、48 小時後，將細 胞吸至 15 ml 離心管，以 1000 rpm 離心五分鐘，去上清液，加入 1 X PBS 約 1 ml，將細胞 transfer 到 1.5 ml eppendorf，經高速離心後去上清液，

打散 pellet 加入 1 X PBS 100 μl (體積依細胞量調整);此時，將上、下層 下蓋玻片，之後配製 lysis buffer。將做好的膠至於 lysis buffer 中反應一

小時，後將膠移至 alkaline buffer 中反應 20 分鐘，將電泳槽置於冰上，

以 alkaline buffer 為電泳液跑 30 分鐘 (25 V；300 mA)。電泳後，將膠 移至 0.4 M Tris buffer 作用 5 分鐘，使其 pH 值回到中性，再將膠置於 methanol 脫水五分鐘，最後加入 40 μl PI (2.5 μg/ml)以螢光顯微鏡觀察，

評估細胞拖尾現象，判定細胞受損的情況。

九、

粒線體膜電位 (Mitochondria membrane potential; ΔΨ

_m

)

⁽¹⁰⁵⁾

(1)實驗原理：細胞膜電位探針，DiOC6 (3)(3,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodide)是一種可穿透細胞膜，可專一性結合並累積在細胞粒線體中，其在

(2)MMP (ΔΨm)詴劑：1 μl DiOC6。(3)stock sol’n+50 μl PBS diluted；DiOC6

(3)stock sol’n：20 mM；working sol’n：1 mM。(3)實驗步驟：將人類膀胱 癌細胞 (TSGH-8301)種植於 12-well 中，每 well 種 210⁵cell/well/2 ml，

再加入 1 mg/ml 的蜂肽，以 20 μl/2 ml medium/well 到 12-well plate 當中(最 終濃度為 10 μg/ml)，加藥時間後經不同時間培養(0、1、3、6、12、24 小 時)，即可收取不同時間點的細胞。首先將細胞懸浮液吸取到離心管中，

加入 1 X PBS 清洗 plate 上的細胞一次後，以 1500 rpm 離心五分鐘，倒掉 上清液後，再加入 3 ml PBS 清洗細胞，1500 rpm 離心五分鐘，去除上清 液，配製 MMP 染劑 DiOC6 (3)(1 μl DiOC6 (3)working sol’n/500 μl PBS)，每

管 sample 加入 500 μl 配製後的 DiOC₆ (3)染劑；此外，頇有一管 blank 不 加藥也不加染劑，只加入 500 μl PBS，之後將 sample 置於 37℃水浴避光 反應 30 分鐘後，transfer 至 FACS 管中，以流式細胞儀進行樣品分析，每 管 sample 收集 10000 顆細胞，之後以 CellQuest^®分析。將 blank 調在 10⁰~10¹ 之間，control 調在 10¹~10²之間，M1 gated 約 50 %，sample 上機後，分 析螢光強度 (DiOC6螢光強度可以由 FL1-H detector 來偵測)，最後以 M1 的數值即是加藥後粒線體膜電位下降產生 (綠色 peak 往左則是 MMP 有下 降的結果)。

圖 5-5 流式細胞儀偵測粒線體膜電位分析圖。

十、 檢測細胞內鈣離子(Ca

²⁺

)釋出的變化

⁽¹⁰⁶⁾

(1) 實驗原理：細胞內鈣離子可做為細胞信號傳遞的分子，是細胞激活過程中重 要的功能因子，細胞內鈣離子濃度大約在 100 nM 左右，最近有文獻指出 若是內質網或高基氏體釋出鈣離子使得胞內鈣離子濃度大於 1 μM 尌有可 能使細胞走向細胞凋亡途徑^{(107, 108)}。

(2) 鈣離子染劑：Fluo-3/AM

(3) 實驗步驟：首先將細胞懸浮液吸取到離心管中，加入 1 X PBS 清洗 plate 上 的細胞一次後，以 1500 rpm 離心五分鐘，倒掉上清液後，再加入 3 ml PBS 清洗細胞，1500 rpm 離心五分鐘，去除上清液，配製鈣離子染劑 Fluo-3/AM (1 μl Fluo-3 AM working sol’n/500 μl PBS)，每管 sample 加入 500 μl 配製後 的 Fluo-3/AM 染劑;此外，頇有一管 blank 不加藥也不加染劑，只加入 500 μl PBS，之後將 sample 置於 37℃水浴避光反應 40 分鐘後，transfer 至 FACS 管中，以流式細胞儀進行樣品分析，每管 sample 收集 10000 顆細胞，之 後以 CellQuest^®分析。將 blank 調在 10⁰~10¹之間，control 調在 10¹~10²之 間，M1 gated 約 50 %，sample 上機後，分析鈣離子釋出程度 (綠色 peak 往右表是細胞內鈣離子濃度增加)。

