國立臺灣大學醫學院毒理學研究所 碩士論文
Graduate Institute of Toxicology, College of Medicine National Taiwan University
Master Thesis
多環芳香烴受體於人類肺癌細胞株中透過 Smad4 降 解引發 TGF-β 訊號傳遞路徑抑制之機制探討 Aryl Hydrocarbon Receptor Inhibits TGF-β Pathway through Smad4 Degradation in Human Lung Carcinoma
楊文豪 Wen-Hao Yang
指導教授：康照洲 博士 Advisor: Jaw-Jou Kang, Ph.D.
中華民國 104 年 1 月
January 2015
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口試委員審定書
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致謝
毫無疑問，這是目前為止的人生當中，最重要的一段日子。
依舊很難相信，有機會邁入這扇輝煌的大門，從當年那個無知，沒有實驗室經 驗的大學生，抱著一顆忐忑的心，自此踏上了毒理領域的研究之路；一直以來，
雖然總沒天降之財的命，但我仍自認是個非常幸運的人，一路上得到許多照顧，
其中最感謝的莫過於我摯愛的父母，對我的決定和固執都給予最大限度的支持和 鼓勵，他們讓我沒有後顧的往前衝，可以全力完成研究所學業；回顧過去，因為 休學半年的緣故，絕大多數的實驗室皆已額滿，卻因為于萱學姊在 Seminar 的一 句話，加入了康照洲老師的實驗室，康老師有很棒的教導態度，總是透過旁敲側 擊的方式指點課業以及實驗方向，而不是利用直接的指示，這讓我在無形中增進 了思考邏輯的能力；同時也很感謝北醫鄭幼文老師，讓我學到實驗動物的操作，
也透過多次的旅行和聚餐，讓我更認識大家，也多了許多歡笑聲；並且很感激珍 珍學姊不辭辛勞地從臺中上來擔任口委，在口試時給予豐富的建議；當然青澔學 長的不厭其煩，細心地指點許多實驗上的方向，更多的是身為研究生所應該的自 覺和態度，皆對我的研究生生涯增添不少色彩。
R540 是個很可愛的地方，雖然絕大部分時間，不像其他實驗室的歡笑聲如此 的此起彼落，但這裡有很強的凝聚力，凝聚著一同討論實驗內容、一起用餐、共 同解決問題的驚人力量；記得秀秀學姊在休息室告誡我做實驗要積極點，讓我開 始思考該怎麼去安排時間、安排工作；我幾乎是承接于萱學姊所開創的實驗方向，
若是沒有學姊就不會有這本論文；季濠學長一直以來都是個很優秀的討論對象，
作為目前 R540 唯一的博士班學長，把許多責任往身上扛，讓整個實驗室運作得 以順順利利；不可忘了的是 Western 之神詹晟，雖然實驗上沒太多交集，但我的 Western blot 多虧是你教的，讓我在這方面沒遇到太多的阻礙，還被珍珍學姊稱 讚跑得很美；育葦的出現，讓實驗室好像重新活了過來一樣，不僅提供了很多的 活力與笑聲，更重要的是處理行政帳務等苦差事；後來加入的培鈞，私下有許多 共同的嗜好互相交流，讓話題一直延續下去；最後進來的哲睿學弟，雖然我們相 處時間僅半年，但仍期許你順利完成研究。
我一直是個社交冷漠的人，非常感謝同屆的曉榕、耿慈、力潔、韻平、思堯、
宛靜、嘉雯、品妤、久意，下屆的維哲、詩淳、天鳳、可梵、鈴慧、佩蓉、禕琳、
諭霖，以及許多毒理所、北醫藥學的學長姐、朋友們，對我的包容和接納，讓我 這位橫跨兩屆的人，可以參與多次活動，留下許多美好的回憶。
致謝至此，研究所生涯所學很多，思想上好像又成長了不少，對於即將進入 社會的我，這段日子以來，無論是解決事情的方法與態度，邏輯思考的能力、
看待事物的觀念、表達闡述的方式，更甚是在人際關係相處，在未來的旅途 上，這些勢必會是最富價值的無形資產。
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中文摘要
多環芳香烴受體 (Aryl Hydrocarbon Receptor, AhR)為細胞當中一配體活化之 轉錄因子，當細胞接觸到多環芳香烴 (Polycyclic Aromatic Hydrocarbon, PAHs)時，
PAHs 會與 AhR 結合並使其受到活化而進入細胞核中，進而啟動目標基因生合成 Cytochrome P450 (CYP1A1、CYP1B1)，並將外來物質氧化還原以利進行酵素代 謝反應。上皮細胞間質轉換 (Epithelial- Mesenchymal Transition, EMT)是指細胞 從上皮細胞型態轉變為間質細胞型態的一種過程，而在癌細胞當中則被認為與腫 瘤轉移 (Metastasis)能力有關。過去研究顯示，PAHs 會透過活化 AhR，引起癌細 胞發生 EMT 的現象，目前僅有少數文獻探討未活化的 AhR 是否與 EMT 有相關，
機制仍舊尚未明朗，因此本篇研究目的旨在探討，不存在配體的情形之下，透過 in vitro Transfection 方式於肺癌細胞株中大量表現 AhR，觀察是否影響 EMT 現
象以及細胞轉移能力改變並探討其調控機制。實驗結果顯示，在大量表現 AhR 後，細胞中的 Epithelial marker 增加且 Mesenchymal markers 表現量會減少，顯示 細胞 EMT 現象可能受到抑制，並且可能原因為 EMT 相關轉錄因子 snail/slug、
ID1 表現減少，進一步探討其調節機制發現，細胞內的 Smad4 蛋白表現量發生改 變，而 Smad4 是參與 TGF-β 訊號傳遞中重要的伴隨蛋白，能夠幫助受活化的調 節型 smad 共同進核，且過去研究指出 TGF-β 能夠誘使細胞進行 EMT，故一旦 受到抑制，會造成細胞呈現 MET 發展，此時細胞的轉移能力也會受到抑制，過 去研究發現，Smad4 的蛋白表現受 Jun 活化結合蛋白 (Jun-Activation Domain- Binding Protein, Jab1) 的影響，Jab1 為一種 E3-ubiquitin lagase ，會使 Smad4 ubiquitination 後送至 26s proteasome 進行降解，而本實驗結果也證實，AhR 會造 成 Jab1 與 Smad4 間的蛋白結合能力增強，進而導致 Smad4 受到降解的程度強 化，最終造成 TGF-β 訊號傳遞減弱。最後，在體外的細胞轉移試驗 (Migration
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assay)中也可以發現細胞的遷移以及侵襲 (Invasion)能力明顯降低，顯示 AhR 的 大量表現確實能夠抑制癌細胞轉移能力。並且利用 shAhR 進行靜默 (silence)作 為反證，細胞有促進 EMT 的現象。綜合以上實驗結果得知，在肺癌細胞株中，
未活化的 AhR 能夠透過 Jab1 調控 smad4 的蛋白表現量，達到抑制 TGF-β 的訊 號傳遞，降低 EMT 相關轉錄因子的生合成，進而導致癌細胞無法進行 EMT，而 使得癌細胞的遷移能力受到干擾。
關鍵字：多環芳香烴受體、TGF-β、上皮間質轉換、smad4、Jab1
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Abstract
Backgrounds: The aryl hydrocarbon receptor (AhR) is a ligand-dependent- activated transcriptional factor that forms a complex with its ligand such as TCDD to activate target genes Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is a process that epithelial cells are converted to invasive mesenchymal cells, and this process involved tumor metastasis from original cancer to distal. The role of ligand-independent AhR function in cell EMT was investigated in this study. Results: Epithelial markers were induced and mesenchymal markers were inhibited in AhR-overexpressed cell. At the same time, the expression of EMT-related transcriptional factors Snail/slug were also decreased. Interestingly, Smad4 degradation was enhanced in AhR-overexpressed lung cancer cells. Smad4 itself is a co-translocational factor from cytoplasma to nuclear when regulated-smad phosphorylate by TGF-β. TGF-β plays as a potent factor of cancer progression through the induction of EMT. If TGF-β pathway has be inhibited by suppression of smad4, the cancer cell migration will decrease via mesenchymal to epithelial transition (MET). Preliminary studies have shown that Jab1 interacts directly with smad4 and induces its ubiquitination for degradation via 26s proteasome. Our data show that AhR able to increase interaction between Jab1 and smad4, which might increase degradation of smad4 though 26s proteasome pathway. In addition, Cell migration and cell invasion ability were decreased in AhR overexpressed cells.
Conclusion: Our data suggest that AhR affects TGF-β function through Jab1-induced Smad4 degradation by proteasome and resulted in tumor metastasis suppression via EMT reduction in lung cancer cells.
