第一節 蜂肽 (Bee venom)對人類膀胱癌細胞 (TSGH-8301 cells)生 長之影響
一、 Viability (存活率)：蜂肽對 TSGH-8301 細胞存活率之影響。
首先將購自 sigma 的蜂肽 (Bee venom)配成不同濃度：2.5、5、7.5、10、20 μg/ml……等，分別加入 2105cell/well 定量的細胞中，依照實驗需要的不同時間 點，用倒立式顯微鏡觀察細胞型態，而用流式細胞儀來測量其存活率。經 PI 染 色後的細胞，螢光強度較高者為死細胞，螢光強度較弱者為活細胞。最後再以 sigma plot 統計分析出 TSGH-8301 細胞經蜂肽處理後之存活率。
本實驗以倒立式顯微鏡觀察並紀錄蜂肽對於 TSGH-8301 細胞型態的影響。
如圖 5-1 我們可以發現到不同濃度的蜂肽作用於細胞 24、48 小時後，隨著蜂肽 濃度的改變，細胞數量及型態上都有明顯的改變。分別討論蜂肽對於 TSGH-8301 細胞的毒殺效果是否有呈現劑量上的變化 (Dose dependent)，由圖 5-2 我們可以 從量化表上得知，蜂肽在 24、48 小時對於 TSGH-8301 細胞的毒殺能力是隨著劑 量上升而增加的，這顯示蜂肽對於 TSGH-8301 細胞的毒殺效果具有劑量上的效 應。
利用存活率之詴驗，以蜂肽 10 μg/ml 作用於 TSGH-8301 細胞 24 小時後之存 活率，可達半數致死率。故以蜂肽 10 μg/ml 作為之後大部分實驗的濃度依據。
(A)
(B)
圖 6-1 利用倒立式顯微鏡觀察不同濃度的蜂肽作用 TSGH-8301 細胞型態之變 化。觀察到 TSGH-8301 cells 隨著蜂肽濃度上升呈現明顯皺縮現象。(A)24 小時 (100 X)，(B)48 小時 (200 X)
(B)
圖 6-2 以不同濃度的蜂肽，分別培養於 TSGH-8301 細胞 24、48 小時之後，其存 活率變化之統計量化圖，可發現隨著蜂肽濃度增高存活率有明顯的下降。＊表示 以Student’s t-test 進行分析各實驗組與控制組之間存在之顯著差異，p＜0.05。
Concentrations of Bee venom ( g/ml )
0 2 4 6 8 10 12
Viability (%)
20 40 60 80 100 120
24 hr 48 hr
* *
*
*
*
二、 利用流式細胞儀檢測蜂肽對 TSGH-8301 cells 細胞粒線體膜電
Mitochondrial membrane potential (m) (%)
0
圖 6-3 蜂肽 10 μg/ml 分別作用 TSHGH-8301 細胞 0, 1, 6 , 12, 24 小時候，其粒線 體膜電位之變化。(A)流式細胞儀分析細胞內膜電位之變化分析圖。(B)細胞內粒 線體膜電位變化之量化統計圖，＊＊表示以Student’s t-test 進行分析各實驗組與 控制組之間存在之顯著差異，p＜0.01。
三、 利用流式細胞儀檢測蜂肽對 TSGH-8301 cells 細胞週期之影響。
而本實驗結果可由圖 5-5 得知，當 TSGH-8301 cells 與不同濃度蜂肽共同培 養 24 小時後，處於 SubG1 期的細胞百分比隨著蜂肽濃度越高而上升（0.8~8%），
且有顯著的細胞凋亡 (apoptosis)的現象發生；在 G0/G1 期的細胞則由 54.91%上 升至 66.97%，隨著蜂肽濃度的增高可發現細胞停滯在 G0/G1 期。
(A)
(B)
(C)
圖 6-4 不同濃度的蜂肽作用 24 小時，其細胞週期的變化。(A)流式細胞儀分析細 胞週期變化之分析圖。(B)各不同濃度蜂肽之細胞週期量化統計圖。＊表示以 Student’s t-test 進行分析各實驗組與控制組之間存在之顯著差異，p＜0.05。(C)不 同濃度蜂肽對 TSGH-8301 cells 細胞週期百分比分布圖。
四、 利用流式細胞儀檢測蜂肽對 TSGH-8301 cells 細胞之 DNA 受損 之影響。
(一) 以彗星詴驗觀察 DNA 拖尾情形之分析
本實驗利用 PI 染色，觀察其 DNA 拖尾的現象，脫尾現象越長，表示 DNA 受損情況越嚴重。本實驗結果可由圖 5-6 得知，不同濃度的蜂肽與 TSGH-8301 cells 共同培養 24 小時後，可發現隨著濃度的增加其細胞拖尾 的現象也越明顯，表示 DNA 受損的越嚴重。
