國立臺東大學生命科學系

國立臺東大學生命科學系

Department of Life Science National Taitung University

碩士論文 Master thesis

指導教授 : 黃祥恩博士 Advisor : Dr. Hsiang-En Huang

運用奈米級碳酸鈣促進番茄生長及對生 物性與非生物性逆境的抵抗能力

Application of nano-calcium carbonate for promoting growth and tolerance to biotic

and abiotic stresses in tomato

研究生：陳俊任撰

Graduate student：Jun-Ren Chen 中華民國 一百零七 年七月

July, 2018

謝誌

碩士班訓練來到了尾聲，當初僅是沒有人生目標的隨波逐流進到實驗室，隨 著各種緣分與機會，到現在能做出如此厚重份量內容的論文。在這個的過程中感 謝有 黃祥恩 老師在一旁辛勤的執導，讓我在做實驗的目的與方向上有更加清楚 的了解，並且在我每次做出不知該如何解釋的結果時，提供了非常實用的想法與 建議，在此特別感謝老師在課業上與實驗上的指導，此外也感謝老師這幾年來讓 我有許多機會能夠參與校內與校外的學術研討會，並且訓練了我在台上演講的各 種技巧，讓我能不怯懦的將我們的研究成果以最佳的表現分享給大家了解，最後 再次感謝老師在我不成熟的論文寫作上，將如此繁多的內容逐一修改到能讓人了 解的內容，此外也十分感謝老師在兩年來除了實驗與課業，也會與我們分享許多 出了社會相當受用的概念與道理，也感謝老師提供了與台茂奈米生化公司產學合 作的奈米級碳酸鈣試驗計畫的機會，讓我在毫無目標的學習過程中有了一個明確 且值得堅持的題目方向。

碩士班訓練的尾聲中，感謝 林乃君 與 葛孟杰 老師在暑假的期間，特別坐 上漫途的火車來到台東，聽著我兩年來的研究成果，並且修改我那些具有爭議且 過於武斷的中文說明與文句和文法不正確的內容，並且不辭辛勞的在旁註解需要 修改的地方，讓我能有機會把具有瑕疵的文字內容修正好，更加提升論文的品質。

此外感謝系主任 李俊霖 老師找到資金填補缺乏資源的生科系，並且在這兩年中 辛勤的處理系上跳電、滅菌釜、製冰機等儀器故障與維修，讓我有能正常運作的

儀器資源使用並且完成實驗。最後格外感謝系上行政助理 蘇怡菁 學姐，協助我

在口頭考試申請時需要準備哪些資料，並且讓我能順利畢業。還有感謝台茂奈米 生化公司提供我最主要的實驗材料與學術上的交流。

碩士班研究的過程中非常感謝 蔡嘉榮 同學，協助我在台東大學試驗農場的 田間試驗中，根據其在室外作物耕作的豐富經驗，提供我這個農業新手專業的建 議與優良的資源，讓我能順利將番茄植株正常的培養長大，此外還要感謝已畢業 的學長姐們在實驗技術與概念上的指導，以及協助我的實驗完成。感謝家人在碩 士班兩年來的支持，讓我在研究中不用擔心生活物資與金錢上的缺乏，使得我在 研究中能心無旁鶩，並且順利完成碩士學位，最後再次感謝在我兩年碩士生涯期 間的家人、師長、學長姐、同學與學弟妹一路上的互相幫忙扶持，在未來的生活 與事業裡祝福大家平安順利。

陳俊任謹誌 107 年于臺東大學

運用奈米級碳酸鈣促進番茄生長及對生 物性與非生物性逆境的抵抗能力

學生 : 陳俊任

國立台東大學生命科學系 (所)

中文摘要

鈣離子為植物控制病害及環境逆境所需的礦物元素之一，過去的

研究顯示鈣離子不但可以幫助植物強化細胞壁的物理結構，也可以作 為二次訊號傳訊分子與鈣調蛋白結合啟動過氧化物 (Reactive oxygen species, ROS) 的調控反應，藉以誘發系統性獲得抗性反應 (Systemic acquired resistance, SAR) ，另外鈣離子也參與了許多植物賀爾蒙的運 送與活化。雖然上述的研究結果顯示，鈣離子對於植物的生長發育扮 演著不可或缺的角色，然而大部分的植株對於鈣離子的吸收並不容易。

因此本研究為了解決有效利用鈣離子的問題，選用經過高溫高壓條件，

將鈣離子鍛燒為 60 奈米直徑的奈米級鈣離子團粒作為研究材料，探

討這樣經過奈米化的鈣離子，能否增加番茄植株對於鈣離子的吸收效

率，進而應用於田間耕作。實驗結果顯示，奈米級鈣離子比一般碳酸

鈣更容易懸浮於水溶液、且不易沉澱，也更容易被番茄植株吸收進入

葉部組織，達到幫助植株生長的目的。此外奈米級鈣離子也可以提升

番茄植株對於番茄葉片細菌性斑點病菌 [Pseudomonas syringae pv.

tomato (Pst) DC3000] 的抵抗能力。當番茄植株受到 Pst DC3000 病原

菌感染時，奈米級鈣離子能有效幫助植株快速產生過氧化物 H

O

及 過氧化物清除酵素 (peroxidase , POD)活性，且也能幫助番茄增加水 楊酸 (salicylic acid, SA) 介導的抗病路徑標記基因 PR1 的表現量，並 在感染後期降低氧化壓力指標丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 的累 積量。除了

氯化鈉造成的鹽害逆境、紫外線 UV-C 造成的傷害、青枯病菌

(Ralstonia solanacearum)、炭疽病菌 (Colletotrichum gloeosporioides) 等的抵抗能力，而且可以避免一般碳酸鈣施用時所引起的乾旱缺水逆 境。最後在 2017 年 11 月-2018 年 5 月期間在台東大學試驗農場進行 田間試驗，實驗結果顯示，每週施用 100 mL 的 0.2%及 2%奈米鈣，

均可以有效增加番茄植株的高度、葉片、花苞、花朵、青果及熟果的 數目。而該奈米鈣澆灌植株的葉片及果實也對於病原菌

及

示，藉由奈米級的鈣離子能有效增加番茄植株對於鈣離子的吸收，進 而同時幫助植株生長及抵抗鹽害、 UV 等逆境及 R. solanacearum、Pst DC3000、C. gloeosporioides 等多種病原菌的感染。

關鍵詞：奈米級鈣離子、番茄、生長發育、生物性逆境、非生物性逆境

Application of nano-calcium carbonate for promoting growth and tolerance to biotic and abiotic stresses in tomato

Author : Jun-Ren Chen

Abstract

Calcium ion is one of the mineral elements that plants need to control disease and environmental stresses. Past studies have shown that calcium ion not only helps plants strengthen the physical structure of the cell wall, but also acts as a second messenger that binds to calmodulin and initiates the regulation of reactive oxygen species (ROS) to induce systemic acquired resistance (SAR). In addition, calcium ions are also involved in the transport and activation of many plant hormones.