Keywords: Aryl hydrocarbon receptor, TGF-β, Epithelial to mesenchymal transiton, Smad4, Jab1
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縮寫表
AhR Aryl hydrocarbon receptor
EMT Epithelial to mesenchymal transiton PAH Polycyclic Aromatic Hydrocarbon TCDD 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin B(a)P Benzo [a] pyrene
Jab1 Jun-Activation Domain-Binding Protein TGF-β Transforming growth factor- β
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目錄
口試委員審定書 ... i
致謝 ... ii
中文摘要 ... iii
英文摘要 ... v
縮寫表 ... vi
第一章 緒論 (Introduction) ... 3
1.1 多環芳香烴受體 (Aryl Hydrocarbon Receptor, AhR) ... 4
1.2 上皮間質轉換 (Epithelial- mesenchymal transition, EMT) ... 7
1.3 轉型生長因子 β (Transforming growth factor β, TGF-β) ... 9
1.4 TGF-β 與 EMT ... 13
1.5 AhR 與 EMT ... 15
1.6 研究動機 ... 17
第二章 材料與方法 (Materials and Methods) ... 18
2.1 實驗材料 ... 19
2.1.1 細胞株 (Cell line) ... 19
2.1.2 抗體 (Antibody) ... 19
2.1.3 質體 (Plasmid)... 19
2.1.4 實驗藥品與試劑 (Drug and Reagent) ... 20
2.2 實驗方法 ... 21
2.2.1 肺癌細胞培養與繼代 (Cell culture and Subculture) ... 21
2.2.2 細胞總蛋白液收集 (Cell lysate collection) ... 22
2.2.3 西方墨點法 (Western blot) ... 23
2.2.4 質體轉染 (Plasmid transfection) ... 23
2.2.5 慢病毒製備與感染 (Lentivirus production and infection) ... 24
2.2.6 反轉錄聚合酶連鎖反應 (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT- PCR) ... 24
2.2.7 免疫沉澱法 (Immunoprecipitation) ... 26
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2.2.8 細胞侵襲與傷口癒合法 (Cell invasion and wound healing) ... 26
2.2.9 SBE 冷光報導基因分析 (SBE Luciferase reporter assay) ... 26
2.2.10 統計分析 (statistic analysis) ... 27
第三章 結果 (Results) ... 28
3.1 於肺癌細胞中大量表現 AhR 能夠透過 EMT 抑制細胞侵襲能力 ... 29
3.2 AhR 蛋白透過抑制 smad4 表現進而干擾 TGF-β/BMP pathway 的活化 ... 30
3.3 AhR 的蛋白表現量增加會促進 smad4 透過泛素-蛋白酶體路徑的降解 ... 31
3.4 大量表現 AhR 導致 Jab1 以及 smad4 間的交互作用力增強 ... 32
3.5 AhR 抑制 TGF-β/BMP pathway 的目標蛋白 ... 33
3.6 AhR 參與肺癌細胞透過 EMT 現象所導致的侵襲能力改變 ... 34
第四章 討論 (Discussion) ... 35
第五章 結論 (Conclusion) ... 44
參考文獻 (References) ... 46
圖表 (Figures and Tables) ... 67
Figure 1. The Role of Aryl hydrocarbon receptor (AhR) in EMT of Lung Cancer In Vitro ... 71
Figure 2. AhR inhibits Smad4 and Represses the Activity of TGF-β Pathway... 73
Figure 3. Up-regulated AhR induces Smad4 Degradation via ubiquitin proteasome Pathway. ... 75
Figure 4. Overexpression of AhR induces interaction between Jab1 and Smad4. ... 76
Figure 5. AhR protein suppresses EMT-related target gene of TGF-β Pathway. ... 78
Figure 6. AhR protein involves lung cancer cells migratiove ability change. ... 80
Figure 7 The signaling pathway of AhR inhibit cell migration. ... 81
Table 1 ... 82
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第一章 緒論
Introduction
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第一章 緒論(Introduction)
1.1 多環芳香烴受體 (Aryl Hydrocarbon Receptor, AhR) AhR pathway
多環芳香烴受體首次於 1973 年被 Poland 和 Knutson 等人發現，當時認為 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) 、 香 菸 內 的 物 質 以 及 多 環 芳 香 烴 (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)能與細胞質內一種受體具有高度結合性，
並且會誘發代謝酵素多環芳香烴羥化酶 (Aryl hydrocarbon hydroxylase)的大量表 現，而這類受體即為現今所知道的 Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) (Poland et al., 1976)。
AhR 屬於 bHLH (basic Helix-Loop-Helix)- PAS (Per-ARNT-Sim) 家族中的一 員，在生物體當中參與調控發育過程以及許多生理反應，包括神經再生、氣管與 唾腺的形成、對缺氧狀態的反應以及賀爾蒙受體功能的影響等，其中最廣為熟知 的則為對外來毒化物所參與的代謝反應，過去有相當多的研究探討 AhR 與毒物 代謝之間的關係，目前得知 AhR 為一 ligand-dependent 的轉錄蛋白，平時未受活 化的 AhR 會存在於細胞質當中與 HSP90 dimer (heat-shock protein 90 kDa) 、XAP2 (hepatitis B virus X-associated protein 2)、AIP (Aryl hydrocarbon receptor-interacting protein)、p23 (Cox and Miller, 2004; Meyer and Perdew, 1999)等蛋白結合，一旦細 胞接觸到 PAHs、TCDD 等這類物質，這些 AhR ligand 會與 AhR 結合，AhR 便 會受到活化後進入到細胞核中，此時芳香烴受體核轉位蛋白 (Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, ARNT) 會前來參與形成複合體 (Fukunaga et al., 1995)，使得 HSP90、XAP2、AIP 脫離 AhR，並且幫助 AhR 與 DNA 上的 XRE (Xenobiotic Response Element) 片段做結合，一旦開始轉錄工作，便會開始表現產 生目標基因 mRNA，mRNA 經過轉譯作用後生成 CYP1A1 (Cytochrome P450 Family-1 Subfamily-A Polypeptide-1) 、 CYP1A2 (Cytochrome P450 Family-1 Subfamily-A Polypeptide-2) 、 CYP1B1 (Cytochrome P450 Family-1 Subfamily-B
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Polypeptide-1)、glutathion-S-transferase (GST)等代謝酵素，此時便會透過羥化反 應使 AhR ligand 結構上加上-OH 基，以利富於水溶性進而進行代謝。
然而 AhR 除了透過外在 ligand 的活化作用外，過去文獻也指出有許多的內 源性 ligand 亦會活化 AhR，例如最早在 1997 年中證實給於小鼠肝臟細胞株 Hepa 1c1c7 中 Heme 的代謝物 Bilirubin (Sinal and Bend, 1997)、2011 年的研究也指出 細胞中 Tryptophan 的代謝產物 Kynurenine (Opitz et al., 2011)以及 2001 年的研究 中提及 Indigoid 代謝產物 Indirubin 和 Indigo (Adachi et al., 2001)等，皆會使 AhR 活化進入核中並且轉譯出 CYP1 相關蛋白。
而現今工業發展快速，環境中也因此長期存在一些 PAHs，例如機車廢氣、
工業廢氣、香菸、TCDD 等，所以在過去也有許多研究著重於 AhR 在肺臟的機 制探討，這些環境中的 PAH 會透過許多細胞傳遞路徑促進癌細胞的生長 (Chuang et al., 2012)，例如 AhR agonist 會造成 Fibroblast growth factor-9 分泌增加 (Wang et al., 2009)以及 PCNA、DP2 (Shimba et al., 2002)、osteopontin (Chuang et al., 2012) 和 adrenomedullin (Portal-Nunez et al., 2012) 基因表現增強，而這些基因皆會間接 或直接造成細胞的移行、生長、腫瘤惡化能力更加顯著，所以 AhR 與其 Ligands 在現今環境污染加劇的情形下，與肺癌的發生率逐年增加之間，可能具有高度的 相關性。
AhR 參與的生理功能
AhR 也被認為與許多生理調控有關，在過去的研究中，AhR 基因剔除老鼠 (AhR-/-)其存活率、肝臟大小、許多組織功能都有受到抑制 (Lahvis et al., 2000;
Lahvis et al., 2005)。例如心血管功能產生異常現象 (Lund et al., 2003; Lund et al., 2006)，生殖系統以及卵泡的成熟亦會發生問題 (Baba et al., 2005; Peters et al., 1999)，肝門膽管纖維化 (Andreola et al., 1997)，動眼神經缺陷 (Chevallier et al., 2013)，膀胱內尿酸結石的增加 (Butler et al., 2012)，幹細胞的功能異常 (Casado et al., 2011; Wang et al., 2010b)等。並且 AhR 和其 ligand 也被認為會影響腫瘤的