(二) 以 DAPI 染色法觀察 DNA 受損之情況
本實驗利用 DAPI (4-6-diamidine-2-phenyl indole)染劑會專一性的與 DNA 結合，在螢光顯微鏡下所觀察到的螢光強度也會增加，表示 DNA 斷 裂的情形越嚴重。結果可由圖 5-7 可得知，TSGH-8301 cells 與不同濃度的 蜂肽共同培養 24 小時後，可發現隨著濃度的增加其螢光強度明顯增強，
而細胞數也明顯減少。
(三) 以膠體電泳法觀察 DNA 片斷化之現象
在 DNA 膠體電泳 (DNA gel electrophoresis)中可以觀察到呈階梯狀分 布 (DNA ladder)。本實驗結果由圖 5-8 可得知，TSGH-8301 cells 與不同 濃度的蜂肽共同培養 24 小時後，在蜂肽 10 μg/ml 有明顯的 DNA ladder 產生，則表示蜂肽造成 TSGH-8301 cells 的 DNA 傷害。
(A)
(B)
Concentrations of bee venom (g/ml)
Comet Length (folds of control)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
0 2.5 5 7.5 10
*
* *
圖 6-5 以不同濃度之蜂肽 (2.5, 5, 7.5, 10 μg/ml)作用於 TSGH-8301 cells 共同培養 24 小時後，以 (A)彗星詴驗觀察拖尾現象 (B)分析量化拖尾程度 (200 X)。＊表 示以Student’s t-test 進行分析各實驗組與控制組之間存在之顯著差異，p＜0.05。
圖 6-6 以不同濃度之蜂肽 (1.25, 2.5, 5, 7.5, 10 μg/ml)作用於 TSGH-8301 細胞培 養 24 小時，以 DAPI 染色法觀察 DNA 受損之情況。
圖 6-7 以不同濃度蜂肽 (2.5, 5, 7.5, 10 μg/ml)作用於 TSGH-8301 cells 共同培養 24 小時，以 DNA 膠體電泳觀察其 DNA 片段化之情況。
五、 蜂肽 (bee venom)對人類膀胱癌細胞株 (TSGH-8301 cells) caspase-3, -8 , -9 活性之探討
本實驗主要是利用流式細胞儀偵測 CaspaLux kit 來偵測細胞內 caspase-3, -8, -9 活性之變化，螢光強度越強則表示 caspase-3, -8, -9 活性越高。結果可由圖 5-9 可得知，TSGH-8301 cells 經蜂肽 10 μg/ml 處理不同時間點之後，我們可發現螢 光強度明顯增強，表示 caspase-3, -8, -9 活性確實有上升，蜂肽可能同時經由內在 與外在路徑來造成細胞凋亡。
(一)、以流式細胞儀分析細胞內 caspase-9 活性之分析圖以及量化統計
圖 6-8 以蜂肽 10 μg/ml 作用於 TSGH-8301 cells 不同時間點，以 CaspaLux 螢光 染劑分析細胞內 caspase-9 活性的變化。(A)以流式細胞儀分析細胞內 caspase-9 活性之分析圖以及量化統計圖。＊＊＊表示以Student’s t-test 進行分析各實驗組 與控制組之間存在之顯著差異，p＜0.001。
(二)、以流式細胞儀分析細胞內 caspase-8 活性之分析圖以及量化統計
圖 6-9 以蜂肽 10 μg/ml 作用於 TSGH-8301 cells 不同時間點，以 CaspaLux 螢光染 劑分析細胞內 caspase-8 活性的變化。(B) 以流式細胞儀分析細胞內 caspase-8 活 性之分析圖以及量化統計圖。＊＊＊表示以Student’s t-test 進行分析各實驗組與 控制組之間存在之顯著差異，p＜0.001。
(三)、以流式細胞儀分析細胞內 caspase-3 活性之分析圖以及量化統計
圖 6-10 以蜂肽 10 μg/ml 作用於 TSGH-8301 cells 不同時間點，以 PhiPhiLux 螢光 染劑分析細胞內 caspase-3 活性的變化。 (C) 以流式細胞儀分析細胞內 caspase-3 活性之分析圖以及量化統計圖。＊＊＊表示以Student’s t-test 進行分析各實驗組
第二節、以西方墨點法探討蜂肽對 TSGH-8301 cells 細胞死亡之相 關蛋白表現