Although the above results showed that calcium ions play an indispensable role in growth and development of plants, most plants do not easily absorb calcium ions. In order to solve the problem of ineffective use of calcium ion, we used calcium ions calcined as 60 nm diameter nanoscale calcium ions under high temperature and pressure conditions as our research material in this study. To investigate whether such nano-sized calcium ions can increase the absorption efficiency of calcium ions in tomato plants and thus be applied it to field cultivation.

The experimental results show that nano-scale calcium ions are easier to

be suspended in aqueous solution, not easily precipitated,and more easily

absorbed by tomato plants into leaf tissus to help plant growth than

ordinary calcium carbonate. In addition, nano-scale calcium ions can

enhance tomato plant resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000. When tomato plants are infected with Pst DC3000 pathogens, nanoscale calcium ions can effectively help plants produce H

O

and increase peroxidase (POD) activity, and also help increase the expression of the tomato salicylic acid (SA) mediated marker gene, PR1 and reduces the cumulative amount of malondialdehyde (MDA) in the later period of infection. Besides Pst DC3000, nano scale calcium ions can also increase tomato resistance to stress caused by sodium chloride, UV-C-induced damage, Ralstonia solanacearum, Colletotrichum gloeosporioides, etc.

and has ability to prevent drought stress caused by ordinary calcium carbonate application. Finally, the field experiment was conducted at the experimental farm of National Taitung University from November 2017 to May 2018, and the results showed that application of 100 mL of 0.2%

and 2% nano calcium carbonate per week can effectively increase the height and numbers of leaves, buds, flowers, unripe fruits, ripe fruits of tomato plants. The leaves and fruits of the nano calcium carbonate watered plants also have good resistance to pathogens Pst DC3000 and C.

gloeosporioides. Taken together, the above results show that the use of

nanoscale calcium ions can effectively increase the absorption of calcium ions in tomato plants, and help plant growth and resistance to salt, UV, R.

solanacearum, Pst DC3000, C. gloeosporioides, etc. at the same time.

Keywords : nanoscale calcium, tomato, growth and development,

biological stress, abiotic stress

目錄

謝誌……….i

中文摘要………...iii

英文摘要………....v

圖目錄………...xi

第一章、 前言……….1

第一節、鈣離子的功用……….1

一、碳酸鈣的運用……….1

二、鈣離子為構成植物細胞結構的元素……….1

三、鈣離子能作為抗病及逆境反應的二次傳訊物質協助植物快速傳訊….2 四、鈣離子對於植物賀爾蒙吉貝素與生長素的影響……….3

五、植株對於鈣離子的吸收與運輸……….5

第二節、奈米化材料的特性……….6

一、奈米化材料因徑粒大小極為細小而產生的性質變化……….6

第三節、非生物性逆境與生物性逆境對於植株的影響……….7

一、鹽害逆境對植株的影響……….7

二、UV 逆境對植株的影響……….8

三、乾旱逆境對植株的影響……….9

四、Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 對植株的影響………10

五、青枯病對植株的影響………...11

六、炭疽病對植株的影響………...12

第四節、研究動機與目的………...13

第二章、 材料與方法………...14

第一節、實驗材料………...14

一、植株材料與培養條件………..14

二、奈米級碳酸鈣與一般碳酸鈣………..14

三、植物生長相關賀爾蒙與抑制劑………..15

四、微生物材料與培養條件………..15

第二節、實驗方法………..16

一、碳酸鈣水溶液懸浮能力測試………..16

二、碳酸鈣水溶液結晶團粒觀測………..16

三、碳酸鈣附著能力測試………..16

四、鈣離子葉片總含量檢測………..17

五、番茄植株生長觀測………..17

六、病原菌接種方法………..18

七、植株葉片環境過氧化氫含量檢測………..19

八、植株葉片環境過氧化氫酶活性檢測………..19

九、植株葉片環境丙二醛含量檢測………..20

十、即時聚合酶鏈鎖反應 (Quantitative real time polymerase chain reaction, Q-RT –PCR) ………20

十一、非生物性逆境處理方法………..21

十二、葉片光合作用效率………..21

十三、碳酸鈣對環境水分流失檢測………..22

十四、pH 值與奈米鈣對青枯病菌生長影響測試………22

十五、植株莖部與土壤 pH 值檢測………...23

十六、真菌性植物病原菌對峙培養………..23

十七、真菌性植物病原菌孢子發芽率檢測………..23

十八、統計分析方法………..24

第三章、 結果………..25

第一節、奈米級碳酸鈣與一般碳酸鈣物理性質比較………..25

一、奈米級碳酸鈣水溶液的物理特性………..25

二、奈米級碳酸鈣附著能力較好………..25

第二節、奈米級碳酸鈣對番茄植株吸收及生長的影響………..26 一、番茄植株較容易吸收奈米級碳酸鈣………..26 二、奈米級碳酸鈣幫助番茄植株生長的能力較一般性碳酸鈣佳…………27 第三節、鈣離子對番茄植株抵抗 P. syringae pv. tomato DC3000 能力的影響.28 一、鈣離子施用能提高番茄抵抗 P. syringae pv. tomato DC3000 的能力.28 二、奈米級碳酸鈣提高番茄植株受到 P. syringae pv. tomato DC3000 感染 後 H2O2 的累積量及 POD 酵素活性………28 三、奈米級碳酸鈣在番茄植株受到 P. syringae pv. tomato DC3000 感染時 能降低 MDA 累積量………29 四、奈米級碳酸鈣在番茄植株受到 P. syringae pv. tomato DC3000 的感染 時能提高番茄植株抗性基因表現量……….29 第四節、奈米級碳酸鈣對其他逆境的影響……….30 一、奈米級碳酸鈣能降低鹽害與 UV 逆境造成的損傷………...30 二、奈米級碳酸鈣能幫助番茄抵抗 R. solanacearum 與 C. gloeosporioides 的感染……….31 三、奈米級碳酸鈣能避免ㄧ般碳酸鈣施用引起的乾旱逆境……….32 第五節、土壤介質的水分含量會影響番茄對鈣離子的吸收……….33 一、番茄在土壤水分含量過高的環境較不易吸收奈米級碳酸鈣……….33 二、奈米級碳酸鈣在含水量過高的環境無法幫助番茄植株抵抗 P. syringae pv. tomato DC3000 的感染………..………….34 第六節、奈米級碳酸鈣與植物吉貝素及生長素的交互作用……….34 一、奈米級碳酸鈣會降低吉貝素與巴克素影響番茄生長的效果……….35 二、奈米級碳酸鈣不會影響生長素促進番茄生長與 NPA 抑制番茄生長的 效果……….35 三、巴克素與生長素會抑制奈米級碳酸鈣提升番茄植株抵抗鹽害逆境的效