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形成，在肝癌細胞中，AhR 蛋白的表現量不同也同時展現出不同的細胞增生能力 以及其他細胞反應，例如，AhR 缺陷的小鼠 Hepa1c1c7 細胞，其表現 Albumin 較 野生型細胞低，並且減少細胞的增生能力以及增加位於細胞週期中 G0/G1 期的 細胞數目 (Ma and Whitlock, 1996)。透過 RNA 干擾剔除 AhR 的人類肝癌細胞株 HepG2 也看到生長受到抑制、細胞週期相關基因 CyclinsD1、Cyclin E、cdk2 等 都有減少的情形(Abdelrahim et al., 2003)；利用 diethylnitrosamine (DEN)誘發肝癌 的發生實驗中，AhR-/-小鼠所產生的腫瘤數目也較野生型的小鼠來得多 (Fan et al., 2010)。
在細胞所扮演的角色，過去研究顯示，AhR 在不同細胞株當中可能扮演雙面 的角色，同時具有腫瘤抑制以及活化致癌基因的能力 (Safe et al., 2013)，將黑色 素瘤細胞、前列腺癌細胞 C4-2、神經髓母細胞瘤 (medulloblastoma) AhR 剔除後 其細胞生長能力受到抑制 (Barretina et al., 2012; Dever and Opanashuk, 2012; Tran et al., 2013)，減緩尿路上皮癌 T24 細胞株的移行能力以及 MMP9 的表現 (Portal- Nunez et al., 2012)。而在 in vivo 實驗中 AhR 剔除小鼠會有較嚴重的腸胃道腫瘤 產生 (Kawajiri et al., 2009)。
然而 AhR 在部分細胞株卻有全然相反的實驗結果，例如將乳腺癌細胞株 MCF-7、BT474 胞內 AhR 透過 RNAi 技術剔除，則造成細胞增生、細胞週期 G2/M 數目增加、G0/G1 數減少 (Zhang et al., 2009)。T47D、MCF-7 兩株 AhR 表現量 較少的細胞，其生長速度也較為遲緩 (Moore et al., 1996; Moore et al., 1994)；
MDA-MB-468 細胞中，AhR 改變不影響細胞生長速度 (Zhang et al., 2009)。另外 透過異種移植(Xenograft)的方式，皮下注射 AhR+/+或 AhR-/- 的 Tumor Fibroblasts，
基因型 AhR-/-的小鼠表現出較弱的細胞移行能力以及血管新生能力 (Mulero- Navarro et al., 2005)，綜合這些實驗結果顯示了 AhR 在不同的細胞中，扮演的角 色可能存在著細胞特異性。
而 AhR 對於細胞的移行能力，於過去雖然有許多實驗證實之間可能具有一
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定的關聯性，但是實際的影響機制並未非常清楚。然而過去許多研究提出細胞移 行能力改變可能與細胞發生上皮間質轉換 (Epithelial- mesenchymal transition, EMT)有關，故本實驗將進一步探討 AhR 與 EMT 間的關係。
1.2 上皮間質轉換 (Epithelial- mesenchymal transition, EMT)
上皮間質轉換 (Epithelial- mesenchymal transition, EMT)的概念最早是 1969 年 Richard 等人從小鼠肝臟中觀察到型態處於上皮細胞與間質細胞之間的一種特殊 狀態。而 Epithelial- mesenchymal transition 這個名詞一直到 1989 年才開始被研究 人員所使用，發生 EMT 現象時，在細胞生理上會造成上皮細胞表型轉換為間質 細胞表型，最大的特徵為間質型指標 (Mesenchymal markers)的增加，而上皮型指 標 (Epithelial markers)減少，所以可以利用這個特性，作為實驗中判斷細胞是否 發生 EMT 的依據。EMT 現象為脊椎動物胚胎的器官與組織發育、參與傷口的癒 合所必需的重要過程，但是對於癌細胞而言，卻會促使癌細胞的惡化，不僅增加 細胞遷移能力造成癌細胞的擴散，另一方面也會抑制細胞凋亡 (Apoptosis)使癌 細胞持續生長、增加癌細胞對於放射線、化學治療的抗性，造成癌症病患的治療 難度大大提升(Nieto, 2009; Thiery et al., 2009)。透過 EMT 的發生，上皮細胞會轉 換成為高度移行 (Migration) 以及侵襲 (Invasion) 能力的間質性細胞，此時便可 以穿越組織間隙，利用血液或淋巴等循環系統轉移到其他器官，一旦癌細胞到達 轉移部位後，便會進一步透過間質上皮轉換 (mesenchymal-epithelial transition, MET)，再次形成貼附能力強的上皮細胞，引起轉移癌症的形成 (Thiery and Sleeman, 2006)；根據這些研究，間質與上皮細胞間的轉換被認為是原發癌與轉 位癌的一個重要指標，故近年來對於癌症轉移的許多研究，大部分都指向細胞發 生 EMT 的現象。
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上皮性指標
EMT 透過許多複雜的訊號傳遞路徑造成 Epithelial marker E-cadherin 的喪失，
E-cadherin 是細胞與細胞間的黏附分子蛋白 (Adhesion molecule)，屬於一穿膜蛋 白，並於細胞質中與β-catenin 連結，形成上皮細胞間的緊密結構。其中 E-cadherin (encoded by CDH1) 的變化被認為與 EMT 現象有高度相關，在原發乳癌中，癌 細胞過度甲基化以及受抑制的 CDH1 後會產生較強的癌症轉移，並且透過去甲 基化後，則可以看到 E-cadherin 回復以及癌症轉移的現象受到抑制 (Graff et al., 2000)，另外 Wicki 等人也提出，podoplanin 會透過抑制 Rho family GTPase 的活 化而造成乳癌細胞的轉移，也被認為與 EMT 有關 (Wicki et al., 2006)。但是許多 轉錄因子過去被認為能夠抑制 E-cadherin 的形成，包括一些 Zinc finger 蛋白，例 如 snail、slug、Zeb1、Zeb2/SIP1，以及 basic helix-loop-helix 因子，例如 Twist 和 E47 (de Herreros et al., 2010; Peinado et al., 2007)，這些轉錄因子能夠抑制 cadherin、
claudins、occludins、plakophilins、MUC1 和 cytokeratins 的基因表現，造成細胞 間的緊密結構瓦解，進而引起 EMT。其中 snail 被認為與 EMT 的關連性最高，
snail 蛋白會結合至 DNA 上的 E-BOX 5’-CAGGTC-3’上，然後驅使組蛋白去甲基 酶 (histone deacetylase)前來輔助，進一步抑制目標基因 CDH1 (de Herreros et al., 2010; Hemavathy et al., 2000; Kurrey et al., 2009; Peinado et al., 2007; Tripathi et al., 2005)。過去研究也透過在肺癌細胞中暫時性轉染的方式直接大量表現 snail 後，
觀察到細胞中 MMP2 蛋白量增加、E-cadherin 的表現減少並且癌細胞的遷移能力 提升，並且在 in vivo 實驗中，則具有腫瘤大小的增加以及血管新生(Angiogenesis) 的現象 (Bhat-Nakshatri et al., 2010)，顯示 snail 在癌症的惡化以及癌細胞的轉移 中扮演重要的角色，並且可能是透過影響 EMT 發生所致。
間質性指標
而間質性細胞的指標通常是觀察 Vimentin、N-cadherin 的變化來作為 EMT 發生的證據，Vimentin 屬於細胞骨架的一種，存在於細胞當中，一般被認為與細
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胞形狀以及胞器的固定有關 (Mendez et al., 2010)，相對於 E-cadherin，當癌細胞 發生轉移時，Vimentin 會受到 snail 大量表現的影響，使得轉錄工作增加，造成 Vimentin 蛋白被大量製造出來，所以一旦 EMT 現象發生，Vimentin 的蛋白表現 量增加，在實驗觀測上便可以作為一個很有力的指標 (Medici et al., 2008)。
在過去對於癌細胞轉移的研究中，EMT 的發生、EMT 轉錄因子的產生，被 認為有許多的因素所致，然而其中又以轉型生長因子 β (Transforming growth factor β, TGF-β)的刺激所造成最為被廣為人知，所以在本實驗中，將進一步去探 討 TGF-β 參與的可能性。
1.3 轉型生長因子 β (Transforming growth factor β, TGF-β)
TGF-β pathway
Transforming growth factor β (TGF-β) 最早是由 Robers 等人在研究大鼠纖維 母細胞增生時所發現的，TGF-β 家族由許多細胞激素所組成，包括活化素 (activins)、抑制素 (inhibins)、Nodal、骨型態發生蛋白 (Bone morphgenetic protein, BMP) 以及 TGF-β，過去研究已證實這些細胞激素與細胞的增生、分化、器官發 育、細胞移行、細胞侵襲、上皮間質轉換、免疫力調控以及許多疾病發生有關 (Itoh et al., 2000; Massague, 2000; Moustakas et al., 2001)。
目前已知在細胞表面具有 Type I 以及 Type II 所組成的 TGF-β 絲胺酸/蘇氨 酸激酶受器 (serine/threonine kinase receptor)，在哺乳動物中，在過去被辨認出來 的只有 7 種 type I receptors 以及 5 種 type II receptors，但卻有將近 30 種配體存 在。其中 TGF-β1, TGF-β3 和 Activins 能直接與 type II receptor 做結合，毋須 type I 的參與，然而 BMP2, BMP4 以及 BMP7 則會直接與 type I receptor 結合，但部 分配體如 TGF-β2 則必須 type II/type I receptor 的共同配合方能與其結合，所以 細 胞 利 用 不 同 type receptors 間 的 搭 配 ， 形 成 複 雜 以 及 多 功 能 的 調 節 系 統 (Massague and Chen, 2000)。
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Smad-dependent pathway
Smads 家族為 TGF-β pathway 主要傳訊蛋白，負責將受到配體活化的 TGF-β receptor 的訊號持續傳遞下去，目前已知有 8 種 smad 蛋白:Smad1-8，主要可分為 三大類，調節型 smads (regulated-smad, R-smads)，smad2 和 smad3 會受到 TGF-β 以及 Activin 活化，smad1、smad5 以及 smad8 則會受到 BMP1-4 的激活，一旦受 到活化之後會形成一個帶磷酸的複合蛋白(smad2/3、smad1/5/8)，接著便會與細胞 質當中的輔助型 smad (co-smad)結合，smad4 即為目前已知唯一的 co-smad，在 與 R-smad 結合後，會共同進入至細胞核當中並找到 DNA 上的 smad 結合片段 (Smad-binding element, SBE)進行轉錄工作，開啟許多目標基因的表現 (Massague et al., 2005)；而在細胞中也同樣存在部分信號，能夠誘使抑制型 smads (inhibitory- smads, I-smads)的產生，例如 smad6 以及 smad7，這些 I-smads 在受到 TGF-β 或 BMP 的刺激之後，會產生自發性回饋抑制 (auto-inhibitory feedback)，抑制 R-smad 的磷酸化反應 (Imamura et al., 1997; Yan et al., 2009)，此機制可以在細胞當中扮 演一個調節的角色。過去研究中，脂肪細胞 (Adipocyte)的分化 (differentiation)，
觀察到細胞內 smad6/7 的表現量減少，可能即是因為自主分泌的 TGF-β 及 BMP 於過程中減量所致 (Choy et al., 2000)。上皮生長因子受器 (Epidermal growth factor receptor, EGFR)的活化、鉻胺酸激酶受器 (Tyrosine kinase receptor, TKR)、
