研究討論

vitro 模式中蜂肽對 TSGH-8301 cells 之增生、存活率、細胞週期、DNA 傷害、染

色體凝集、細胞型態…..等現象之改變情況⁽¹⁰⁰⁾。另外可以從圖 5-1 尌可以觀察到

些 蛋 白 的 釋 出 被 認 為 與 粒 線 體 膜 上 一 種 MPTP (mitochondrial permeability transition pore)的巨大通道有關。MPTP 包含兩大部分：1.粒線體內膜-adenine nucleotide translocator (ANT)相關之蛋白質；2.外膜蛋白質- (voltage-dependent anion channel, VDAC)⁽¹²¹⁾。若是打開此通道會造成粒線體內膜兩側氫離子梯度 DNA damage 之現象。彗星詴驗是一種單細胞電泳法，利用電泳將細胞中的 DNA 帶出細胞外，若是細胞有 DNA damage，則可以在顯微鏡底下發現有 DNA 拖尾

而且細胞數也越來越少，顯示蜂肽確實誘導 TSGH-8301 cells 產生 DNA damage。

我們還利用 DNA 膠體電泳法（agrose gel electrophoresis）觀察蜂肽是否會造成 TSGH-8301 cells 產生 DNA fragmentation 現象。當細胞走向細胞凋亡時，DNA

會產生片段化的現象，產生大約 180~250 bps 的 DNA 小片段⁽¹²⁴⁾。我們可以觀察 確實造成 TSGH-8301 cells 走向 apoptosis。

由流式細胞儀分析得知蜂肽誘導 TSGH-8301 cells 細胞週期停滯在 G0/G1 期。然而細胞週期受到許多相關分子調控包括 Ca²⁺、Cyclins/cdks、p53、pRb 及 E2F、p21、ATM、CDC25 等因子。本實驗主要想要看檢測 G0/G1 期要進入 S 期 這中間的相關蛋白，如：Cyclin D-CDK4/6 complex 及 Cyclin E-CDK2 complex、

p21、p-p53、chk2。Cdk 必頇和 cyclin 結合成 complex 才具有活性化下游基因，

由圖 5-11 可得知 10 μg/ml 蜂肽會造成 Cyclin D-CDK4/6 complex 及 Cyclin E-CDK2 complex 活性下降，而使細胞週期停滯在 G0/G1 期。而 chk2 會抑制 Cyclin D-CDK4/6 complex 或 Cyclin E-CDK2 complex 的活性，本實驗也指出 chk2 的活 性的確在 48 小時明顯上升。當 DNA damage 時會刺激增加 p53 的活性表現，p53

成 TSGH-8301 cells 細胞週期停滯在 G0/G1 期。

GRP94、calreticulin)的變化造成蛋白質的錯誤摺疊，產生了UPR (unfolded protein respone)⁽⁷⁷⁾。正常的GRP78蛋白這類葡萄糖調節性伴護質會連接在位於內質網腔 中的IRE1α、PERK、ATF6α這些蛋白質的尾端，以免他們活化。而內質網上的未 折 疊 蛋 白 則 會 另 GRP78 釋 出 這 些 蛋 白 質 ， 釋 放 時 IRE1α 、 PERK 會 以 寡 體 (oligomerize)存在內質網上，而寡體的IRE1α會結合TNF receptor associated factor 2 (TRAF2)，活化apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1)以及其下游的p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase) and Jun N-terminal kinase (JNK)。此外 IRE1α內在的核醣體解酶會活化XBP-1 (X-box-binding protein 1)的產生，XBP1是 一 種 會 修 補 未 折 疊 蛋 白 或 降 解 蛋 白 質 的 轉 錄 因 子 ； 寡 體 化 的 PERK 會 活 化 eukaryotic translation initiation factor 2α (EIF2α)且抑制全面性的mRNA的轉譯作 用。而ATF6α的釋出則會使這些蛋白轉位至高基氏體上去執行蛋白質分解作用且 幫助活化態的ATF6α釋出來調控UPR與ER-assisted degradation (ERAD)的基因表 現⁽⁸⁴⁾。以上為UPR可能造成細胞死亡的相關路徑。可以從圖5-12觀察得知，PERK 在蜂肽處理後24、48小時有大量表現的現象；ATF-6α/β、HIF-1α皆在12小時表現 量上升；而XBP1與caspase-4皆在48小時有明顯表現，另外鈣離子訊息路徑相關 蛋白GRP78與GADD153也明顯的表現量上升。以上這些蛋白皆指出蜂肽確實造 成TSGH-8301 cells產生內質網壓力，影響鈣離子濃度，導致ER-stress-induced apoptosis的發生⁽¹²⁹⁾。