果……….35

四、吉貝素、生長素和 NPA 會破壞奈米級碳酸鈣幫助番茄抵抗 R. solanacearum 的效果……….36

第七節、奈米級碳酸鈣在溫室試驗中對番茄的影響………..36

一、奈米級碳酸鈣在溫室試驗中能促進番茄生長並提高繁殖組織數量...36

二、奈米級碳酸鈣施用能幫助網室番茄延緩植株自然老化的現象………37

三、奈米級碳酸鈣施用能幫助網室番茄抵抗 P. syringae pv. tomato DC3000 與 C. gloeosporioides 的感染………38

第四章、 討論………40

第一節、碳酸鈣奈米化後的物理性質差別………40

第二節、奈米級碳酸鈣有利於植株吸收並促進生長與抗逆境能力…………...41

第三節、奈米級碳酸鈣幫助植株抗病的機制………...42

第四節、土壤環境水分含量對於施用奈米級鈣離子效率的影響………...45

第五節、鈣離子與吉貝素及生長素在生長上與抗病上的交互影響………46

第六節、奈米級碳酸鈣使用室外溫室能幫助番茄生長與抗病………48

第七節、結論與未來展望………48

第五章、 參考文獻………50

圖目錄

圖1、奈米級碳酸鈣水溶液懸浮能力及結晶團粒大小比較測試。………..65

圖2、奈米級鈣離子與一般碳酸鈣蒸發後附著能力的比較。………..67

圖3、奈米鈣與一般碳酸鈣對番茄葉部鈣離子含量測試。………..69

圖4、奈米級鈣離子與一般碳酸鈣對番茄植株生長的影響。………..71

圖5、奈米級鈣離子與一般碳酸鈣對番茄抵抗 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 能力的影響。………..73

圖6、奈米級鈣離子對番茄接種 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 後葉 片 H2O2 含量、POD 酵素活性、MDA 含量的影響。………..……..75

圖7、奈米級鈣離子對番茄接種 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 後葉片 LePR1 基因表現量之影響。………77

圖8、奈米級鈣離子與一般碳酸鈣對番茄植株受鹽害逆境損傷程度的影響。..79

圖9、奈米級鈣離子與一般碳酸鈣對番茄植株受 UV 逆境損傷程度的影響。.81 圖10、奈米級鈣離子與一般碳酸鈣對番茄植株受細菌性病源菌青枯病菌 Rd4 損 傷程度的影響。………...……..83

圖11、奈米級鈣離子與一般碳酸鈣對番茄抵抗真菌性病源菌炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides (1-36-2) 能力的影響。………..…….85

圖12、奈米級鈣離子與一般碳酸鈣對番茄植株受乾旱逆境損傷程度的影響。.87 圖13、奈米級鈣離子與一般碳酸鈣水溶液的自然蒸發率與在土壤中的自然蒸發 率的比較。………..89

圖14、土壤濕度對番茄吸收鈣離子能力測試。……….91

圖15、 鈣離子對番茄抵抗 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 能力的影 響。………..93

圖16、鈣離子對 GA 在番茄植株生長上的影響。………...……….95

圖17、鈣離子對巴克素在番茄植株生長上的影響。………..97

圖18、鈣離子對 IAA 在番茄植株生長上的影響。………...99

圖19、鈣離子對 NPA 在番茄植株生長上的影響。………101

圖20、GA 與巴克素對鈣離子幫助番茄植株抵抗鹽害能力的影響。……..…..103

圖21、IAA 與 NPA 對鈣離子幫助番茄植株抵抗鹽害能力的影響。…………105

圖22、GA 與巴克素對鈣離子幫助番茄植株抵抗細菌性病源菌青枯病菌 Rd4 感 染能力的影響。……….107

圖23、IAA 與 NPA 對鈣離子幫助番茄植株抵抗細菌性病源菌青枯病菌 Rd4 感 染能力的影響。……….109

圖24、奈米級鈣離子對番茄於田間生長測試。………111

圖25、奈米級鈣離子對番茄於田間植株高度與葉片數生長測試。………113

圖26、奈米級鈣離子對番茄於田間植株繁殖組織數生長測試。…………..…..115

圖27、奈米級鈣離子對番茄葉片自然老化測試。………117

圖28、奈米級鈣離子對番茄植株抵抗 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 及炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides (1-36-2) 的影響。………..…….119

圖29、奈米級鈣離子對番茄青果抵抗 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 能力的影響。……….………121

圖30、奈米級鈣離子對番茄熟果抵抗 Colletotrichum gloeosporioides (1-36-2) 的 影響。………....123

表1、賀爾蒙對鈣離子幫助番茄抵抗鹽害逆境、UV 逆境、細菌性病源菌青枯病 菌Rd4、Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000、真菌性病源菌炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides (1-36-2)能力的影響。………...125

附錄1、非生物性逆境損傷程度的分級。……….………126

附錄2、生物性逆境損傷程度的分級。……….128

附錄3、田間試驗葉片自然老化與果實接種損傷程度的分級。……….130

附錄4、番茄植株受 UV 逆境光合作用效率的影響。………...132

附錄5、奈米級鈣離子對番茄植株受細菌性病源菌青枯病菌 Rd4 逆境莖部菌數

的影響。……….134

附錄6、pH 值對細菌性病源菌青枯病菌 Rd4 族群菌數生長的影響。……....136

附錄7、奈米級鈣離子對番茄植株受細菌性病源菌青枯病菌 Rd4 逆境對莖部 pH 的影響。………..………...138

附錄8、奈米級鈣離子對細菌性病源菌青枯病菌 Rd4 族群菌數生長的影響。.140 附錄9、奈米級鈣離子對番茄植株土壤 pH 的影響。………..………...142

附錄10、奈米級鈣離子對番茄植株莖部 pH 的影響。………...144

附錄11、奈米級鈣離子對多種病植物源菌的菌絲生長影響。………146

附錄12、奈米級鈣離子對 Colletotrichum gloeosporioides (7g-3-3) 孢子發芽率的 影響。……….148

附錄13、奈米級鈣離子對番茄田間移植受損測試。………150

附錄14、奈米級鈣離子對移植受損番植株生長測試。………152

附錄15、奈米級番茄鈣離子田間生長與老化影響測試。………154

附錄16、奈米級鈣離子對番茄熟果抵抗 Colletotrichum gloeosporioides (1-36-2) 的影響。………156

附錄17、番茄莖部鈣離子含量測試。………...………158

附錄18 、奈米級鈣離子對番茄葉片光合作用效率測試 。..………..160

附錄19、奈米級鈣離子對番茄內 H2O2 含量、 POD 酵素活性與 LePR1、LeCOI1 基因表現量的影響。………...………….162

附錄20、Q-PCR 使用引子條件………...164

附錄21、培養基與藥劑配方表………...165

附錄22、實驗儀器………166  

第一章、前言

第一節、鈣離子的功用

一、

碳酸鈣為地球上存量豐富的化合物，化學式為 CaCO3，難溶於水，水溶液 呈鹼性，外觀為白色粉末狀 (Chemical Abstracts Service, CAS No. 471-34-1)。碳 酸鈣常被運用於工業、醫藥、食品、農業等多種行業。工業上，常被用來當成建 材原料用以製造水泥、玻璃或塑膠的填料。醫藥上，常被用來當成抗酸劑，中和 胃酸、保護潰瘍面，常用於胃酸過多、胃和十二指腸潰瘍等疾病，也能作為人體 鈣質來源 (Wayne et al., 1992)。食品上，常被用來當成食品添加劑，提供人體所 必需的鈣質的攝入。農業上，常被用來當成土壤改良劑與肥料，用以中和土壤酸 性同時提供植株鈣質的吸收 (Jiang et al., 2013; He et al., 2014)。鈣酸鈣能作為植 株所需的鈣質的來源，提高植株體內的鈣離子含量。此外鈣酸鈣也能作為土壤改 良劑，鈣離子的鹽類水溶液通常為鹼性，施用於土壤能提高土壤 pH 值，藉此 能中和土壤酸性，改善種植環境。同時還能抑制嗜酸性病原菌的生長，降低病原 菌族群數量，進而降低病原菌的感染能力，達到控制病害的功效 (He et al., 2014)。