干擾素γ (Interferon-γ)等透過 STAT (signal transducer and activator of transcription) 蛋白傳遞訊號的路徑以及腫瘤壞死因子α (Tumour-necrosis factor-α,TNF-α) 活化 NF-κB 的方式，都會誘使 smad7 表現，導致 TGF-β pathway 的訊號傳遞受到抑 制 (Itoh et al., 2000; Massague, 2000; Moustakas et al., 2001)。
R-Smads 在完成轉錄工作後，會自細胞核中被送出來至細胞質中，此時 HECT (homologous to the E6-AP carboxy terminus) 家族的 E3 泛素連結酶 (E3 ubiqutin ligase)，例如 Smurf1、Smurf2 (smad-ubiquitination-regulatory factor)，會與 R-smad 結合後，使得大量的 ubiqutin 被接上參與訊號傳遞完畢的 R-smad，然後使其送
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至蛋白酶體 (proteasome)進行降解 (degradation)工作(Arora and Warrior, 2001)。這 樣泛素化的過程可以藉此調控 TGF-β pathway，並且控制 R-smad 在細胞內的存 量。其中 smurf1 專司調控參與 BMP 相關的 smad1/5 (Zhang et al., 2001)；而 smurf2 則可以比較廣泛的調控所有的 R-smad，干擾 TGF-β、Activin、BMP 等訊號(Arora and Warrior, 2001; Bonni et al., 2001; Zhang et al., 2001)。過去文獻也證實 SCF ubiquitin ligase complex (包含 Roc1、Skp1、Cullin 1 和 βTRCP1/Fbw1a)會在細胞 質當中與參與轉錄工作結束後的 R-smad smad2/3 結合，並且透過泛素化使其被 proteasome degradation (Fukuchi et al., 2001; Lo and Massague, 1999)。有趣的是，
調控 smad4 的表現，在過去研究中，極少數去探討 smad4 與 ubiquitin 之間的關 係，取而代之的是 smad4 會受到 sumoylation 後增加其蛋白質穩定性 (Lee et al., 2003)，但是也有研究提出部分腫瘤細胞的基因突變，使得 smad4 允許被泛素化 (Xu and Attisano, 2000)，過去 2002 年 Wan 團隊在 293T 細胞株當中，指出 Jun 活 化結合蛋白 (Jun-Activation Domain-Binding Protein, Jab1/CSN5)即被認為能夠扮 演一個使 smad4 大量泛素化的一個蛋白，進一步迫使 smad4 被 proteasome 降解，
並藉由此調控細胞內的 smad4 表現量，且一旦 TGF-β pathway 缺少 smad4 輔助，
無法將活化的 R-smad 送入到細胞核當中開啟轉錄工作，便會導致 TGF-β pathway 受到拮抗 (Wan et al., 2002)。
Smad-independent pathway
另外 TGF-β pathway 也具有一些非 smad 參與的訊號傳遞路徑，主要是透過 PI3K/Akt、Erk、p38 MAPK 以及 Rho-GTPase 這類蛋白來做為傳遞的訊號，並且 也能夠影響細胞的 Apoptosis 以及 EMT 現象 (Derynck and Zhang, 2003; Moustakas and Heldin, 2005)；於乳癌細胞中，p38 kinase pathway 也能夠作為 Activin signaling 所參與的 cell growth arrest (Cocolakis et al., 2001)或抑制 Pit-1 基因表現中 (de Guise et al., 2006)的一個重要角色；並且 TGF-β 能夠透過活化 MAPK pathway 中 的 Erk1/Erk2 導致 EMT 的發生 (Davies et al., 2005; Lee et al., 2007)；Rho GTPase
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也被認為能夠透過 RhoA、Cdc42 和 Rac 接續 TGF-β pathway 所傳遞的訊號，導 致細胞骨架的重組、細胞移動 (Bhowmick et al., 2001; Edlund et al., 2002)；最後，
TGF-β 也能透過 mTOR 以及 phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt pathway 來達到 調節細胞生長抑制以及誘發 EMT 的發生 (Lamouille and Derynck, 2007; Peron et al., 2001)。
TGF-β 於細胞的生理意義
TGF-β signaling 在癌細胞的進程中也扮演一定角色，過去研究顯示癌細胞會 透過自主分泌 TGF-β 使得自身 TGF-β receptor 持續受到活化，造成腫瘤持續增 大、癌細胞移行、侵襲能力加強等(Chiang and Massague, 2008)。在具有較差的預 後或高度轉移能力的神經膠細胞瘤、黑色素瘤、乳癌、肺癌、前列腺癌的病人中，
都可以觀察到 TGF-β 被大量的產生 (Bierie and Moses, 2006; Levy and Hill, 2006)，
顯示 TGF-β 對癌細胞的調節影響是不容小覷的。
過去研究顯示 TGF-β 可以有效的抑制許多型態的細胞生長，無論在上皮細 胞、內皮細胞、血液幹細胞和免疫細胞等 (Coffey et al., 1988; Derynck et al., 2001)，
都被認為 TGF-β 可能參與其中調控。於細胞週期的進程中，仰賴細胞內的週期 依賴激酶 (Cyclin dependent kinases, CDKs)進行，CDKs 能活化轉錄工作使細胞 週期相關的調節因子產生，而造成細胞自 G1 phase 往 S phase 前進，然而在正常 細胞中，TGF-β 能夠誘發細胞週期激酶抑制劑 (Cyclin dependent kinases inhibitors, CDKIs )，例如 p15INK4B 或 p21KIP1 造成 CDKs 的活性受到抑制 (Gomis et al., 2006)；另外一方面，過去研究也顯示，TGF-β 能減少 c-MYC、Inhibitor of DNA binding (ID) family 基因的表現，而 c-MYC 在細胞中扮演轉錄活化的角色，能促 進細胞生長以及細胞的增生；而 ID family 在細胞當中則扮演啟動細胞分化和促 血管新生的功能(Siegel et al., 2003)，綜合以上，在正常細胞中 TGF-β 被認為，能 夠抑制癌化的形成；但在癌細胞中，因為 TGF-β pathway 相關的分子發生突變，
導致 TGF-β 所造成的生長抑制能力減弱，使其抑制效果不彰，反倒透過其他路
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徑提供癌細胞增生以及癌化的空間。TGF-β 對於腫瘤細胞的癌化，除了促進血管 新 生 以 及 腫 瘤 細 胞 的 生 長 外 ， 另 一 個 重 要 的 影 響 是 會 誘 發 上 皮 間 質 轉 換 (Epithelial- mesenchymal transition, EMT)的進行 (Ikushima et al., 2008; Xu et al., 2009)，原因為 TGF-β 能透過抑制上皮細胞的增生迫使癌細胞往間質性細胞轉換。
1.4 TGF-β 與 EMT TGF-β/smad 誘發 EMT
許多細胞外的刺激也會導致 EMT 的發生，例如過去研究顯示 Transforming growth factor-β (TGF-β), Epidermal growth factor (EGF), Fibroblast growth factors (FGF), Hepatocyte growth factor (HGF),以及 Insulin-like growth factor (IGF)，這些 生長因子皆會引起細胞發生 EMT 的反應 (Mimeault and Batra, 2007)，其中尤以 TGF-β 最為被廣為人知，儘管 TGF-β 在癌症形成初期能夠透過誘發細胞凋亡以 及 cell cycle arrest 來扮演一個重要的腫瘤抑制功能，但是在癌症末期卻是扮演一 個持續惡化的因子，而這當中也包括癌細胞的轉移。過去研究中提及，TGF-β 的 type II 受體，受到活化後，會直接與 occludin 交互作用，進一步使 Par6 蛋白的磷 酸化，誘使 Smurf1 的到來，使得 RhoA 走向蛋白酶體的降解工作，而 RhoA 為 穩定細胞間連結穩定結構的蛋白，一旦受到抑制，便會造成細胞的上皮型態漸漸 喪失，而發生 EMT (Ozdamar et al., 2005)。另一方面 TGF-β 會造成 snail、Twist、
Zeb1 的表現增加，透過這些轉錄蛋白的轉錄抑制 CDH1 encode E-cadhrin 進一步 影響細胞間的緊密連結，使得細胞貼附能力減弱 (Peinado et al., 2007)，並且透過 表現 MMPs，讓癌細胞能夠透過侵襲的方式穿透細胞間質 (Yilmaz and Christofori, 2009)。另外也有研究指出 TGF-β 能夠直接調節 MMP2、MMP9 以及一些胞外基 質如 Fibronectin 以及 collagens 的表現，並且可能是透過 EMT 轉錄因子調控所致 (Moustakas and Heldin, 2012)。
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TGF-β/Micro RNA 與 EMT
部分微小 RNA (microRNA) 也參與 TGF-β 與 EMT 間的關係。miR-155 能夠 直接透過 TGF-β/smad 的刺激而生成，進而作用在 RhoA 上，透過 EMT 的發生，
使細胞間的連結崩解，故 miR-155 的表現抑制後，能夠抑制 TGF-β 所造成的 EMT (Kong et al., 2012)。TGF-β 也能誘發 miR-491-5p 的表現，會找到其目標 Par3 蛋 白後，摧毀細胞間的緊密連結 (Zhou et al., 2010)；另一方面 TGF-β 所引起的 ZEB 表現，會轉而抑制 miR-200 的產生，miR-200 為一髮夾型的 microRNA，能夠反 向抑制 ZEB、type I receptor 以及 smad2 的 RNA 表現，最終使得 ZEB 的表現更 加顯著，進而產生 EMT 反應(Bracken et al., 2008)。另外還有許多 microRNA 能 夠直接影響 TGF-β 路徑，例如 miR-302、miR-372、miR-204 能夠直接抑制 TGF- β type II receptor 的量 (Subramanyam et al., 2011; Wang et al., 2010a)。
TGF-β/Akt 與 EMT
另一方面，TGF-β 也能夠透過 smad-independent 的路徑引起 EMT 現象的發 生，其機制主要是 TGF-β 會活化 PI3K/Akt/mTOR pathway，這條路徑能夠使 mTOR complex 1 受到激活後，促使蛋白合成、細胞移行能力增加 (Lamouille and Derynck, 2007)。此外，若是要使細胞骨架重整 (cytoskeletal reorganization)以使得細胞轉向 間質型態，則必須要透過 TGF-β 活化 mTOR complex 2 並調節 Rho-like GTPase，
所以若是能夠抑制 mTOR complex 2 的活化，便能夠阻止癌細胞透過 EMT 的散 佈 (Lamouille et al., 2012)。TGF-β 亦會造成 Akt 活化，進而使核醣核蛋白 (ribonucleoprotein) hnRNPE1 磷酸化，由於 hnRNPE1 complex 會與部分 mRNA 的 3’區域交互作用，然後抑制其轉譯能力，所以一旦 Akt 磷酸化後，會促進 EMT 相關蛋白轉譯增加 (Chaudhury et al., 2010; Hussey et al., 2011)。