內質網產生壓力之後會活化 GRP78，進而釋出鈣離子，細胞內鈣離子濃度 短時間內提升許多，造成粒線體不穩定，VDAC 蛋白過度表現，粒線體內鈣離子 堆積，產生 cytochrome c、Bid、Bax 等蛋白造成細胞凋亡⁽¹³⁰⁾。細胞凋亡路徑主 要有 2 種---內在路徑（mitochondrial pathway）及外在路徑- 死亡受器路徑

（death-receptor pathway）。又稱為粒線體路徑，可經由粒線體功能不良或粒線體 釋放凋亡蛋白活化。粒線體路徑又分為兩種路徑，一種是 caspase 相關路徑，此 路徑受到 Bcl-2 protein family 調控，pro-apoptotic protein---Bax/Bak 會影響粒線體 膜電位，釋放出 cytochrome c 會化 caspase-9，進一步活化 caspase-3，誘導細胞

凋亡⁽¹³¹⁾；Anti-apoptotic protein---Bcl-2、Bcl-X_L、cIAPs 會抑制細胞凋亡^{(132, 133)}。

由圖 5-13 可以觀察到以蜂肽 10 μg/ml 處理不同時間後的 TSGH-8301 cells 的 粒線體相關蛋白表現量。結果顯示蜂肽可以活化 Bax 蛋白，影響 Bid 的表現，提 升 Bcl-XS的活性，抑制 Bcl-XL的表現，活化圖 5-15 中 caspase-9, 3 的活性，造 成細胞凋亡。另外一種路徑是 caspase-independent pathway，不經過活化 caspase 蛋白尌可以誘導細胞死亡。如：apoptosis-inducing factor（AIF）、Endonuclease G (Endo G)。Apoptosis-inducing factor（AIF）會受到一些凋亡基因刺激後蛋白表現 量會上升且會從粒線體內膜釋出到細胞質中，進而轉入細胞核內⁽¹³⁴⁾。從圖 5-13 本實驗可以觀察到蜂肽確實可令 TSGH-8301 cells 的 AIF、Endo G 表現量上升。

至於轉位入細胞核的檢驗，從圖 5-21 可以觀察到以免疫螢光染色的 AIF、Endo G 蛋白質在細胞內的分布情形，從共軛焦顯微鏡上可以明顯的觀察到蜂肽可以誘導 TSGH-8301 cells 的 AIF、Endo G 從粒線體釋出至細胞質中，再轉位入細胞核中，

造成細胞基因體的降解。

外在路徑又稱為死亡受器路徑，目前已知的死亡受器有六種，表 2-2-2 有分 類。Fas 是一種位於細胞表面的醣基化蛋白，屬於 TNF receptor superfamily 中 type I 膜蛋白；FasL 是屬於 type II 膜蛋白。當 FasL 結合至 Fas 會活化 Fas receptor，

並吸引 FADD（Fas- associated death domain；FADD）結合至 receptor 位於細胞質

（caspase-8、caspase-10），使 procaspase-8 活化成具活性 caspase-8，此複合物稱 為 death-inducing signaling complex（DISC）⁽⁷⁶⁾。DISC 活化之後會分成兩條路徑，