二、

植株的細胞膜與細胞壁的形成需要有鈣離子，植株若缺乏鈣離子，會因細胞 無法形成細胞膜上的磷質與蛋白，造成細胞結構不完整，在不同部位產生缺鈣的 症狀 (Sharma et al., 2017 ; Gao et al., 2014)。在生長點缺鈣，會出現頂芽和根系頂 端不發育，呈斷脖症狀，幼葉失綠、變形、出現彎鉤狀的現象。在葉菜部位缺鈣，

會出現葉部邊緣壞死的現象，如白菜燒心病。在果實部位缺鈣，會出現果實底部

產生黑斑以及果實破裂的現象，如西瓜尻腐病、番茄尻腐病、辣椒蒂腐病、蘋果 苦痘病 (Saure M., 2014)。以番茄為例，番茄果實成熟過程中，果膠的合成需要 有鈣離子參與，以形成番茄果實腔室內的果膠成分 (Hyodo et al., 2013)。除了果 膠之外，番茄果實果皮的合成也需要有鈣離子參與，以形成番茄果實外皮的果皮 構造 (Suzuki et al., 2003)。而番茄果實組織的外質體水溶性鈣離子的濃度過低時，

便會產生番茄尻腐病 (Sergio et al., 2012)。此外，有毒性金屬鉛離子會沉積在番 茄細胞壁內對蕃茄造成影響，而鈣離子能強化番茄壁胞壁的結構並調節有毒鉛離 子所造成的毒性影響，進而提高番茄對於有毒鉛離子的毒性耐受力 (Antosiewicz D., 2004)。

三、

鈣離子能作為二次傳訊者，與鈣調蛋白結合使其活化，讓鈣調蛋白能與目標 蛋白結合，使蛋白產生作用。藉由此功能，鈣離子具有調節酵素及賀爾蒙作用與 促進養分代謝過程的功用。舉例來說，當植物遭受病原菌攻擊時，病原菌的分泌 物會引起植物的抗性反應 (Microbe- associated molecular patterns, MAMPs)，此時 鈣 離 子 會 大 量 進 入 細 胞 質 與 鈣 依 賴 型 蛋 白 激 酶 (Calcium-dependent protein kinases, CPKs) 結合，進行訊號傳遞促使 NADPH 氧化酶大量產生過氧化物 (Reactive oxygen species, ROS) ， 產 生 系 統 性 抗 病 反 應 (Systemic acquired resistance, SAR)，以啟動植物的下游抗性反應 (Seybold et al., 2014 ; Davies J.

2012 ; Torres et al., 2006)。除了協助產生抗性反應之外，鈣離子也會透過鈣調蛋 白活化 Rboh 蛋白使其產生 ROS 傳訊至鄰近細胞，當鄰近細胞接收到訊息時，

細胞內的鈣離子會再去活化 Rboh 蛋白產生 ROS，使訊息再傳訊至另一個細胞，

藉此透過鈣離子與 ROS 互相協調，當植株在某一部位受到逆境時，能讓全株植 株都得知訊息以啟動系統性抗病反應 (Steinhorst et al., 2013)。然而植株體內若含 有過多的過氧化物無法有效的清除時，這些過氧化物便會因為氧化活性過強的因 素氧化植物細胞，造成細胞結構改變使細胞失去原本的功能，最終會使植物葉片

產生黃化的現象，更嚴重時葉片會完全白化，同時葉片的離子導電度會因細胞受 損而大幅提高，並會在黃化區塊發現大量的過氧化物累積 (Epple et al., 2003)。

鈣離子雖然會在植物受到逆境時促使植物產生過氧化物，但當植株體內有大量過 氧化物時，鈣離子能提高超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase, SOD)、過氧化 氫酶 (Catalase, CAT) 的酵素活性以及清除促進 ROS 產生的細胞毒性物質甲基 乙二醛 （methylglyoxal, MG） 的乙二醛系統中的乙二醛酶 I （Glyoxalase I, Gly I） 與乙二醛酶 II （Glyoxalase II, Gly II） 的酵素活性，使植株體內過氧化物及 促進 ROS 產生的甲基乙二醛累積下降，以降低植株體內的氧化壓力保護植株降 低氧化損傷 (Rahman et al., 2016)。當植株受到逆境時，會需要 ROS 啟動植株 抗性與傳遞訊息至其他細胞，而過多的 ROS 會使植株受到氧化壓力造成損傷，

植株需要透過過氧化物相關的清除酵素即時將過多的 ROS 清除避免造成太嚴 重的氧化損傷，而植株體內的鈣離子便能作為二次傳訊者達到協調的功用，在植 株受到逆境時，能快速產生 ROS 啟動植株抗性與傳訊至整株植株，同時能提升 過氧化物清除酵素的活性快速清除過多的 ROS 避免氧化損傷的發生，在植株受 到逆境時，鈣離子能同時達到快速啟動抗性與避免氧化壓力的功效，以達到保護 植株的效果 (Yang et al., 2002)。鈣離子作為二次傳訊者的功效除了在植株抗病上 扮演重要的協調作用外，在植株生長發育方面也具有協調的功效的案例，鈣調蛋 白 MDP25 能抑制植株的徒長，若將這個蛋白突變，植株根系便會產生較長的 不正常黃化下胚軸 (Li et al., 2011)。而鈣離子也參與了植物葉片中光合作用的調 節，鈣離子能增加 ATPase 的活性使光合作用中能量的轉換更為迅速，鈣離子也 能調節了光合作用各離子的通道蛋白活性，使光合作用中各離子的運輸更有效率，

藉此調節植物的光合作用 (Hochmal et al., 2015)。

四、

在賀爾蒙部分，吉貝素是從引起水稻徒長的 Gibberella fujikuroi 分離出的分 泌物，將其定名為吉貝素 （Gibberellin, GA），除了微生物影響外，植株在黑暗

環境與淹水環境時也會大量分泌吉貝素。吉貝素對於植物的生長發育有許多影響，

吉貝素能打破種子的休眠期促進種子發芽，並誘導水解酶促進種子內的養份貯藏 物質分解以提供種子發芽後的養分來源;吉貝素也能使植物細胞壁軟化，促進細 胞伸長與分裂，使植物體明顯的向上生長，施用吉貝素的植株其植株高度會有顯 著的提升 (Germain et al., 2013)，而這也是水稻徒長病會使植株徒長的病因之一 (Jeon et al., 2013);而吉貝素也能促進花芽形成，促使植物開花結果並抑制植物的 衰老 (Davière et al., 2013 ; Binenbaum et al., 2018)。當促進種子發芽時，吉貝素進 入細胞時，會開啟鈣離子-鈣調蛋白誘導路徑促使 α-澱粉酶 (α-amylase) 分解 澱粉，最終在種子胚乳降解提供植物生長所需的能量，促使種子發芽 (Fabian et al., 2000)。