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1.5 AhR 與 EMT
Ligand-dependent AhR pathway
過去對於 AhR 調控 EMT 現象的發生的證據並不充分，主要可以分為是否存在 ligands 下探討：Ligand-dependent 是指 AhR 受到其 ligand 活化而影響下游訊號，
於 2006 年的研究指出，於腎臟細胞中，AhR 在 Benzo[a]pyrene 存在的情況下會 受到持續的活化，並且會抑制間質細胞分化成為腎小管上皮細胞的型態，此現象 即代表細胞的 MET 受到了抑制，進一步干擾了腎元的形成 (Ramos et al., 2006)，
另外於肺癌細胞株 A549 中，給予長時間處理低濃度 benzo[a]pyrene (1μM)，亦即 使 A549 細胞的 AhR 長時間處於活化態，24 周後觀察細胞在形態上並無顯著的 差異，但其細胞內的 EMT 相關的 mRNA 卻發生改變，例如 E-cadherin 的表現減 少；Twist、Vimentin 的表現增加等，顯示長時間暴露 AhR 的 ligand 可能會導致 肺癌細胞的 EMT 發生 (Yoshino et al., 2007)。除此之外，過去也曾發現，在乳癌 細胞株 MCF-7 以及皮膚癌細胞 HaCaT 中，利用 3-Methylcholanthrene (3MC)處理 使其 AhR 處於活化態，能夠誘導 EMT 轉錄因子 Slug 的生成，使得 E-cadherin 表 現受到調控而減少 (Dietrich and Kaina, 2010; Ikuta and Kawajiri, 2006)。此外，綠 茶中所含的茶多酚 (polyphenol epigallocatechin-3 gallate, ECGC) 目前已知會透 過與 Hsp90 結合，進一步使得 TCDD 與 AhR 結合，雖然活化後進核，但於在核 中 Hsp90 無法被釋出，此時 AhR/TCDD complex 活性受抑制，造成轉錄作用中 止 (Palermo et al., 2005)。並且在另一個研究中，7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA)，這類 PAH 能夠誘導 AhR 的活化，並且增加 CYP1A1 以及 EMT 相關 蛋白 slug 的表現，然而在給予 ECGC 共同處理後，發現 slug 受到了抑制，顯示 ECGC 能透過抑制 AhR 的活化進而影響 EMT (Belguise et al., 2007)。
Ligand-independent AhR pathway
另一方面，AhR ligand-independent 與 EMT 之間的關係在過去是較少被探討 的，過去於人類角質細胞中，透過 shRNA 將 AhR knockdown 後觀察到 EMT 的
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現象受到抑制，但其機制仍舊不明(Rico-Leo et al., 2013)。以及本實驗室過去發現 將肺癌細胞株 H1299 的 AhR 大量表現後，AhR 可能扮演 E3 ubiquitin ligase 的腳 色，將 ubiquitin 接上 Rac1、Vimentin，使其受到蛋白酶體的降解，進而達到降低 EMT 的結果。綜合上述實驗結果，我們認為 ligand-independent 的 AhR，可能會 參與癌細胞當中的 EMT 現象，且機制可能是透過 TGF-β pathway，至於詳細機 制仍有待實驗數據輔佐驗證。
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1.6 研究動機
在過去數十年間，惡性腫瘤持續居於人類死因之冠，而其中肺癌又常存於前 三名中，根據統計臺灣每兩千人就有一人罹患原發性肺癌，並且時常有癌症轉移 的現象發生，造成遠端器官也發現癌細胞，造成放射線治療以及化學治療上的困 難，通常存活率並不高。過去許多研究報告指出，環境中的污染物，例如機車廢 氣以及香菸中的化學物質，可能是導致肺癌發生的主要原因之一，其中這些環境 汙染物有一大部分屬於多環芳香烴類，能夠活化細胞中的 AhR，因此 AhR 在肺 癌發生的因素當中可能扮演很重要的角色。並且也有研究指出，當體內已經罹患 癌症後，再持續暴露到這些環境汙染物後，會造成癌細胞轉移的能力增加，以及 長時間處理多環芳香烴後，細胞的 AhR 表現量減少，也強化細胞移行的能力，
都可以得知 AhR 在肺癌的研究中是很重要的一環。AhR 於毒理學研究中，透過 配體而激活 AhR，使其進入細胞核轉錄出代謝酵素 CYP1A1，CYP1B1 等，然後 這些酵素再進行代謝時，會產生 ROS 以及 DNA adduct 等傷害性。以及過去也發 現 AhR 持續活化會影響 EMT 相關的轉錄因子，且 EMT 與癌細胞轉移具有高度 相關，但是 AhR 在未受到配體活化時，也有部分文獻指出可能參與 EMT 的反應 中，但是這部分的機制以及 AhR 扮演的位置證據仍舊相當薄弱，以及本實驗室 所發現於肺癌細胞中的 AhR 大量表現後，會減緩 EMT。因此本實驗，根據以上 因素，推論 AhR 在未受其配體活化時，具有抑制 EMT 的可能，並且探究其可能 的機制為何。期許未來可以做為研究肺癌的轉移以及提供藥物治療的依據。
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第二章 材料與方法
(Materials and Methods)
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第二章 材料與方法 (Materials and Methods)
2.1 實驗材料
2.1.1 細胞株 (Cell line)
人類非小細胞癌細胞株H1299由臺灣大學醫學院毒理學研究所郭明良教授 實驗室提供 (National Taiwan University, Taipei, Taiwan)，人類肺腺癌細胞株A549 購自新竹食品科學研究所 (Hsinchu, Taiwan)，人類肺腺癌細胞株CL1-0由臺灣大 學醫學院楊泮池教授實驗室分離，醫學院毒理學研究所陳惠文教授實驗室提 供 (National Taiwan University, Taipei, Taiwan)。
2.1.2 抗體 (Antibody)
Anti-Ah receptor monoclonal Ab(B-11)、Anti-JAB1 monoclonal Ab(B-7)、Anti- ID1 monoclonal Ab(C-20) 、 Anti-Smad4 monoclonal Ab(B-8) 購 自 Santa Cruz Biotechnology, Inc.(CA, USA)；Anti-E-cadherin monoclonal Ab(24E10)、Anti-Snail monoclonal Ab(C15D3) 、 Anti-Smad1 polyclonal Ab(#9743) 、 Anti-phospho- smad1/5(ser463/465) polyclonal Ab(41D10)、Anti-Smad2 polyclonal Ab(D43B4)、
Anti-phospho-Smad2(ser465/467) polyclonal Ab(138D4) 、 Anti-Smad3 polyclonal Ab(C67H9)、Anti-Smad5 monoclonal Ab(D4G2)、Anti-smad6 polyclonal Ab(#9519) 購自 Cell signaling Technology ,Inc. (Beverly, MA, USA)；Anti-Vimentin polyclonal Ab 購自 GeneScript, Inc. (Piscataway, MJ, USA)；HRP-conjugated anti-mouse Ab、
HRP-conjugated anti-rabbit Ab 購自 Purkin Elmer Life Sciences (Boston, MA, USA)；
Anti-β-actin 購自 Millipore (Billerica, MA, USA) FITC-conjugate anti-mouse Ab、
FITC-conjugate anti-Rabbit Ab 購自 Sigma-aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)
2.1.3 質體 (Plasmid)
pcDNA3.1-AhR 、 AhR shRNA 購 自 中 央 研 究 院 RNAi 核 心 設 施
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(Taipei ,Taiwan)。pGL4.48 vector 購自 Promega Corporation (Madison, USA)。pRK5- LacZ 由中山醫學大學醫學研究所曾淑玲老師實驗室提供。
2.1.4 實驗藥品與試劑 (Drug and Reagent) 西方墨點法
N,N,N’,N’,-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)、Ammonium persulfate (APS) 、 Acrylamine/ bis-acrylamide 30% solution 、 Bradford reagent 購 自 Bio-Rad Lab.
(Hercules, CA, USA)；Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)、Potassium chloride (KCl)、ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) 、 Sodium dodecyl sulfate(SDS)、Protease inhibitor cocktail (leupeptin & aprotinin)、
sodium fluoride (NaF)、sodium orthovanadate (Na3VO4)購自 Sigma-Aldrich Co. (St.
Louis, MO, USA)；Methanol 購自 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA)；Tris base、
Tween 20 、 glycin 購 自 USB (Cleveland, OH, USA) 、 Bromophenol blue 、 β- mercaptoethanol (β-ME)、D-glucose、Sodium chloride (NaCl)、Nonidet® P-40、
Potassium chloride (KCl)、glycerol、Sodium hydroxide (NaOH)、Sodium bicarbonate (NaHCO3)、Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)、sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) 、 Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) 購 自 MERCK Chem. Co.
(Darmstadt, Germany) 。 ECLTM Western Blotting Detection Reagents 、 PVDF membranes 購自 Millipore (Billerica, MA, USA)。
細胞 mRNA 萃取與 RT-PCR
TriPure Isolation Reagent 購自 Roche (Taipei, Taiwan)、Isopropanol 購自 Riedel- de Haën (Seelze, Germany)、Chloroform、5x TBE (Tris/Borate/EDTA)、Agarose 購 自 Bio-Rad Lab. (Hercules, CA, USA)、Ethidium bromide (EtBr)購自 MERCK Chem.
