3.1 於肺癌細胞中大量表現 AhR 能夠透過 EMT 抑制細胞侵襲能力
為了探討 AhR 是否對於肺癌細胞 invasion 的影響與其關係，本實驗首先利 用 Western blot 觀察三株不同肺癌細胞株：H1299、CL1-0、A549 的 AhR 蛋白表 現量，並且透過 in vitro Transwell assay 得知各株細胞其侵襲 (invasion)能力 (Figure 1A)，實驗結果顯示，A549 的 AhR 蛋白表現量明顯大於 H1299 以及 CL1-0，而 H1999 以及 CL1-0 則幾乎不表現 AhR；且在顯微鏡下可以觀察到 A549 細 胞型態為短紡錘狀，CL1-0 以及 H1299 細胞外觀則大致呈現圓形，並且在三株癌 細胞的 Invasion 能力中，H1299 則表現出較強的 invasion 能力，而 CL1-0 和 A549 則不太產生 invasion。所以往後實驗利用 H1299、CL1-0 作為探討，而 A549 則 做為反證工具，且因為 CL1-0 invasion 能力較不明顯，故 Transwell 相關實驗以 H1299 細胞株為主，以求得到較為明顯的實驗結果。
在得知其原始 AhR 蛋白表現後，欲探討其 AhR 於不存在 ligand 時，AhR 表 現量改變後對於細胞的影響。首先為了取得 H1299 以及 CL1-0 細胞轉染 pcDNA3.1-AhR 的時間曲線以及劑量關係 (Figure 1B)，將 2x108數目的細胞轉染 5μg 的 pcDNA3.1-AhR，大量表現 AhR 6、9、12、24 小時後，觀察其 AhR 的變 化量，實驗結果得知在送入 plasmid 後的 9 小時便開始有 AhR 的呈現 3-4 倍左右 (Figure 1C)，結果顯示大量表現 AhR 後的細胞，於 Transwell 下層的細胞數量較 低，經統計結果，對照組具侵襲能力的細胞數設為 1，而大量表現的組別則為對 照組的 0.2 倍，具有統計上的差異 (p<0.001)，可以證明細胞的 invasion 能力受到
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抑制，另一方面利用 A549 細胞株做為反證實驗，用慢病毒轉染的方式將 AhR shRNA 送入細胞中，試圖將 AhR 靜默，實驗結果顯示在將 AhR 靜默後，其 invasion 有明顯增加的趨勢。綜合以上，證實 ligand-independent AhR 而改變 AhR 蛋白表 現量，會進一步影響細胞的 invasion 能力，且 AhR 可能具有抑制細胞轉移的功 能。
過去研究文獻指出 Metastasis 可能會透過 Epithelial- mesenchymal transition (EMT) 造成細胞的轉變，進一步改變細胞的遷移能力，所以接著本實驗希望了解 是否 EMT 現象參與其中，所以透過 H1299、CL1-0 細胞中大量表現 AhR 後，觀 察其 Epithelial marker E-cadherin 以及 mesenchymal marker Vimentin，於 (Figure 1D)結果顯示大量表現 AhR 後，H1299 並無表現 cadherin，而 CL1-0 則有 E-cadherin 表現增加的現象，而在 Vimentin 的部分則可以觀察到，兩株細胞皆因為 大量表現 AhR 的緣故而導致 Vimentin 的減少，且都具有顯著性的差異。
參考過去研究顯示，EMT 的發生，可能與其轉錄因子的改變有關，所以本 實驗進一步探討參與的 EMT transcriptional factor：snail、ID1 是否因為 AhR 的大 量表現後而表現受到影響。實驗結果顯示 (Figure 1E)，在大量表現 AhR 的細胞 其 EMT 相關的轉錄因子蛋白表現量皆受到抑制，統計圖可以見到大致都具有表 現量減半的情形，另一方面透過 AhR-slienced A549 則可以看到 snail、ID1 相較 於對照組有明顯增加的趨勢，所以細胞中 AhR 的含量，會透過影響 EMT 轉錄因 子的表現量進而造成 EMT 的現象發生，並且導致細胞的 invasion 能力增加。
3.2 AhR 蛋白透過抑制 smad4 表現進而干擾 TGF-β/BMP pathway 的活化 過去文獻顯示 TGF-β/BMP pathway 與細胞發生 EMT 具有高度相關性，所以 認為上述實驗中所看到之 ligand-independent AhR 的表現量會影響 EMT 轉錄因 子的現象，是否與 TGF-β/BMP 這條路徑有關，並且過去研究也顯示，EMT 轉錄 因子會受到 TGF-β，例如 snail；或者受到 BMP 的刺激而增加 ID family 其生合
31 (Figure 3A)，Primer sequence 如 Table1，大量表現 AhR 後 12hr 後檢測 Smad4 的 mRNA 表現，實驗結果得知在 smad4 的 mRNA 的層面並不會因為 AhR 而影響，
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所以排除在轉錄層次時受到抑制，進一步觀察 smad4 的表現量減少是否因為降 解所致，本實驗利用 H1299 以及 CL1-0 細胞，將細胞大量表現 AhR 22 小時，在 進一步透過 proteasome 抑制劑 MG132 10μM 處理兩小時，接著觀察其 smad4 的 表現量，實驗結果顯示 (Figure 3B)，原先受到 AhR 抑制的 smad4 在處理 MG132 後有明顯回升的情形，由此得知 smad4 的降解工作可能是透過 proteasome 來完 成。