而生長素為第一個被發現的植物激素，是經由胚芽鞘的彎曲生長現象中發現 的一種化學物質，將其命名為生長素，生長素主要由幼嫩的芽、嫩葉中的分生組 織中產生，主要集中分布於植株生長旺盛的部位，生長素對於植物的生長發育也 有許多影響，生長素能促進花朵形成、果實結果、果實子房壁生長、維管束的分 化、葉片的擴大、側根的形成、種子與果實的生長、植株傷口癒合和頂芽優勢，

生長素也能抑制花的脫落、果實的脫落、幼葉的脫落、側枝生長、塊根的形成、

芽體休眠 (Leyser O. 2010)，生長素能使植物細胞壁酸化，並促使胞壁擴張酶活 化，胞壁擴張酶會將細胞壁的氫鍵斷裂並使細胞延長，達到細胞生長生長的效果，

而生長素對植物生長的作用與生長素的濃度、植物的種類以及植物的器官部位有 關，濃度適當的生長素能促進植株生長，但濃度過高的生長素便會抑制植株生長，

甚至導致植株死亡，而對於生長素濃度的敏感度，營養生長器官會比繁殖器官來 的敏感，而營養生長器官中根部是最為敏感的部位，其次是葉部，而後是莖部，

當生長素濃度過高時會先在植株根部發現受到生長抑制的現象 (Coenen et al., 1998 ; Chilley et al., 2006)，生長素因促進生長與防止組織脫落的功效常應用於促 進插條生根、組織培養的培養基、促進果實發育、防止果實和葉片脫落以幫助植

株生長與防止落果落葉，而高濃度的生長素對植株造成的抑制與致死作用，也常 使用高濃度的生長素作為除草劑將不必要的雜草去除 (Li et al., 2016)。而生長素 的運輸也對植株的生長有影響，生長素在植物體內會透過極性運輸將生長素通過 細胞膜上的通道蛋白運送至下一個細胞，藉此在植物細胞間移動以運送至全株植 株，而植株若受到單側光照射，植物向光一側會帶負電荷、背光一側會帶正電荷，

弱酸性的生長素陰離子會向帶正電荷的背光一側移動，使植物背光側受到的促進 生長的效果大於植物向光側，進而使植物彎向光源生長 (Teale et al., 2006 ; Pin et al., 2015)。在生長素進行極性運輸時，鈣離子能活化輸出通道蛋白的活性，協助 生長素的極性運輸，使生長素有效的運輸至全株植株，以達到使全株植物細胞生 長的功能 (Vanneste et al., 2013)。而吉貝素與生長素對植株的生長發育雖然都有 著幫助的效果，但也有案例顯示在進行組織培養時，生長素與吉貝素皆能促進植 株生長發育，但吉貝素的促進效果會受到生長素影響而下降，吉貝素與生長素相 比單一使用吉貝素效果來的差 (Wo´jcikowska et al., 2013)。

五、

鈣離子的吸收是經由含鈣鹽類的水溶液經由植株根部吸收，經由木質部的運 送，最終累積至植株葉片與果實處 (Ho et al., 1993 ; Gilliham et al., 2011)，而植株 的蒸散作用也與鈣離子運輸的最終地點有關，當植株的蒸散作用下降時，根部吸 收的水分運輸至葉片的水量便會下降，葉片的鈣離子的吸收量隨之下降;相對的，

水分會轉而運輸至果實，果實的鈣離子吸收量隨之上升 (Freitas et al., 2013)。當 植株需要鈣離子進行協調時，存於細胞內液泡與內質網的鈣離子便會通過相對應 的鈣離子通道蛋白進入細胞質進行協調，而細胞內的鈣離子也會與鈣調蛋白結合 活化相對應的鈣離子通道蛋白以及活化 NADPH 氧化酶在細胞外產生 ROS 促 使相對應的鈣離子通道活化，藉此讓細胞外的鈣離子進入細胞進行協調 (Bose et al., 2011 ; Swarbreck et al., 2013)。然而在根部吸收的過程，鈣離子難以進入植株 內部，僅能在根部生長未完整的根部尖端進行微量吸收，在根部其他部位皆近乎

無法吸收 (Schiefelbein et al., 1992)，此外當植株吸收鈣離子至葉片與果實後，便 無法再於植株體內的運輸，一個葉片中所含的鈣離子無法移動至其他葉片，植株 新生的葉片與果實的鈣離子需要再施用鈣離子才能補充 (Hanger B., 2008)。因此，

施用大量的鈣離子時常無法讓植株有效的吸收利用。

此外，土壤介質的狀態也是影響鈣離子的吸收的因素，舉例來說，若磷、鉀 肥施用過量，會使植株對鈣離子吸收更困難 (Tanaka H., 1967)，若土壤水分流動 率很高，施用的鈣肥會被流動的水帶走，無法提供植株吸收 (Kirkby E., 2008)，

若在潮濕土壤施用鈣肥，會因為植株根部吸收率下降而使植株對鈣離子吸收更困 難 (Haseoawa et al., 1981)。

第二節、奈米化材料的特性

一、

奈米化材料因為材質徑粒大小極為細小，在物理化學性質上會與原本的材料 產生諸多變化。舉例來說，物質總表面積因為徑粒大小極為細小會有巨量的增加，

能大幅提高與其他物質接觸的機會。表面積大、表面位能高，且表面原子因配位 數不足，較內層原子更活潑，因此奈米粒子具有高化學活性，易與其他物質產生 反應。此外，當粒子粒徑變小，因表面張力及表面位能增大，因平衡與周圍環境 的界面位能差，奈米粉體的吸附能力遠大於大顆粒粉體，且奈米粒子的原子有更 多的擴散途徑，具有超塑性及更好的延展性，因此奈米化材料附著力較好且不容 易受到物理性破壞 (Ramsden J., 2011)。過去研究也發現，使用奈米化氧化鋅能 更有效的使花生發芽，並在發芽後生長也較好，植株的葉綠素含量也較高，並於 室外田間與一般鋅離子比較功效，使用劑量濃度低於一般鋅離子 15 倍的奈米化 氧化鋅，其莢果產量卻高出了約 30% (Prasad et al., 2012)，使用奈米化的肥料相

較於一般傳統肥料，能更有效的幫助水稻生長發育，提高了植物高度、葉綠素含 量、生殖分蘗數、圓錐花序、小穗數 (Benzon et al., 2015)，顯示出奈米化材料改 善作物生產和植物營養的潛力。此外，奈米化肥料具有較好的保水性、吸水性、

附著性，不同於一般肥料施用以後容易流失並對環境造成影響，奈米化肥料施用 以後能更加持久的提供植株吸收，具有做作對環境影響較低的環保肥料的潛力 (Lateef et al., 2016)。