Co. (Darmstadt, Germany)、ethanol 購自 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA)、MMLV
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Reverse Transciptase 1st-strand cDNA synthesis kit 購自 Epicentre Biotechnologies (Madison, WI, USA)、Taq DNA polymerase、Oligo-(dT)12-18 Primer 購自 InvitrogenTM life technologies (Carlsbad, CA, USA)。
免疫沉澱
PureProteome TM protein A Magnetic Beads 購自 Millipore Co. (MA, USA)
質體轉染
TurbofectTM Transfection reagent 購自 Thermo Fisher Scientific Inc. (TMO, USA)、
Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent 購自 Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)
Luciferase 冷光測定
Luciferase assay system kit 購自 Promega Corporation (Madison, USA)
其他
Human TGF-β1 購自 BioLegend Inc. (San Diego, CA, USA)、Hexadimethrine bromide (polybrene)購自 Sigma Chem. Co. (St. Louis, MO, USA)、MG132 購自 Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA)
2.2 實驗方法
2.2.1 肺癌細胞培養與繼代 (Cell culture and Subculture)
H1299 以及 A549 培養於含 10%胎牛血清 (Foetal bovine serum, FBS) (Biological Industries Ltd., Beit Haemek, Israel)的 Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM) (Invitrogen., Grand Island, NY, USA)；CL1-0、CL1-5 培養於含 10%FBS 的 RPMI-
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1640(Corning Incorporated,. MA, USA)；皆含 1% Antibiotic/antimycotic solution (Penicillin/Streptomycin/Amphotericin) (Biological Industries Ltd., Beit Haemek, Israel)、Sodium pyruvate、2mM L-glutamine solution (Corning, MA,USA)、2-[4-(2- hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid. (HEPES) (USB. Cleveland, OH, USA)、3.7g/L NaHCO3 (MERCK Chem. CO,. Darmstadt, Germany)培養液中，pH 值 約為 7.1~7.3 (Wang et al., 2001; ATCC)，置於 37℃、5% CO2、濕度 9.8%的細胞培 養箱中 (CO2 incubator SCA-165D, ASTEC CO., Ltd)，約放置二至三天使細胞生長 至八分滿後即需繼代培養。
細胞繼代方式係透過先將舊有培養液移除後利用 PBS 沿皿壁給予清洗掉殘 餘培養液，加入 1mL/10cm 1x Trypsin 後，回放於細胞培養箱待其作用 3~5 分鐘 確認細胞皆以懸浮後取出，補充適量培養液以中止 Trypsin 反應，將細胞懸浮液 收集至無菌離心管，以 900 rpm/3min 離心，爾後吸除上清液後加入適當培養液 透過微量吸管將其打散懸浮，以 1:3-4 比例分盤進行繼代培養，靜置隔夜後細胞 即會貼附至培養盤上後即可進行細胞實驗。
2.2.2 細胞總蛋白液收集 (Cell lysate collection)
將培養皿中貼附的細胞利用 PBS 仔細清洗兩次後，確認無殘留培養液後吸 除乾淨，加入適量 RIPA lysis buffer (50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EGTA、
1% nonidet® P-40、1mM PMSF、1mM Na3VO4、1mM NaF、1% protease inhibitor cocktail) 萃取出細胞內容物，利用細胞刮勺將細胞刮除下後收集於 1.5mL 微量 離心管之中，置於冰上靜待數分鐘後待 RIPA buffer 完全作用後，以 4℃、
14000g/15min 離心後收集上清液，利用 Coomassie® brilliant blue G-250 (CBG-250) 與蛋白質結合後會由紅棕色轉變為藍色的特性，透過測量 595nm 吸光值定量蛋 白濃度。
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2.2.3 西方墨點法 (Western blot)
抽取定量後蛋白質樣本與 4x SDS-PAGE sample loading dye (250mM Tris-HCl、
0.8%SDS、0.005% Bromophenol blue、40% Glycerol、β-mecaptoethanol)以 3:1 體 積比例混合均勻後，置於 95℃乾浴槽中加熱 5 分鐘後使蛋白質變性，即可透過 適當濃度的 SDS-PAGE 進行電泳分離，電泳於 running buffer (3g/L Tris-HCl、
1.44g/L glycine、1g/L SDS、20% methanol、pH7.8)中進行，電壓設定為 75-100 V。
待電泳分離蛋白質後進行轉漬 (Membrane Transfer )作業，轉漬濾紙先利用 Transfer buffer (5.8g/L Tris-HCl、2.9/L glycine、0.37g/L SDS、20% methanol、pH8.5) 潤濕，PVDF 轉漬膜則以 100% methanol 浸泡後，由電極正至負極方向依序為濾 紙-PVDF-gel-濾紙，置於 PantherTM Semidry Electroblotter (Owl separation systems, USA)，利用 400mA 約 40 分鐘進行轉漬。轉漬作業結束後將 PVDF 置於 5% (w/v) 脫脂奶粉進行 Blocking，接著和一級抗體反應於室溫 3 小時或隔夜，與二級抗體 反應於室溫一小時，反應完後皆以 TBST (10mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.05%
Tween 20、pH7.8) 清洗 3-5 次每次約十分鐘。最後利用 Enhanced chemiliminescent reagent (ECL)進行冷光呈色，以冷光影像分析系統 (UVP Auto Chemi Image System) 擷取影像，影像結果利用 ImageJ 做定量分析。
2.2.4 質體轉染 (Plasmid transfection)
H1299 細胞株利用 TurbofectTM Transfection reagent 進行轉染工作，依照其產 品實驗步驟進行，先將七至八分滿待實驗細胞更換 serum-free DMEM 使其 starvation 靜置培養箱 1 小時後更換含 10% FBS 培養液，爾後取 200μL serum-free DMEM 至 1.5mL 離心管，隨後依 1:3 比例依序加入適量 Plasmid DNA、Turbofect reagent 混和均勻後靜置室溫 20 分鐘後，滴入培養盤當中進行 24 小時轉染。
CL1-0 細胞株利用 Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent 進行轉染工作，
依照其產品實驗步驟進行，先將七至八分滿待實驗細胞更換 serum-free DMEM 使
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其 starvation 靜置培養箱 1 小時後更換含 10% FBS 培養液，爾後取兩管 100μL serum-free DMEM 至 1.5mL 離心管，個別以 1:2 比例加入適量 Plasmid DNA、
Lipofectamine reagent 與培養液均勻混合後靜置 1 分鐘，將 Plasmid/medium 混合 液加入至 Lipofectamine/medium 均勻混合後靜置室溫 20-30 分鐘後，滴入培養皿 當中進行 24 小時轉染。
2.2.5 慢病毒製備與感染 (Lentivirus production and infection)
本實驗流程根據標準步驟 (Zufferey et al., 1997)利用磷酸鈣沉澱 (Calcium phosphoate precipitation) 將質體送入至細胞，將 1x106 數量的 HEK 293T 種於 10cm 培養皿中，利用含 10%FBS DMEM 培養。接著將 5μg pMD.G (Envelope plasmid) 、 10μg pCMVΔR8.91(Package plasmid) 與 15μg pLKO.1 (AhR shRNA;
Transfer vector) 並加入無菌水補足體積至 250μL 置於 1.5mL 微量離心管中混合 均勻後，加入250μL CaCl2 (0.5M) 混勻，另取 500μL 2x HeBS (0.05M HEPES、
0.28M NaCl、1.5mM Na2HPO4，pH7.0) 於無菌管中，將含有 2x HeBS 之無菌管 以震盪器震盪時邊緩緩加入 DNA/CaCl2溶液，混合均勻後置於室溫 30 分鐘，最 後加入含有 DMEM 培養液的 293T 培養，12~16 小時後，以 8mL DMEM 更換，
收集更換後 24~48 小時之細胞培養液，以 4℃、2500rpm/5min 離心後收取上清 液，其中即含有重組慢病毒載體。
將上述取得之 500μL 病毒液以 3mL 培養液稀釋後，加入 8μg/mL polybrene (陽離子聚合物)，即可加入培養皿當中感染 A549 細胞，並於感染後 24 小時更換 正常培養液，2-3 天後即可進行實驗。
2.2.6 反轉錄聚合酶連鎖反應 (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)
全程於 RNase out 環境下進行。將細胞種於 6cm 培養皿當中，處理實驗所需