一、探討有關細胞週期停滯 (cell cycle arrest)之相關蛋白
本實驗以流式細胞儀偵測並觀察蜂肽對人類膀胱癌細胞 (TSGH-8301 cells) 細胞週期變化，發現 TSGH-8301 細胞經由蜂肽 10 μg/ml 處理後，細胞週期停滯 在 G0/G1 期。因此利用西方墨點法觀察一些調控 G0/G1 期相關蛋白之變化，一 般來說細胞 DNA 受到損傷時，細胞週期會停滯，此時會誘導腫瘤抑制基因 (tumor-suppressor gene) p53 的表現，p21 會抑制 Cdk-cyclin complexs (例如 Cdk2/6-cyclin E/D)使細胞週期停滯在 G0/G1 期，但是如果 DNA 受損嚴重，p53 表現增強而活化了某些基因的表現，使細胞走向細胞凋亡。另外 chk1/2 會抑制 Cdk6/2 complex 和 cyclin D/E 結合而使細胞週期停滯。由圖 5-11 可得知，當 TSGH-8301 cells 與蜂肽 10 μg/ml 處理後，發現隨著時間的增加，p53 的蛋白表 現量上升，且 p21 表現量也增加。而其下游的 Cdk-cyclin complexs (Cdk2/6-cyclin E/D)表現量減少。而上游的 chk2 的表現量則隨著作用時間增加。由這些結果可 以再一次的證明人類膀胱癌細胞 (TSGH-8301 cells)經蜂肽 10 μg/ml 作用後，其 細胞週期確實停滯在 G0/G1 期。
圖 6-11 以 10 μg/ml 蜂肽蜂肽處理不同時間之人類膀胱癌細胞(TSGH-8301)，利 用西方墨點法檢測有關 G0/G1 期之細胞週期停滯相關蛋白 (如：p21, p53, cyclin D、E, cdk2、6, chk2)之表現變化。
二、探討蜂肽與 TSGH-8301 cells 的細胞凋亡內質網壓力路徑
(endoplasmic reticulum-ER stress dependent apoptotic pathway)之相關 蛋白表現
內質網在細胞內調控著許多細胞內生理現象，像是胞內鈣離子濃度的調節、
蛋白質分泌及脂質合成。內質網內腔的特殊細胞環境，有著最高濃度的鈣離子濃 度以及許多 Ca2+-ATPase 轉運蛋白的特殊細胞環境。若是細胞受到許多外界因素 干擾或壓力，也可能會造成內質網上堆積許多未折疊完全的蛋白質。而這些未成 熟 的 蛋 白 質 將 會 產 生 一 種 稱 作 未 摺 疊 蛋 白 反 應 UPR (unfolded protein respone)(77)，在這裡我們探討 UPR 訊息傳遞在細胞凋亡中各相關蛋白之表現量。
當內質網中的未摺疊蛋白累積越多，便會產生 GRP78 這類伴護質幫助蛋白質摺 疊。當 GRP78 釋出即會啟動 UPR。當 UPR 啟動後可能直接活化一些未摺疊完全 蛋白質 (PERK、IRE1α、ATF6α)。這些重要的轉膜訊息蛋白在 ER stress 下也有 改善蛋白質摺疊錯誤的功能。IRE1α 可活化 caspase-4 以及轉錄後修飾 XBP-1 蛋 白的表現，另外 ATF6 裂解後也會產生 UPR，最後造成細胞自體吞噬 (autophagy) 而死亡。由圖 5-12 可得知蜂肽對 TSGH-8301 cells 造成內質網壓力，進而造成細 胞死亡。
(A)
(B)
圖 6-12 以 10 μg/ml 蜂肽處理不同時間之人類膀胱癌細胞(TSGH-8301)，利用西 方墨點法檢測有關 ER stress 相關蛋白 (如：GRP78, GADD153, caspase-4, XBP-1, PERK, ATF6, IRE1, HIF)之表現變化。
三、探討蜂肽與 TSGH-8301 cells 的細胞凋亡粒線體路徑 (mitochrondria-dependent apoptotic pathway)之相關蛋白表現
當細胞內質網受到壓力時，鈣離子釋出至細胞質而後細胞質鈣離子濃度會過 高，接著粒線體吸收了大量的鈣離子，引起粒線體膜電位的下降且促進了粒線體 凋亡路徑的生成，調控許多下游凋亡相關蛋白。首先先介紹 Bcl-2 family 蛋白，
包含了 1.pro-apoptosis 蛋白 (Bax、Bid、Bcl-Xs)。2.anti-apoptosis 蛋白(Bcl-2、