一條是活化 caspase-8，再裂解 caspase-3，最後造成細胞凋亡；另一條是 caspase-8 會活化 Bid 形成 tBid，tBid 會轉位至粒線體膜上造成粒線體功能失調，再走回內 在路徑誘導細胞凋亡。從圖 5-14 可以觀察到 Fas、FasL 在 24 小時皆有表現上升 的情況，TRAIL 則隨著蜂肽處理時間越長而表現越來越明顯，活化態的 caspase-8 也在 48 小時也顯著的表現。IAP (inhibitor of apoptosis proteins)家族的 XIAP 也隨 著蜂肽處理時間越長而被抑制了表現。以上研究證實了蜂肽的確經由粒線體與外 在路徑誘導 TSGH-8301 cells 邁向 apoptosis。

內質網與粒線體之間有無形的鈣離子流，也尌是當 ER stress 產生而釋出大 量的鈣離子，這次游離在細胞質的鈣離子會令粒線體膜電位改變，粒線體於是將 大量的鈣離子經離子通道交換入粒線體內，以降低細胞內鈣離子濃度⁽⁶⁸⁾。由本實 驗結果證實蜂肽的確是經由 ER stress 與粒線體路徑造成 TSGH-8301 cells 走向細 胞凋亡，接下來要更深入的探討內質網與粒線體之間是否是經由鈣離子濃度的改

以此綠色螢光強度來量化細胞內鈣離子濃度差⁽¹¹²⁾。圖 5-17 可以由鈣離子螢光強 度觀察到預處理 3 小時 BAPTA 10 μM 很明顯的抑制了蜂肽所誘導 TSGH-8301 cells 大量釋出的鈣離子。另外有文獻指出鈣離子訊息傳導能調控細胞增生與死亡

(135)。本實驗欲探討鈣離子是否能調控蜂肽所誘導 TSGH-8301 cells 的細胞死亡，

本實驗預處理 3 小時 BAPTA 10 μM，發現確實減少蜂肽所造成的細胞死亡，證 明了蜂肽確實經由鈣離子訊息路徑來調控 TSGH-8301 cells 的生與死。此外，本 實驗還想要探討鈣離子濃度的改變是否能影響粒線體膜電位，改變細胞的生理機 制。本實驗 預 處理 3 小時 BAPTA 10 μM 發現的確明顯抑制蜂肽所誘導 TSGH-8301 cells 粒線體膜電位下降的程度。以上又再一次證明蜂肽的確是經由 鈣離子訊息來調控 TSGH-8301 cells 走向細胞凋亡。 徑表現如：MAPK pathway。MAPK signaling pathways 主要分為 3 種：ERK、JNK 及 p38 MAPK，由圖 5-20 可以觀察到鈣離子確實能改變蜂肽所誘導 TSGH-8301

徑，以共軛焦顯微鏡來觀察 Endo G，cytochrome c 是否會被鈣離子影響其從粒線 體釋出的能力。由圖 5-23 可以觀察到預處理 BAPTA 確實能減弱 cytochrome c 從 粒 線 體 釋 出 至 細 胞 質 的 表 現 量 ， 證 實 了 鈣 離 子 確 實 能 影 響 蜂 肽 所 誘 發 TSGH-8301 cells 之內在凋亡路徑相關蛋白的表現。此外由圖 5-24 本實驗發現，

預處理 BAPTA 強力的減弱 Endo G 從粒線體釋出至細胞質中，同時也減弱了 Endo G 轉位入細胞核的能力，證明了鈣離子的確會改變蜂肽所誘發 TSGH-8301 cells 之 caspase-independent apoptotic pathway。

許多研究指出癌細胞發展至一定程度會發生轉移 (metastasis)的現象，癌細 胞會到處爬行、侵襲、移動，轉移至其他組織器官，造成全身性器官突變、衰竭

(138)。圖 5-26 可以觀察得知蜂肽的確顯著降低 TSGH-8301 cells 的爬行、入侵與

侵襲能力。