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時間以及轉染濃度後，將培養液吸除，利用 PBS 清洗確認無培養液殘留，之後 利用 1mL TriPure isolation reagent 刮取細胞置 1.5mL 微量離心管中。接著加入 0.5mL Chloroform 輕輕混勻後以 4℃，14000g/15min 離心，此時溶液會呈現三個 不相容層，取最上層澄清液至新的 1.5mL 微量離心管中，加入相等體積之 Isopropanol 並混合均勻置於-80℃冰箱 30 分鐘以上使其反應，接著將其取出後以 4℃14000g/15min 離心將 RNA 沉澱至底端。移除所有上清液體後加入 0.5mL 75%
ethanol 再一次以 4℃14000g/15min 離心，除去上清液之後使其自然風乾，最後再 加入 0.1% DEPC 水後回溶。
RNA 濃度利用分光光譜儀測量，波長為 260nm 和 280nm 的吸光值，以其比 例判斷 RNA 樣本品質，並且以 260nm 吸光數值為 RNA 濃度(1O.D = 40μg/mL)。
反轉錄 (reverse transcription, RT) 是利用 MMLV revese transcriptase 1st- strand cDNA synthesis Kit 並依照其建議實驗步驟進行。於 200μL PCR 微量離心 管中加入6μg RNA、1μL oligo(dT)12-18 primer，利用 DEPC 水補足體積至 24μL，
於 65℃作用 5 分鐘後加入混合液 16μL (2μL 100mM DTT、2μL 10x RT buffer、
1μL 10mM dNTP、0.5μL MMLV high performance reverse transcriptase)均勻混合後，
利用 PCR machine 於 42℃作用 60 分鐘，70℃作用 10 分鐘，終止反應後以此反 應產物 cDNA 即可進行 PCR 實驗。
PCR 所需引子序列如 Table1。接著進行 PCR 實驗，首先將 2μL cDNA、0.5μL 5μM forward primer 和 revese primer、10μL 2x KAPA Taq readyMix，並補足水至 20μL 混合均勻後進行 PCR。條件設定為 94℃作用 5 分鐘，進入 30 個循環之 94
℃/30s、60℃/30s、72℃/60s，最後於 72%作用 10 分鐘即完成 PCR 作業。
將所得 PCR 之產物進行電泳分析，膠體採用 1% agarose gel (1% agarose，
100mL 0.5x TBE buffer、5μg/mL EtBr、pH8.0)，於 0.5x TBE buffer 中固定電壓 100V 進行電泳作業，最後透過電泳膠體照相系統觀察，所得數位化結果利用 ImageJ 定量分析。
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2.2.7 免疫沉澱法 (Immunoprecipitation)
首先將細胞種於 10cm 培養皿經實驗處理後，將培養液吸除，利用 PBS 清洗 確認無培養液殘留，依照 2.2.2 步驟取得細胞總蛋白液，利用 RIPA 將其稀釋為 濃度 1mg/ml 之細胞液，接著加入 1μg/ml 待測抗體，置於 4℃可調速轉動器 (Rotor) 上轉動混勻並且放置隔夜，接著加入50μL Protein A magnetic beads 於樣品中，置 回 Rotor 轉動 3 小時，利用磁座將其上清液清除，並且利用 PBST (0.05% Tween 20/ PBS) 清洗磁珠，最後將上清液全部移除後，加入 4x SDS-PAGE loading dye 60μL，置於 95℃乾浴槽中加熱 8-10 分鐘，使磁珠上蛋白完全因變性分離後將磁 珠移除，即可進行西方墨點法。
2.2.8 細胞侵襲與傷口癒合法 (Cell invasion and wound healing)
細胞侵襲試驗根據 Yagel 等人之方法 (Yagel et al., 1989)，使用 8μm 孔徑的 transwell 培養盤，將 Matrigel 以不含血清的 DMEM 培養液五倍稀釋後注入 transwell 底部 (35μl/well)，至於 37℃一小時待其凝固後進行以下實驗。將細胞種 於 6cm 培養盤當中，經 pcDNA3.1-AhR 轉染後 24 小時後，將細胞以 1X trypsin- EDTA 將細胞分離，離心除去上清液之後，將 2x105 cells/well 細胞種於 transwell 中，並於下層空間注入含 10%FBS 之 DMEM，待測時間後，利用 4%甲醛固定細 胞 15 分鐘，再利用 Crystal violet 進行染色 40 分鐘，接著將底部清乾淨後放置顯 微鏡下觀察。Cell migration 則利用 2.2.4 的方式將 pcDNA3.1-AhR 質體轉染至固 定數目的 10cm 培養皿中，經處理時間 24 小時後，將細胞 sub-culture 分至 6cm 培養皿中觀察，部分組別加入 TGF-β 促進細胞爬行能力。利用 Tip 將已貼附細胞 刮除寬約莫為 2mm 的溝槽，以製造出模擬傷口偵測細胞移行能力。
2.2.9 SBE 冷光報導基因分析 (SBE Luciferase reporter assay)
本實驗依照 Luciferase assay system kit 所建議步驟進行。首先利用 pGL4.48-
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Luciferase plasmid (3μg) 和 pRK5-lacZ plasmid (1μg)、pcDNA3.1-AhR plasmid (5μg)，透過 2.2.4 方法將質體共同轉染入細胞中，之後放入 37℃培養箱靜置 22 小時，加入TGFβ 處理。處理完畢後，將 5x reporter lysis buffer 稀釋為 1x 後加 入200μL/6cm 培養皿中，利用刮勺將細胞刮下後收集細胞液至 1.5ml 微量離心管 中以 14000g/10 分鐘離心，取其中 20μl 上清液加入 50μl luciferase assay substrate，
利用冷光光譜分析儀 (Oroin L microplate luminometer) 進行偵測；另外取上清液 100μl 加入 500μl β-Gal buffer (60mM Na2HPO4、40mM NaH2PO4、10mM KCl、
1mM MgCl2、50mM β-ME) 、 100μl 含 2mg/ml ONPG (ortho-nitrophenyl-β-D- galactopyranoside) substrate 在 37℃反應 2 小時，利用 β-galactosidase assay 呈色 反應，以酵素免疫自動判讀機 (Thermo) 利用 405nm 吸光測定讀值，作為 Luciferase assay internal 標準。
2.2.10 統計分析 (statistic analysis)
統計方法利用 ImageJ、Graph pad 統計軟體計算，採用 one way ANOVA，
當 p<0.05 認定其結果具有顯著性的統計上差異，並且本實驗中均為重複三次以 上且均為獨立操作，實驗數據結果以平均值加減標準偏差 (mean ±S.E.)來做為 表示。
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第三章
結果
Results
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第三章 結果(Results)
3.1 於肺癌細胞中大量表現 AhR 能夠透過 EMT 抑制細胞侵襲能力
為了探討 AhR 是否對於肺癌細胞 invasion 的影響與其關係，本實驗首先利 用 Western blot 觀察三株不同肺癌細胞株：H1299、CL1-0、A549 的 AhR 蛋白表 現量，並且透過 in vitro Transwell assay 得知各株細胞其侵襲 (invasion)能力 (Figure 1A)，實驗結果顯示，A549 的 AhR 蛋白表現量明顯大於 H1299 以及 CL1- 0，而 H1999 以及 CL1-0 則幾乎不表現 AhR；且在顯微鏡下可以觀察到 A549 細 胞型態為短紡錘狀，CL1-0 以及 H1299 細胞外觀則大致呈現圓形，並且在三株癌 細胞的 Invasion 能力中，H1299 則表現出較強的 invasion 能力，而 CL1-0 和 A549 則不太產生 invasion。所以往後實驗利用 H1299、CL1-0 作為探討，而 A549 則 做為反證工具，且因為 CL1-0 invasion 能力較不明顯，故 Transwell 相關實驗以 H1299 細胞株為主，以求得到較為明顯的實驗結果。
在得知其原始 AhR 蛋白表現後，欲探討其 AhR 於不存在 ligand 時，AhR 表 現量改變後對於細胞的影響。首先為了取得 H1299 以及 CL1-0 細胞轉染 pcDNA3.1-AhR 的時間曲線以及劑量關係 (Figure 1B)，將 2x108數目的細胞轉染 5μg 的 pcDNA3.1-AhR，大量表現 AhR 6、9、12、24 小時後，觀察其 AhR 的變 化量，實驗結果得知在送入 plasmid 後的 9 小時便開始有 AhR 的呈現 3-4 倍左右 的大量表現，並且持續增加至 24 小時，此時；而在劑量的實驗，本實驗透過送 入1μg、5μg 不同量的 plasmid，觀察其 AhR 的改變量，實驗結果得知 5μg 的組 別擁有較為明顯的 AhR 表現，大約有 5-8 倍的增加，所以往後實驗的依據採用 5μg/24hr 為基準。
在取得實驗條件後，觀察 AhR 與細胞的 invasion 能力是否具有相關性 (Figure 1C)，結果顯示大量表現 AhR 後的細胞，於 Transwell 下層的細胞數量較 低，經統計結果，對照組具侵襲能力的細胞數設為 1，而大量表現的組別則為對 照組的 0.2 倍，具有統計上的差異 (p<0.001)，可以證明細胞的 invasion 能力受到
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抑制，另一方面利用 A549 細胞株做為反證實驗，用慢病毒轉染的方式將 AhR shRNA 送入細胞中，試圖將 AhR 靜默，實驗結果顯示在將 AhR 靜默後，其 invasion 有明顯增加的趨勢。綜合以上，證實 ligand-independent AhR 而改變 AhR 蛋白表 現量，會進一步影響細胞的 invasion 能力，且 AhR 可能具有抑制細胞轉移的功 能。
過去研究文獻指出 Metastasis 可能會透過 Epithelial- mesenchymal transition (EMT) 造成細胞的轉變，進一步改變細胞的遷移能力，所以接著本實驗希望了解 是否 EMT 現象參與其中，所以透過 H1299、CL1-0 細胞中大量表現 AhR 後，觀 察其 Epithelial marker E-cadherin 以及 mesenchymal marker Vimentin，於 (Figure 1D)結果顯示大量表現 AhR 後，H1299 並無表現 E-cadherin，而 CL1-0 則有 E- cadherin 表現增加的現象，而在 Vimentin 的部分則可以觀察到，兩株細胞皆因為 大量表現 AhR 的緣故而導致 Vimentin 的減少，且都具有顯著性的差異。