第三節、非生物性逆境與生物性逆境對於植株的影響

一、

水溶液中的 NaCl 濃度高於生物體細胞時，會因高張溶液的特性，細胞的 水勢比細胞外的液體高，細胞的水分會往外滲透，造成細胞皺縮，造成細胞損傷，

此外高濃度的鈉離子也會破壞細胞內外的鈉鉀離子平衡，造成鈉鉀幫浦失去調節 功能。土壤中若含有大量的鹽類，便有可能對植株造成鹽害損傷。高濃度的 NaCl 水溶液會造成植物的細胞膜受損、營養失衡、酵素抑制、代謝功能障礙、光合作 用抑制，最終導致植物生長抑制或死亡 (Munns et al., 2008 ; Parvaiz et al., 2008)。

而植株遭受鹽害逆境時，鈣離子便能作為二次傳訊者開啟植株許多抗性反應，如 調節細胞膜上離子通道、促進 ROS 產生開啟下游抗性、促進離層素作用提高植 株對逆境的耐受性，藉此在鹽害逆境下保護植株 (Xiong et al., 2002)。由高濃度 的 NaCl 水 溶 液 引 起 的 鹽 害 逆 境 ， 植 株 也 會 透 過 細 胞 膜 上 的 通 道 蛋 白 Na⁺/Ca²⁺Exchanger 進行調控，這個蛋白平時能將細胞體內一個鈣離子向外運輸 同時將三個鈉離子運輸至細胞內部，而這個蛋白是具有雙向運輸的功能的，當細 胞內鈉離子含量過高，鈉鉀幫浦無法即時調節時，Na⁺/Ca²⁺Exchanger 也能將一 個鈣離子向內運輸同時將三個鈉離子向外輸出，藉此降低鈉離子對細胞的傷害以

保護植株細胞 (Liao et al., 2012)。前人研究也發現數個使用鈣離子增強植株對鹽 害逆境耐受性的案例，鹽害會使植株生長能力下降並使其葉片生長能力降低，若 提供植株足夠的鈣質，植株便能有較強的耐受性，並提高葉片的生長能力 (Cramer G., 1992)，在植株受到鹽害逆境時，鈣離子也能維持鉀離子轉運蛋白與 非選擇性陽離子通道的作用，藉此維持細胞內外鈉鉀離子的比例，避免細胞受到 過量的鈉離子影響以提高植株對鹽害的耐受性 (Epstein E., 1998)，在植株受到鹽 害逆境時，鈣離子也能開啟植株下游的抗性基因並促進ABA 的作用，在鹽害逆 境下提高植株的抗性 (Zhu J. 2000 ; Zhu J. 2002)，在植株受到鹽害逆境時，提供 植物鈣離子來源，增加植物體鈣離子含量，能提高植株體內 SOD、CAT、Gly I、

Gly II 的酵素活性，調節細胞內鈉鉀離子平衡，有效降低高濃度的 NaCl 水溶液 對水稻幼苗造成的傷害 (Rahman et al., 2016)。

二、

紫外線，為波長在 10 nm 至 400 nm 之間的電磁波，波長比可見光短，比 X 射線長。紫外線雖然不屬於如 X 射線與伽瑪射線那樣短時間照射便有極大影 響，對生物危害性極大的游離輻射，但紫外光也屬於波長短頻率高的電磁波，為 傷害性光線的一種，短時間照射雖然對生物影響不大，但生物照射時間過長會造 成 DNA 受損，當 DNA 遭受破壞，細胞會死亡或是突變而失去原本的功能。

植物暴露於野外的陽光之下，就有可能接收到過多的紫外線，造成植株受損。

UV 會破壞植物的 DNA 和改變植物的代謝，造成植物酚類化合物的合成增加以 及光合作用受到抑制 (Wargent et al., 2013 ; Jansen et al., 1998)。UV 也會破壞細 胞許多原本該有的平衡，包括核酸、脂質、光合作用相關色素及蛋白質與造成氧 化壓力 (Hollósy F., 2002 ; Jansen et al., 1998)。植物暴露於 UV 輻射中顯著會有 SA 的積累上升的現象 (Fodor et al., 1997 ; Horváth et al., 2002 ; Kumar et al., 2012)。前人研究發現，提供植物鈣離子來源，增加植物體鈣離子含量，能有效 降低 UV-B 輻射對小麥幼苗造成的傷害 (Zhou et al., 2001)，當植株的光合作用

效率受到逆境因素下降時，鈣離子能協調植株的光合作用，維持葉片光合作用效 率 (Dolatabadian et al., 2013)，而植物葉片 DNA 受損時，鈣離子也能調節植株 的 DNA 修復過程，降低植株受到的 DNA 損傷，增強植株的耐受性 (Ogutcu et al., 2014)。

三、

水是所有生物生存的重要資源，也是生物體最重要的組成部分。植物的許多 生物功能皆需要水分，舉例來說，植物的光合作用需要有水分的參與 (Matthew P., 2016)，木質部的運輸主要為水，透過水分的蒸散作用能調節整體植株體溫。植 株缺少水分，便會失去許多生物功能，進而導致植物生長抑制或死亡。植株缺水 時，葉部會因失水呈現萎凋狀，若沒有補充水分，葉片會完全皺縮並變的乾脆，

若持續缺水狀態，全株植物皆會失水皺縮而死亡 (Kramer P., 1980)，番茄受到乾 旱逆境損傷時，會先在底部葉片開始產生缺水枯萎狀，隨著乾旱環境的持續，上 部葉片也會開始萎凋，同時底部葉片產生葉片褐化脆化的現象，最終，整個植株 失綠完全褐化變脆死亡，此時給予水分植株依然無法回復 (Rai et al., 2013)。而 植株在乾旱逆境時，鈣離子也參與了抗性反應，促進離層素作用，關閉葉片氣孔 降低植株整體的水分流失率，以提高植株對逆境的耐受性，藉此在乾旱逆境下保 護植株 (Xiong et al., 2002)。造成植株缺水的主要原因是水分的流失，土壤水分 的自然蒸發與植物的蒸散作用皆會造成水分的流失，而水分流失後，沒有補給水 分便會使植株進入乾旱逆境，這項過程中，若水分的流失率提高，植株將會更快 速的進入乾旱逆境 (Bhattacharjee et al., 2014)。而水溶液內的物質皆有可能影響 水分蒸發率，舉例來說，氧化鈣會與水反應生成氫氧化鈣，該反應會放出大量熱，

提高溫度，而水溶液溫度越高蒸發率越高 (Neriah et al., 2014)，此外水溶液中有 越多的物質水分蒸發率越低 (Cai et al., 2007 ; Vercauteren et al., 2009)。而土壤介 質的改變也會影響土壤的水分蒸發，舉例來說，土壤顆粒越細小，毛細作用力大，

