第二章、 材料與方法
第二節、 實驗方法
三、
碳酸鈣附著能力測試以 RO 水配製 0.2% 及 2% 一般碳酸鈣與奈米級碳酸鈣水溶液，施倒於直 徑 9 cm 的 PP 塑膠材質圓形培養皿，靜置於室溫 25 ℃，於 14 天後待其水分 完全蒸發，拍照記錄並觀察外觀，以 Adobe Photoshop CS5 軟體計算附著分布 面積，附著區塊以附著面積比率呈現，計算公式為附著分布面積 / 直徑 9 cm 的 圓形培養皿面積 × 100。以鐵勺清筆畫過目標區觀察附著黏力，拍照記錄並觀察
外觀。
四、
鈣離子葉片總含量檢測取葉片樣本約 0.5 g 以研缽壓榨出葉部汁液，反覆吸放三次後，取約 200 µL 於筆式鈣離子度計 (HORIBA, LAQUAtwin, japan) 參照廠商給予之操作說明書 進行鈣離子含量測量，並以樣本重量標準化。
六、
病原菌接種方法P. syringae pv. tomato (Pst) DC3000 接種分為菌液浸泡、葉部抽氣及擦手紙 浸泡三種方法。接種前先將培養 18 小時的病原菌以 RO 水將菌液調整至 107 CFU / mL。菌液浸泡方法為將番茄植株子葉以上地上部浸泡於 107 CFU / mL P.
syringae pv. tomato DC3000 (含 0.025 % Silwet L-77 surfactant, Helena Chemical,
US) 菌液內 10 秒鐘，之後以塑膠袋套袋保濕，靜置 7 天待其葉部產生病斑後，
菌落數計算，並以樣本重量標準化。
pH 5.8)，經震盪機均勻震盪 10 秒後，以 12,000 g 離心 20 分鐘取 10 μL 上層
十、
即時聚合酶鏈鎖反應 (Quantitative real time polymerase chain reaction, Q-RT –PCR)取番茄葉部組織，利用總量 RNA 迷你試劑 (Tissue Total RNA Mini Kit) (Favorgen, Taiwan) 抽 取 植 物 葉 部 組 織 總 量 RNA ， 經 由 MMLV Reverse Transcription kit (Protech, Taiwan) 將 1 μg RNA 反轉錄成 cDNA，再加入 1 μL 10 mM Q-Forward primer, Q-Reverse primer (Blossom, Taiwan) (附錄 20)、2 μL 10X PCR 緩衝液、1 μL 2.5 mM dNTP、0.1 μL 5 units / μL Pro Taq DNA polymerase、
10 μL 2X super SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, US) 與無菌水
體積填補至 20 μL，以 Quantitative real-time PCR StepOne 儀器 (附錄 21) 進行 Teaching Chlorophyll Fluorometer, WALZ, Germany) 配合 WinControl-3 軟體 (WALZ, WinControl-3 Software) 參照廠商給予之操作說明書進行測定。本研究以 Fv / Fm（最大螢光參數）的比值代表光合作用胞器生理狀況的參數，Fm 是黑暗 狀態下，照射飽和光源後螢光最高值，其數值會受到葉片處於暗適應與光適應狀
態而變動，為準確測定Fm 值，參照說明書建議於測定前先將番茄植株於黑暗環 生長。培養 42 及 46 小時後於分光光度計 (U-1900 UV-VIS spectrophotometer, Hitachi) 測 OD 值，以 Rd4 標準曲線進行菌數計算。
十五、
植株莖部與土壤 pH 值檢測植株莖部 pH 值，取離番茄植株地上部 1 cm 處向上計算 3 cm 長莖部組 織，放至研缽加入 10 mL RO 水進行研磨，以酸鹼測定儀 (MP200 pH-meter, METTLER Toledo, Switzerland)，測定溶液 pH 值。
土壤 pH 值，將施倒藥劑 2 天後植株於盆栽底底部洞口擠出土壤溶液 10 mL，以酸鹼測定儀 (MP200 pH-meter, METTLER Toledo, Switzerland)，測定溶液 pH 值。
十八、
統計分析方法本實驗所有數據皆經由 SPSS 12.0 統計軟體，單因子變異數分析 (One way analysis of variance, ANOVA)，進行 Fisher 的最小顯著差異性檢定分析 (Fisher
｀s protected least significant difference test, LSD test)，以不同英文字母 (a,b,c) 標 示，代表統計分析結果具有顯著差異 (p＜0.05)。平均值 + 標準誤差。比較平均 數經由 Microsoft Excel 2013 計算所得。