實驗方法

2.2.1 肺癌細胞培養與繼代 (Cell culture and Subculture)

H1299 以及 A549 培養於含 10%胎牛血清 (Foetal bovine serum, FBS) (Biological Industries Ltd., Beit Haemek, Israel)的 Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM) (Invitrogen., Grand Island, NY, USA)；CL1-0、CL1-5 培養於含 10%FBS 的

RPMI-22

1640(Corning Incorporated,. MA, USA)；皆含 1% Antibiotic/antimycotic solution (Penicillin/Streptomycin/Amphotericin) (Biological Industries Ltd., Beit Haemek, Israel)、Sodium pyruvate、2mM L-glutamine solution (Corning, MA,USA)、2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid. (HEPES) (USB. Cleveland, OH, USA)、3.7g/L NaHCO3 (MERCK Chem. CO,. Darmstadt, Germany)培養液中，pH 值 約為 7.1~7.3 (Wang et al., 2001; ATCC)，置於 37℃、5% CO2、濕度 9.8%的細胞培

2.2.2 細胞總蛋白液收集 (Cell lysate collection)

將培養皿中貼附的細胞利用 PBS 仔細清洗兩次後，確認無殘留培養液後吸 除乾淨，加入適量 RIPA lysis buffer (50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EGTA、

1% nonidet^® P-40、1mM PMSF、1mM Na3VO4、1mM NaF、1% protease inhibitor cocktail) 萃取出細胞內容物，利用細胞刮勺將細胞刮除下後收集於 1.5mL 微量 離心管之中，置於冰上靜待數分鐘後待 RIPA buffer 完全作用後，以 4℃、

14000g/15min 離心後收集上清液，利用 Coomassie® brilliant blue G-250 (CBG-250) 與蛋白質結合後會由紅棕色轉變為藍色的特性，透過測量 595nm 吸光值定量蛋 白濃度。

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2.2.3 西方墨點法 (Western blot)

抽取定量後蛋白質樣本與 4x SDS-PAGE sample loading dye (250mM Tris-HCl、

0.8%SDS、0.005% Bromophenol blue、40% Glycerol、β-mecaptoethanol)以 3:1 體 積比例混合均勻後，置於 95℃乾浴槽中加熱 5 分鐘後使蛋白質變性，即可透過 適當濃度的 SDS-PAGE 進行電泳分離，電泳於 running buffer (3g/L Tris-HCl、

1.44g/L glycine、1g/L SDS、20% methanol、pH7.8)中進行，電壓設定為 75-100 V。

待電泳分離蛋白質後進行轉漬 (Membrane Transfer )作業，轉漬濾紙先利用 Transfer buffer (5.8g/L Tris-HCl、2.9/L glycine、0.37g/L SDS、20% methanol、pH8.5) 潤濕，PVDF 轉漬膜則以 100% methanol 浸泡後，由電極正至負極方向依序為濾 紙-PVDF-gel-濾紙，置於 Panther^TM Semidry Electroblotter (Owl separation systems, USA)，利用 400mA 約 40 分鐘進行轉漬。轉漬作業結束後將 PVDF 置於 5% (w/v) 脫脂奶粉進行 Blocking，接著和一級抗體反應於室溫 3 小時或隔夜，與二級抗體 反應於室溫一小時，反應完後皆以 TBST (10mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.05%

Tween 20、pH7.8) 清洗 3-5 次每次約十分鐘。最後利用 Enhanced chemiliminescent reagent (ECL)進行冷光呈色，以冷光影像分析系統 (UVP Auto Chemi Image System) 擷取影像，影像結果利用 ImageJ 做定量分析。

2.2.4 質體轉染 (Plasmid transfection)

H1299 細胞株利用 Turbofect^TM Transfection reagent 進行轉染工作，依照其產 品實驗步驟進行，先將七至八分滿待實驗細胞更換 serum-free DMEM 使其 starvation 靜置培養箱 1 小時後更換含 10% FBS 培養液，爾後取 200μL serum-free DMEM 至 1.5mL 離心管，隨後依 1:3 比例依序加入適量 Plasmid DNA、Turbofect reagent 混和均勻後靜置室溫 20 分鐘後，滴入培養盤當中進行 24 小時轉染。

CL1-0 細胞株利用 Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent 進行轉染工作，

依照其產品實驗步驟進行，先將七至八分滿待實驗細胞更換 serum-free DMEM 使

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其 starvation 靜置培養箱 1 小時後更換含 10% FBS 培養液，爾後取兩管 100μL serum-free DMEM 至 1.5mL 離心管，個別以 1:2 比例加入適量 Plasmid DNA、

Lipofectamine reagent 與培養液均勻混合後靜置 1 分鐘，將 Plasmid/medium 混合 液加入至 Lipofectamine/medium 均勻混合後靜置室溫 20-30 分鐘後，滴入培養皿 當中進行 24 小時轉染。

2.2.5 慢病毒製備與感染 (Lentivirus production and infection)

本實驗流程根據標準步驟 (Zufferey et al., 1997)利用磷酸鈣沉澱 (Calcium phosphoate precipitation) 將質體送入至細胞，將 1x10⁶ 數量的 HEK 293T 種於 10cm 培養皿中，利用含 10%FBS DMEM 培養。接著將 5μg pMD.G (Envelope plasmid) 、 10μg pCMVΔR8.91(Package plasmid) 與 15μg pLKO.1 (AhR shRNA;

Transfer vector) 並加入無菌水補足體積至 250μL 置於 1.5mL 微量離心管中混合

2.2.6 反轉錄聚合酶連鎖反應 (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)