水分越會被帶至表層蒸發 (Roger et al., 2016)，此外土壤中的顆粒大小平均程度

也會影響水分的蒸發，顆粒大小平均的土壤，水分散布較均勻，水分會穩定蒸發，

而顆粒大小不均勻的土壤，水分在向上蒸發的過程會受到不同縫隙大小的影響，

水分會趨向縫隙較大的區塊散布，造成縫隙較小的水分較少，在水分蒸發過程，

表面顆粒縫隙較小的區塊水分會較快蒸發完，此時，表面縫隙較大的區塊的水分 除了自然蒸發的因素流失外，還會因為水勢的因素向表面顆粒縫隙較小的區塊流 動，而流動至表面顆粒縫隙較小的區塊的水又會因為自然蒸發的因素而流失，最 終 造 成 顆 粒 大 小 不 均 勻 的 土 壤 的 水 分 流 失 會 大 於 顆 粒 大 小 平 均 的 土 壤 (Nachshon et al., 2011)。

四、

P. syringae pv. tomato 為植物的細菌性病原菌，屬於革蘭氏陰性具有移動能 力的桿菌，能感染番茄葉片與青果，在番茄葉片上會造成黑灰色的細小病斑，在 番茄青果上會產生黑灰色的細小病斑，嚴重時會使青果黃化潰爛 (Cuppels D., 1986 ; Brenda et al., 2001)，P. syringae pv.tomato (Pst) DC3000 已解開全基因组序 列，常被作為該病原菌的模式細菌，Pst DC3000 會利用第 III 型分泌系統感染植 株 (type three secretion system, TTSS) (Buttner et al., 2002 ; Staskawicz et al., 2001 ; Alfano et al., 2004 ; Mudgett M., 2005 ; He et al., 2004)。Pst DC3000 會使用 TTSS 將大量的效應蛋白 (effector protein) 注射到宿主細胞中，對植株產生毒性以感染 植株 (Collmer et al., 2002 ; Greenberg et al., 2003 ; Chang et al., 2005 ; Nomura et al., 2005)。除了利用 TTSS 感染植株之外，這種病原菌會產生 JA 模擬植物毒 素 coronatine (COR)，可以誘導植株的 JA 路徑基因抑制 SA 路徑，以此感染植 株。前人研究發現，增加植物體內 SA 抗病路徑基因 NPR1 表現量、過氧化物 酵素 POD、多酚氧化酶 (polyphenol oxidase, PPO) 的酵素活性，能有效降低 Pst DC3000 在阿拉伯芥上的感染 (Niu et al., 2011 ; Halfeld-Vieira et al., 2006 ; Lanna-Filho et. al., 2017)。當番茄遭受 Pst DC3000 攻擊時，植株會透過活化鈣 離子抗病系統啟動植物 SA 抗病 (Yang et al., 2015)，鈣離子除了能透過 ROS 啟

動 SA 抗病之外，鈣離子也能活化植物體內核黃素 (Riboflavin)，進而活化絲裂 原活化蛋白激酶 MPK3 與 MPK6，這兩個蛋白也能開啟 SA 抗性基因 PR1，

啟動抗性抵抗感染 (Nie et al., 2016)。而 Pst DC3000 在感染植株葉片時，鈣離 子會協調葉片氣孔的開合，使氣孔關閉讓 Pst DC3000 難以進入植株葉片內進行 感染，藉此保護植株免於 Pst DC3000 的感染 (Yang et al., 2017)。增強植株體內 的鈣離子誘導的抗病系統活性，能增強植株的抗性傳訊能力，能有效降低 Pst DC3000 的感染 (Dubiella et al., 2013)。

五、

青枯病菌 Ralstonia solanacearum 為植物的細菌性維管束病原菌，為土壤傳 播型細菌病原菌，屬於革蘭氏陰性具有移動能力的桿菌，寄主廣泛包括許多種經 濟作物，如番茄、菸草、馬鈴薯、辣椒、甜椒、茄子、落花生、絲瓜、苦瓜、番 荔枝、蓮霧、蘿蔔、草莓、甘薯等作物。青枯病菌一般生長於 pH 值 6~7 的弱 酸性土壤中，當土壤中有寄主植株時，青枯病菌會從植株受傷的部位、根尖、側 根產生時的裂縫進入維管束中大量繁殖，並產生胞外多醣體抑制木質部水分運輸，

使青綠的植株快速萎凋而漸枯死，又稱細菌性萎凋病。發病初在下部葉的葉柄首 先下垂，如缺水狀，而後全株葉片漸漸萎凋。青枯病菌會經罹病株的根部釋放大 量 病 原 菌 到 土 壤 中 再 感 染 鄰 近 的 健 康 植 株 (Abramovitch et al., 2006 ; Champoiseau et al., 2009)。前人研究發現，增加植物體內 SA 抗病路徑基因 EDS1 與 NPR1 表現量，能幫助番茄抵抗青枯病菌 R. solanacearum 的感染 (Tahir et al., 2017 ; Hyakumachi et al., 2013)。提供植物鈣離子來源，增加植物體鈣離子含 量，番茄植物體內過氧化物酵素 POD、PPO 的酵素活性及 H2O2 的累積能有效 增加，且 R. solanacearum 在番茄植株上的發病率與造成的損傷能有效降低 (Jiang et al., 2013)。此外，添加顆粒越細小碳酸鈣於土壤越能能使土壤 pH 值上 升，藉此抑制青枯病菌的生長，進而有效降低 R. solanacearum 在在番茄與菸草 植株上的發病率 (He et al., 2014)。

六、

炭 疽 病 菌 Colletotrichum gloeosporioides 為 植 物 的 真 菌 性 病 原 菌 ， Colletotrichum 為無性世代，屬於腔菌綱 (Coelomycetes)，寄主廣泛包括許多種 經濟作物，如番茄、香蕉、木薯、高粱、玉米、木瓜、番荔枝、龍眼、芒果、波 菜、豆類、黃瓜等作物，且多數種類可於不同種類寄主上感染 (Dean et al., 2012 ; Cannon et al., 2012)，在葉片、莖部與果實皆具有感染能力 (Cai et al., 2009)。在 高濕度環境下可藉由分生孢子感染寄主。當分生孢子附著於植物細胞上，會伸出 附著器 (appressorium)，將主要菌絲 (primary hyphae) 深入植物細胞膜上，此時 病原菌為短暫的活體營養型，之後從植物上獲得養分時，會轉換成死體營養型，

將次要菌絲分支整個深入細胞體內，破壞植物細胞，造成植物細胞死亡 (Vargas et al., 2012)，在番茄葉片上造成黑褐色的病斑 (Belov et al., 2018)，而在番茄果實上 則會產生黑色塊狀病斑並使果實凹陷破裂 (Itkin et al., 2011)。前人研究發現，增 加植物體內 NPR1 基因表現、過氧化物酵素 POD、SOD、CAT 的酵素活性及 H2O2 的累積，能有效降低 Colletotrichum acutatum 在枇杷的感染 (Wang et al., 2014)。提供植物鈣離子來源，增加植物體鈣離子含量，能有效降低 C. acutatum 在在枇杷果實上的發病率與造成的損傷 (Cao et al., 2008)，鈣離子也能幫助蘋果 抵抗 C. gloeosporioides 的感染，降低發病面積 (Zhao et al., 2015)，鈣離子也能 增加火龍果果實硬度，並幫助火龍果抵抗 C. gloeosporioides 的感染，降低發病 的褐化程度 (Ghani et al., 2011)，將木瓜沁泡氯化鈣之後，C. gloeosporioides 的 發病率有明顯的下降，其果皮上的病斑面積有明顯的減少，而該效果混合熱水使 用 更 為 明 顯 ， 果 皮 上 幾 乎 沒 有 任 何 病 斑 ， 混 合 熱 水 之 後 的 氯 化 鈣 也 對 C.