欲利用 proteasome 來達到降解目的，先決條件是必須藉由 E3 ubiquitin ligase 將 ubiquitin 接上目標蛋白，方能送至 proteasome 完成降解，所以在此本實驗欲 探討，假設 smad4 是因為 proteasome 而表現量受到抑制，那當 smad4 做為目標 蛋白時，是否被接上 ubiquitin。利用免疫沉澱法檢測 smad4 與 ubiquitin 之間的交 互作用，將收取的蛋白總液加入 smad4 antibody 使其與 smad4 蛋白做結合後，透 過 western blot 偵測 ubiquitin。實驗結果證實 (Figure 3C)，大量表現 AhR 的細胞 中，ubiquitinated-smad4 的蛋白含量明顯高於對照組，證實 AhR 的大量表現，會 造成細胞內的 ubiquitin 被大量地接上 smad4，一旦被接上大量 ubiquitin 後，smad4 便會被送至 26S proteasome 進行降解。
3.4 大量表現 AhR 導致 Jab1 以及 smad4 間的交互作用力增強
上述實驗中得知，當細胞當中大量表現 AhR 時，smad4 會被接上大量的 ubiquitin，此時 smad4 會被 proteasome 所辨認出來，進行 ubiquitin-proteasome pathway 的降解。在過去文獻當中顯示，Jun 活化結合蛋白 (Jun-Activation Domain-Binding Protein, Jab1) 能夠扮演誘導 smad4 ubiquitination 的角色，使其身上帶有 ubiquitin (Wan et al., 2002)。所以本實驗持續探討 Jab1 於大量表現 AhR 細胞中的 關係，首先是否因為大量表現 AhR 後導致 Jab1 的表現量改變所致，首先利用 Western blot 的方式觀察 Jab1 的蛋白含量是否發生改變，實驗結果顯示 (Figure 4A)，在大量表現 AhR 的細胞中，並沒有觀察到 Jab1 的含量有改變，所以排除
33 中，所偵測出來的 smad4 量明顯高於對照組，並且另一方面透過 smad4 antibody 捕捉的免疫複合物中的 Jab1 量也同樣高於對照組，可以證實，當細胞大量表現 ubiquitin 被接至 smad4 上，一旦被接上大量 ubiquitin 後，smad4 便會被送至 26S proteasome 進行降解，缺少了 smad4 的輔助，會影響 TGF-β/BMP pathway 的訊 號傳遞工作，並且造成 TGF-β/BMP 的激活受到阻礙，使 SBE 報導基因無法順利
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pathway 受到抑制而導致，另外一方面，利用 A549 再一次證實此現象，將 A549 靜默 AhR 後，如同上述實驗步驟，觀察其受到 TGF-β/BMP 刺激後，目標蛋白的 表現量。結果顯示，當 A549 因為 AhR 表現受到抑制， smad4 表現增加，使得 受到 TGF-β/BMP 刺激後，大量活化後的 R-smad 與 smad4 進入到細胞核當中，
進行轉錄工作，造成 EMT 相關轉錄因子 snail、ID1 被大量製造出來，而這樣的 現象證實了 AhR 能夠透過影響 TGF-β/BMP pathway 路徑中的輔因子 smad4，使 得 EMT 相關轉錄因子發生改變，進一步促使細胞發生 EMT 或 MET 的現象。
3.6 AhR 參與肺癌細胞透過 EMT 現象所導致的侵襲能力改變
藉由上述實驗中得知，AhR 的大量表現能夠抑制癌細胞發生 EMT 現象，
然而這樣的結果是否最終導致細胞 migration 的改變，所以本實驗持續透過 Wound healing assay 測試細胞的 migration 是否具有差異，透過實驗結果可以得 知 (Figure 6A)，大量表現 AhR 的組別即已可以觀察到 cell migration 能力受到 抑制，再利用 TGF-β 共同處理後可以看到，單獨處理 TGF-β 的組別因為受到 TGF-β 的刺激之後，會促進其細胞的 EMT 現象，導致 cell migration 有相當明 顯的增加，然而在大量表現 AhR 後再給予 TGF-β 刺激，則可以看到原先應該 增加的 cell migration 受到了抑制，顯示大量表現 AhR 確實可以抑制 cell migration，反之，透過 A549 作為反證 (Figure 6B)，可以看到 AhR 靜默的 A549 的 cell migration 明顯增加。綜合以上實驗，我們認為 AhR 會改變肺癌細 胞的 cell migration，且可能原因為藉由抑制 TGF-β pathway 中的 smad4 達到阻 斷細胞 EMT (Figure 7)。
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第四章 討論
(Discussion)
36 究主要在探討不存在其 ligands 的方式，透過 Transfection 以及 shRNA silenced 的 方式去改變 AhR 蛋白在細胞中的表現量，並藉此能夠探討 AhR 蛋白與細胞間的 關係以及含量改變後對於細胞的影響。
4.2 肺癌細胞大量表現 AhR 後對其侵襲能力的影響
目前已知細胞中活化的 AhR 能夠參與細胞週期、細胞增生、細胞貼附與移 行 (Chang et al., 2007; Marlowe and Puga, 2005; Puga et al., 2002)。然而這些現象 的先決條件為 AhR 必須受到其 Ligands 活化下造成。例如過去研究指出，乳癌細