全程於 RNase out 環境下進行。將細胞種於 6cm 培養皿當中，處理實驗所需

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時間以及轉染濃度後，將培養液吸除，利用 PBS 清洗確認無培養液殘留，之後 利用 1mL TriPure isolation reagent 刮取細胞置 1.5mL 微量離心管中。接著加入 0.5mL Chloroform 輕輕混勻後以 4℃，14000g/15min 離心，此時溶液會呈現三個 不相容層，取最上層澄清液至新的 1.5mL 微量離心管中，加入相等體積之 1st-strand cDNA synthesis Kit 並依照其建議實驗步驟進行。於 200μL PCR 微量離心 管中加入6μg RNA、1μL oligo(dT)12-18 primer，利用 DEPC 水補足體積至 24μL，

於 65℃作用 5 分鐘後加入混合液 16μL (2μL 100mM DTT、2μL 10x RT buffer、

1μL 10mM dNTP、0.5μL MMLV high performance reverse transcriptase)均勻混合後，

利用 PCR machine 於 42℃作用 60 分鐘，70℃作用 10 分鐘，終止反應後以此反 應產物 cDNA 即可進行 PCR 實驗。

PCR 所需引子序列如 Table1。接著進行 PCR 實驗，首先將 2μL cDNA、0.5μL 5μM forward primer 和 revese primer、10μL 2x KAPA Taq readyMix，並補足水至 20μL 混合均勻後進行 PCR。條件設定為 94℃作用 5 分鐘，進入 30 個循環之 94

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2.2.7 免疫沉澱法 (Immunoprecipitation)

首先將細胞種於 10cm 培養皿經實驗處理後，將培養液吸除，利用 PBS 清洗 確認無培養液殘留，依照 2.2.2 步驟取得細胞總蛋白液，利用 RIPA 將其稀釋為 濃度 1mg/ml 之細胞液，接著加入 1μg/ml 待測抗體，置於 4℃可調速轉動器 (Rotor) 上轉動混勻並且放置隔夜，接著加入50μL Protein A magnetic beads 於樣品中，置 回 Rotor 轉動 3 小時，利用磁座將其上清液清除，並且利用 PBST (0.05% Tween 20/ PBS) 清洗磁珠，最後將上清液全部移除後，加入 4x SDS-PAGE loading dye 60μL，置於 95℃乾浴槽中加熱 8-10 分鐘，使磁珠上蛋白完全因變性分離後將磁 珠移除，即可進行西方墨點法。

2.2.8 細胞侵襲與傷口癒合法 (Cell invasion and wound healing)

細胞侵襲試驗根據 Yagel 等人之方法 (Yagel et al., 1989)，使用 8μm 孔徑的 transwell 培養盤，將 Matrigel 以不含血清的 DMEM 培養液五倍稀釋後注入 transwell 底部 (35μl/well)，至於 37℃一小時待其凝固後進行以下實驗。將細胞種 於 6cm 培養盤當中，經 pcDNA3.1-AhR 轉染後 24 小時後，將細胞以 1X trypsin-EDTA 將細胞分離，離心除去上清液之後，將 2x10⁵ cells/well 細胞種於 transwell 中，並於下層空間注入含 10%FBS 之 DMEM，待測時間後，利用 4%甲醛固定細 胞 15 分鐘，再利用 Crystal violet 進行染色 40 分鐘，接著將底部清乾淨後放置顯 微鏡下觀察。Cell migration 則利用 2.2.4 的方式將 pcDNA3.1-AhR 質體轉染至固 定數目的 10cm 培養皿中，經處理時間 24 小時後，將細胞 sub-culture 分至 6cm 培養皿中觀察，部分組別加入 TGF-β 促進細胞爬行能力。利用 Tip 將已貼附細胞 刮除寬約莫為 2mm 的溝槽，以製造出模擬傷口偵測細胞移行能力。

2.2.9 SBE 冷光報導基因分析 (SBE Luciferase reporter assay)

本實驗依照 Luciferase assay system kit 所建議步驟進行。首先利用

pGL4.48-27

Luciferase plasmid (3μg) 和 pRK5-lacZ plasmid (1μg)、pcDNA3.1-AhR plasmid (5μg)，透過 2.2.4 方法將質體共同轉染入細胞中，之後放入 37℃培養箱靜置 22 小時，加入TGFβ 處理。處理完畢後，將 5x reporter lysis buffer 稀釋為 1x 後加 入200μL/6cm 培養皿中，利用刮勺將細胞刮下後收集細胞液至 1.5ml 微量離心管 中以 14000g/10 分鐘離心，取其中 20μl 上清液加入 50μl luciferase assay substrate，

利用冷光光譜分析儀 (Oroin L microplate luminometer) 進行偵測；另外取上清液 100μl 加入 500μl β-Gal buffer (60mM Na2HPO4、40mM NaH2PO4、10mM KCl、

1mM MgCl2、50mM β-ME) 、 100μl 含 2mg/ml ONPG (ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) substrate 在 37℃反應 2 小時，利用 β-galactosidase assay 呈色 反應，以酵素免疫自動判讀機 (Thermo) 利用 405nm 吸光測定讀值，作為 Luciferase assay internal 標準。

2.2.10 統計分析 (statistic analysis)

統計方法利用 ImageJ、Graph pad 統計軟體計算，採用 one way ANOVA，

當 p<0.05 認定其結果具有顯著性的統計上差異，並且本實驗中均為重複三次以 上且均為獨立操作，實驗數據結果以平均值加減標準偏差 (mean ±S.E.)來做為 表示。

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第三章

結果

Results

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