Bcl-XL)。當 p53 表現量上升時，會活化 p21 蛋白進而影響下游的 Bax 蛋白表現 量上升。而 Bax 會抑制 Bcl-2 蛋白的作用，造成粒線體膜電失衡，引發細胞凋亡 媒介蛋白釋出至細胞質 (Cytochrome c, AIF, Endo-G 等)。AIF 由粒線體釋出後會 進入細胞核內去攻擊 DNA 造成 Genome digestion，而細胞核啟動修復 DNA 的機 制，PARP 便是一個具有修復 DNA 功能的蛋白。當 cytochrome c 活化了 casapse-9 然後活化了 caspase-3，而 caspase-3 會去裂解 PARP 使其失去修復 DNA 的功能，
使細胞最終走向凋亡，為粒線體凋亡路徑 (mitochrondria-dependent apoptotic pathway)。在本實驗中，當 TSGH-8301 cells 與蜂肽 10 μg/ml 共同處理後，由圖 5-13 可觀察到隨著時間增加，p53 蛋白表現量上升，p21 表現量增加，Bax 表現 量增加，AIF、Endo-G、Cytochrome c 在細胞質的表現量皆上升。另外抑制 caspase family 的 蛋 白 XIAP 的 表 現 量 也 隨 著 時 間 的 增 加 而 減 少 ， 更 證 明 了 caspase-dependent apoptotic pathway 已被啟動。另外 DNA 修復蛋白 PARP 也明顯 的被裂解，證明確實有 DNA 傷害的產生。
圖 6-13 以 10 μg/ml 蜂肽蜂肽處理不同時間之人類膀胱癌細胞 (TSGH-8301)，利 用西方墨點法檢測有關粒線體相關蛋白，發現抑制了 Bcl-XL，以及促進了 Endo G, AIF, Bax, Bid 以及 Bcl-XS等蛋白表現變化。
四、探討蜂肽誘導 TSGH-8301 cells 細胞凋亡的外在路徑 (extrinsic pathway)之相關蛋白表現
當細胞走向凋亡時，被發現與許多死亡受器 (death receptor)有關，這些死亡 受 器 大 多 為 TNF (tumor necrosis factor receptor) 的 超 級 家 族 成 員 之 一 。 Fas (CD95) 、 FasL (CD95 ligand) 、 TRAIL (tumor necrosis factor receptor-related apoptosis-induceing ligand)皆是重要的凋亡指標。當細胞受到外在刺激準備走向 凋亡時，這些死亡受器會與連結蛋白FADD接合，並且與procaspase-8聚集在一起 形成DISC (death initiating signaling complex)，準備傳遞死亡訊息給下游蛋白。然 後活化caspase-8，再活化Bid以及caspase-3，最後使細胞走向凋亡一途。由圖5-14 可得知，蜂肽10 μg/ml處理TSGH-8301 cells後，Fas、FasL、TRAIL這些死亡受器 表現量確實有上升。Caspase-8、Bid的蛋白表現量也有上升的趨勢，顯示蜂肽確 實可經由外在路徑使TSGH-8301 cells走向細胞凋亡。
圖 6-14 以10 μg/ml蜂肽處理不同時間之人類膀胱癌細胞 (TSGH-8301)，利用西 方墨點法檢測有關外在路徑相關蛋白 (如：TRAIL, Caspase-8, Fas, FasL, XIAP, Bid)之表現量變化。
五、探討蜂肽與 TSGH-8301 cells 的細胞凋亡之 caspase 家族相關蛋白 表現
目前已知直接跟細胞凋亡相關的蛋白是 caspase-3，另外還有由粒線體所誘 發的內在凋亡路徑相關蛋白是 caspase-9，以及由死亡受器所活化的外在凋亡路 徑相關蛋白是 caspase-8。由圖 5-15 可得知，蜂肽 10 μg/ml 處理 TSGH-8301 cells 後，caspase-3, -8, -9 的裂解態蛋白表現量確實上升了，確認細胞是經由活化
目前已知直接跟細胞凋亡相關的蛋白是 caspase-3，另外還有由粒線體所誘 發的內在凋亡路徑相關蛋白是 caspase-9，以及由死亡受器所活化的外在凋亡路 徑相關蛋白是 caspase-8。由圖 5-15 可得知，蜂肽 10 μg/ml 處理 TSGH-8301 cells 後，caspase-3, -8, -9 的裂解態蛋白表現量確實上升了，確認細胞是經由活化