參考過去研究顯示，EMT 的發生，可能與其轉錄因子的改變有關，所以本 實驗進一步探討參與的 EMT transcriptional factor：snail、ID1 是否因為 AhR 的大 量表現後而表現受到影響。實驗結果顯示 (Figure 1E)，在大量表現 AhR 的細胞 其 EMT 相關的轉錄因子蛋白表現量皆受到抑制，統計圖可以見到大致都具有表 現量減半的情形，另一方面透過 AhR-slienced A549 則可以看到 snail、ID1 相較 於對照組有明顯增加的趨勢，所以細胞中 AhR 的含量，會透過影響 EMT 轉錄因 子的表現量進而造成 EMT 的現象發生，並且導致細胞的 invasion 能力增加。
3.2 AhR 蛋白透過抑制 smad4 表現進而干擾 TGF-β/BMP pathway 的活化 過去文獻顯示 TGF-β/BMP pathway 與細胞發生 EMT 具有高度相關性，所以 認為上述實驗中所看到之 ligand-independent AhR 的表現量會影響 EMT 轉錄因 子的現象，是否與 TGF-β/BMP 這條路徑有關，並且過去研究也顯示，EMT 轉錄 因子會受到 TGF-β，例如 snail；或者受到 BMP 的刺激而增加 ID family 其生合
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成，都會隨著 TGF-β/BMP 路徑的活化而表現。所以本實驗持續探討，AhR 的表 現量的改變所觀察到的 EMT 現象是否因為 TGF-β/BMP pathway 受到影響所致。
因為 TGF-β/BMP pathway 主要是透過 smad 家族來使其訊號傳遞，所以本試驗首 先利用 CL1-0 以及 H1299 細胞中，大量表現 AhR 後檢測 smad1-7 蛋白表現量 (Figure 2A)，實驗結果顯示在所有 smad 蛋白中，唯有 smad4 會因為大量表現 AhR 的緣故而受到抑制，且到達顯著的差異性，進一步觀察 AhR 與 smad4 之間是否 具有劑量-效應關係 (Figure 2B)，將 1μg、5μg 的 pcDNA3.1-AhR Transfect 至細 胞中，然後檢測 smad4 的變化量。實驗結果顯示，在 1μg 的組別中，smad4 所減 少的量不及5μg 所造成 smad4 的改變量，顯示隨著 AhR 的含量改變，smad4 會 具有劑量效應關係。因為 smad4 扮演一個輔因子 (co-factor)的角色，會隨著 TGF- β/BMP pathway 的活化，幫助上游受到活化的 R-smad 進入到細胞核當中進行轉 錄工作。進一步觀察 smad-binding element (SBE)的啟動子活性 (Figure 2C)，於 H1299 細胞株當中，利用 SBE 冷光酶分析法做驗證，將實驗分為四組，分別為 對照組、大量表現 AhR 組、TGF-β 組、大量表現 AhR 並處理 TGF-β 組，且每組 都皆轉染 pGL4.48 SBE Luciferase vector 以及 pRK5-LacZ 作為冷光表現以利偵 測，結果顯示在共同處理的組別相較於單獨給予 TGF-β 的組別，其 SBE 啟動子 的活性具有明顯受到抑制，活性由原先的 1.6 倍降至 0.9 倍，顯示了大量表現 AhR 會透過抑制 smad4 的方式，進而干擾 TGF-β/BMP pathway 的激活，並且影響其 結合至 SBE 的能力，造成 TGF-β 的刺激無法正常傳遞。
3.3 AhR 的蛋白表現量增加會促進 smad4 透過泛素-蛋白酶體路徑的降解
在得知 smad4 會受到 AhR 的影響而改變蛋白表現量，欲了解是透過甚麼方 式造成此現象，首先透過 RT-PCR 試圖明瞭 smad4 的基因表現是否受到改變 (Figure 3A)，Primer sequence 如 Table1，大量表現 AhR 後 12hr 後檢測 Smad4 的 mRNA 表現，實驗結果得知在 smad4 的 mRNA 的層面並不會因為 AhR 而影響，
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所以排除在轉錄層次時受到抑制，進一步觀察 smad4 的表現量減少是否因為降 解所致，本實驗利用 H1299 以及 CL1-0 細胞，將細胞大量表現 AhR 22 小時，在 進一步透過 proteasome 抑制劑 MG132 10μM 處理兩小時，接著觀察其 smad4 的 表現量，實驗結果顯示 (Figure 3B)，原先受到 AhR 抑制的 smad4 在處理 MG132 後有明顯回升的情形，由此得知 smad4 的降解工作可能是透過 proteasome 來完 成。
欲利用 proteasome 來達到降解目的，先決條件是必須藉由 E3 ubiquitin ligase 將 ubiquitin 接上目標蛋白，方能送至 proteasome 完成降解，所以在此本實驗欲 探討，假設 smad4 是因為 proteasome 而表現量受到抑制，那當 smad4 做為目標 蛋白時，是否被接上 ubiquitin。利用免疫沉澱法檢測 smad4 與 ubiquitin 之間的交 互作用，將收取的蛋白總液加入 smad4 antibody 使其與 smad4 蛋白做結合後，透 過 western blot 偵測 ubiquitin。實驗結果證實 (Figure 3C)，大量表現 AhR 的細胞 中，ubiquitinated-smad4 的蛋白含量明顯高於對照組，證實 AhR 的大量表現，會 造成細胞內的 ubiquitin 被大量地接上 smad4，一旦被接上大量 ubiquitin 後，smad4 便會被送至 26S proteasome 進行降解。
3.4 大量表現 AhR 導致 Jab1 以及 smad4 間的交互作用力增強
上述實驗中得知，當細胞當中大量表現 AhR 時，smad4 會被接上大量的 ubiquitin，此時 smad4 會被 proteasome 所辨認出來，進行 ubiquitin-proteasome pathway 的降解。在過去文獻當中顯示，Jun 活化結合蛋白 (Jun-Activation Domain- Binding Protein, Jab1) 能夠扮演誘導 smad4 ubiquitination 的角色，使其身上帶有 ubiquitin (Wan et al., 2002)。所以本實驗持續探討 Jab1 於大量表現 AhR 細胞中的 關係，首先是否因為大量表現 AhR 後導致 Jab1 的表現量改變所致，首先利用 Western blot 的方式觀察 Jab1 的蛋白含量是否發生改變，實驗結果顯示 (Figure 4A)，在大量表現 AhR 的細胞中，並沒有觀察到 Jab1 的含量有改變，所以排除
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了 Jab1 的表現所致；進一步懷疑是否在大量表現 AhR 後能夠誘導 Jab1 與 smad4 之間的交互作用增強，所以透過免疫沉澱法的方式判斷，首先將細胞總液抽取出 來後，各自加入 Jab1、smad4 antibody，使其細胞液中蛋白質與抗體結合，再進 一步透過 western blot 的方式偵測其含量以確認 Jab1 與 smad4 間的交互作用，實 驗結果顯示，在大量表現 AhR 的細胞中，利用 Jab1 antibody 捕捉的免疫複合物 中，所偵測出來的 smad4 量明顯高於對照組，並且另一方面透過 smad4 antibody 捕捉的免疫複合物中的 Jab1 量也同樣高於對照組，可以證實，當細胞大量表現 AhR 後，會使得細胞當中的 Jab1 與 smad4 之間的交互作用增加，而這樣的交互 作用一旦增加，便會造成 smad4 蛋白上所被接上的 ubiquitin 增加，進一步造成 smad4 被降解。透過 CL1-0 細胞株再次驗證 (Figure 4B)，也得到類似的結果，再 一次證實 AhR 確實於 Jab1 與 smad4 間交互作用中扮演一特定角色，並且會隨著 AhR 的量而導致交互作用增加。
3.5 AhR 抑制 TGF-β/BMP pathway 的目標蛋白
透過以上實驗得知，AhR 能夠藉由增加 Jab1 與 smad4 間的交互作用，使得 ubiquitin 被接至 smad4 上，一旦被接上大量 ubiquitin 後，smad4 便會被送至 26S proteasome 進行降解，缺少了 smad4 的輔助，會影響 TGF-β/BMP pathway 的訊 號傳遞工作，並且造成 TGF-β/BMP 的激活受到阻礙，使 SBE 報導基因無法順利 被活化，然而這樣的現象是否會導致 TGF-β/BMP 存在之下，EMT 相關的轉錄因 子也受到抑制。所以本實驗透過 H1299 以及 CL1-0 中大量表現 AhR 22 小時後，
給予 TGF-β 20ng/ml 或 BMP 10ng/ml 後處理 2 小時，並觀察正常情況下 TGF-β 所誘導的 EMT 相關轉錄因子 snail 以及 BMP 所誘導的 ID1 是否發生變化。
Western blot 的結果顯示 (Figure 5A)，當細胞被大量表現 AhR 後，再受到 TGF- β 或 BMP 的刺激時，細胞被誘導出來的 snail、ID1 相較於單獨處理 TGF-β 或 BMP 的組別，表現量明顯較為減少，顯示了受到刺激的細胞，因為 TGF-β/BMP
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pathway 受到抑制而導致，另外一方面，利用 A549 再一次證實此現象，將 A549 靜默 AhR 後，如同上述實驗步驟，觀察其受到 TGF-β/BMP 刺激後，目標蛋白的 表現量。結果顯示，當 A549 因為 AhR 表現受到抑制， smad4 表現增加，使得 受到 TGF-β/BMP 刺激後，大量活化後的 R-smad 與 smad4 進入到細胞核當中，
進行轉錄工作，造成 EMT 相關轉錄因子 snail、ID1 被大量製造出來，而這樣的 現象證實了 AhR 能夠透過影響 TGF-β/BMP pathway 路徑中的輔因子 smad4，使 得 EMT 相關轉錄因子發生改變，進一步促使細胞發生 EMT 或 MET 的現象。
3.6 AhR 參與肺癌細胞透過 EMT 現象所導致的侵襲能力改變
藉由上述實驗中得知，AhR 的大量表現能夠抑制癌細胞發生 EMT 現象，
然而這樣的結果是否最終導致細胞 migration 的改變，所以本實驗持續透過 Wound healing assay 測試細胞的 migration 是否具有差異，透過實驗結果可以得 知 (Figure 6A)，大量表現 AhR 的組別即已可以觀察到 cell migration 能力受到 抑制，再利用 TGF-β 共同處理後可以看到，單獨處理 TGF-β 的組別因為受到 TGF-β 的刺激之後，會促進其細胞的 EMT 現象，導致 cell migration 有相當明 顯的增加，然而在大量表現 AhR 後再給予 TGF-β 刺激，則可以看到原先應該 增加的 cell migration 受到了抑制，顯示大量表現 AhR 確實可以抑制 cell migration，反之，透過 A549 作為反證 (Figure 6B)，可以看到 AhR 靜默的 A549 的 cell migration 明顯增加。綜合以上實驗，我們認為 AhR 會改變肺癌細 胞的 cell migration，且可能原因為藉由抑制 TGF-β pathway 中的 smad4 達到阻 斷細胞 EMT (Figure 7)。
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