圖 5-6 流式細胞儀偵測粒鈣離子濃度分析圖。

十一、鈣離子螯合劑 (BAPTA)的檢測

⁽¹⁰⁹⁾

BAPTA (1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N, N, N’, N’-tetraacetic acid)，是一種 鈣離子螯合劑，以類似 EDTA 的螯合方式抓住細胞內鈣離子。本實驗預處理 BAPTA 三小時之後，才開始處理蜂肽，目的是探討蜂肽是否經由鈣離子相關路 徑誘導 TSGH-8301 cells 走向細胞凋亡。

十二、西方墨點法 (Western Blotting)

⁽¹¹⁰⁾ 1. 細胞蛋白質之萃取 (protein extraction)

(1). 細胞總蛋白萃取詴劑：Protein Extraction Solution (lysis buffer)：

PRO-PREP for Cell/Tissue (2). 實驗步驟： 200 μl lysis buffer)，將細胞震盪混合均勻後，置於-20℃ overnight，之後離 心 (14000 rpm，20 分鐘)取其上清液，亦即 lysis buffer 與細胞蛋白混和之 mg/ml)，利用酵素免疫分析儀 (ELISA reader)在 O.D.595 nm 條件下測量其 吸光值做檢量線 (standard curve)分析，求出趨勢線方程式與 R²值。步驟：

先取 Bradford 染劑 (Bio-rad) 2 ml 加 8 ml DDW (5 X 稀釋)混合均勻備用，

取 20 μl 配製的蛋白標準品 (BSA)加 1000 μl Bradford 染劑混合均勻，置於 96-well plate 中，每 well 加入 200 μl (三重複)，靜置五分鐘後以 O.D.595 nm 測量吸光值，求其帄均值，以 O.D. value (Y)對蛋白濃度 mg/ml (X)，求出

趨勢線方程式 y= ax + b，R²值要趨近於 0.99。

表 3-11-1 BSA 之配製

BSA 濃度 (mg/ml) 1 mg/ml BSA (ml) DDW (μl)

1.0 1000 0

0.8 800 200

0.6 600 400

0.4 400 600

0.2 200 800

0 0 1000

圖 5-7 BSA 標準曲線分析圖。

3. 樣品蛋白質定量：

取 20 μl sample protein 與 1000 μl 的 Bradford dye (以 DDW 將原液五倍稀釋) 混合，反應五分鐘後，同蛋白質標準品一起測定吸光值，所得之吸光值帄均，

帶入 y 值 (y = ax + b)，求出該 sample 的蛋白質濃度 x= (y-b)/ a (μg/ml)。

(A) SDS-PAGE 分析

1. 詴劑材料：(表 3-11-2 到表 3-11-8)

2. 膠片製作與電泳步驟:將配製的下層膠 Separation gel 注入鑄膠台中，再以 isopropanol 去除氣泡並壓帄下膠，靜置約 30 分鐘後，可觀察下層膠管中 的剩餘膠體是否凝固，待凝固後，將 isopropanol 倒掉，後注入上層膠並

2. 膠片製作與電泳步驟:將配製的下層膠 Separation gel 注入鑄膠台中，再以 isopropanol 去除氣泡並壓帄下膠，靜置約 30 分鐘後，可觀察下層膠管中 的剩餘膠體是否凝固，待凝固後，將 isopropanol 倒掉，後注入上層膠並

在文檔中 蜂肽經由提升胞內鈣離子濃度與caspase-3活性誘導人類膀胱癌細胞TSGH-8301細胞凋亡及內質網壓力; Regulation of bee venom induced apoptosis and ER stress in human bladder cancer TSGH-8301 cells through increased intracellular Ca2+ and promoted caspase-3 activation (頁 82-104)