gloeosporioides 的菌絲生長有明顯的抑制效果 (Ayón-Reyna et al., 2017)，鈣離子 也能增強木瓜果皮與果肉的細胞壁厚度，使 C. gloeosporioides 的菌絲難以進入 細胞進行感染，以增強果實對 C. gloeosporioides 的抵抗能力 (Madani et al., 2016)。

第四節、研究動機與目的

鈣離子在植株的生長與抗病上皆具有協助的功效，然而植株對於鈣離子的吸 收不易，施用的鈣離子來源難以被有效的吸收，若能使鈣離子被植株有效的吸收 並加以利用，將能減少鈣離子的有效劑量濃度與施用後至有效果的天數。因此，

本研究為了解決有效利用鈣離子的問題，選用經過高溫高壓條件，將鈣離子鍛燒 為60 奈米直徑的奈米級碳酸鈣團粒作為研究材料，探討這樣經過奈米化的鈣離 子，能否因奈米化材料的特性增加番茄植株對於鈣離子的吸收效率，藉此有效提 高番茄植株的鈣離子含量以達到生長與抗病上的協助，進而應用於室外田間耕作，

幫助番茄植株生長與增強抗性。此外，為了了解土壤介質對鈣離子吸收的影響，

本研究也探討土壤介質的乾濕狀態對鈣離子的吸收影響，為了了解鈣離子與吉貝 素及生長素在生長與抗病是否會有相互影響作用，本研究也探討鈣離子與吉貝素 及生長素複合使用後對番茄植株生長與抗性的影響。

第二章、 材料與方法 第一節、 實驗材料

一、

實 驗 進 行 使 用 番 茄 (Solanum lycopersicum) 農友 301 ( 農 友 種 苗 公 司 , Taiwan)，種子利用無菌水清洗 1 分鐘 2 次後，置於 4 °C 冰箱春化 14 小時。

種子培養於介質 (真珠石 : 泥炭土 = 1 : 1) 中，每 5 天澆水一次。培養於 26 °C，

光照 12 小時與黑暗 12 小時循環，光照強度 400 μmol m^-2s^-1 的恆溫培養房中。

於種植 20 天後移植至 2 吋塑膠軟盆中。

二、

奈米級碳酸鈣 (Nano calcium carbonate, nCa, 台茂奈米生化股份有限公司, Taiwan) 為取用石灰石 (CaCO3) 與焦碳 (C) 經石灰爐 1200 °C 高溫鍛燒為氧 化碳 (CaO) 與二氧化碳 (CO2)，氧化碳 (CaO) 與水 (H2O) 經乳化機與篩選機 合成為氫氧化鈣 (Ca(OH)2)，二氧化碳 (CO2) 經二氧化碳洗滌塔與過濾塔後與 氫氧化鈣 (Ca(OH)2) 重新合成為碳酸鈣 (CaCO3)，並於 2011 年 10 月經國立 成功大學微奈米科系研究中心奈米技術產品測試實驗室尺度測量測試報告結果 顯示，平均顆粒直徑為 65.86 nm，為輕質碳酸鈣，按粒徑大小屬於奈米鈣 （≤0.1 µm）。

一般碳酸鈣 (calcium carbonate, Ca,  聯工化學廠股份有限公司, Taiwan) 為 沉降式 EP (Extra Pure) 1 級 [日本 JIS (Japanese Industrial Standards) 試藥 " 1 級 " (First Grade)] 化學級試藥，為輕質碳酸鈣。

0.2% 濃度在圖表中以 L 表示，2% 濃度在圖表中以 H 表示。

三、

吉貝素 (gibberellin) 為具有活性的 GA3 粉末 (Merck Schuchardt, Germany)，

以 99% 酒精配置為 1 mL 1 mM 原液，使用時以原液將濃度稀釋為 5 ppm。吉 貝素生合成抑制劑為巴克素 (Paclobutrazol) (Sigma-Aldrich, USA) 以 99% 酒精 配置為 1 mL 1 mM 原液，使用時以原液將濃度稀釋為 10 ppm。

生長素 (Auxin) 為吲哚-3-乙酸 (indole-3-acetic acid, IAA) (Alfa Aesar, USA)，

以 99% 酒精配置為 1 mL 1 mM 原液，使用時以原液將濃度稀釋為 5 ppm。生 長素極性運輸抑制劑為 N-1-萘基鄰氨甲酰苯甲酸 (N-1-naphthylphthalamic acid, NPA) (Chem Service, USA)，以 99% 酒精配置為 1 mL 1 mM 原液，使用時以原 液將濃度稀釋為 5 ppm。

四、

番茄細菌性斑點病菌 P. syringae pv. tomato (Pst) DC3000，於含 50 ppm Rifampicin 的液態培養基中 (King's B Broth pH 7.0, KB)，全黑暗中培養於 28 °C，

震盪轉速 150 rpm。

青枯病菌 R. solanacearum Rd4，於液態培養基中 (Nutrient Broth pH 7.0, NB) (ST-Bio, Taiwan)，全黑暗中培養於 28 °C，震盪轉速 150 rpm。

真菌性病原菌炭疽病菌 C. gloeosporioides 1-36-2 分離自台東釋迦園，經由 ITS1 與 ITS4 引子鑑定，PCR 產物大小 600 bp，經由基龍米克斯公司解序後，

利用美國國家級生物資訊中心 (National Center for Biotechnology Information, NCBI) 資料庫作序列比對，由此獲得病原菌名稱 (楊, 2015)，病原菌培養在含有 2 % 瓊脂的馬鈴薯培養基 (Potato dextrose agar medium, PDA)，培養條件為 28

℃，在全黑暗中培養。炭疽病菌產生孢子條件為培養於 1/5 倍 PDA，26 ℃，

在全黑暗中培養，培養 15 天。

第二節、 實驗方法

一、

以 RO 水配製 0.2% 及 2% 一般碳酸鈣與奈米級碳酸鈣水溶液 500 mL 於 500 mL 玻璃燒杯，以鐵勺攪拌均勻後，靜置於室溫 (25 ℃)，於 0、0.5、1、3、

5 和 10 分鐘後，拍照記錄並觀察其水溶液沉澱與懸浮現象。

二、

以 RO 水配製 0.2% 及 2% 一般碳酸鈣與奈米級碳酸鈣水溶液，震盪均勻 後，取 10 µL 水溶液於血球計數器 (AP-0650010, MARIENFELD/HAUSSER,  Germany)，一小方格為 0.0025 mm²，在複式光學顯微鏡下 (BX53M, Olympus, japan) 觀察其結晶團粒大小與分布。

三、

以 RO 水配製 0.2% 及 2% 一般碳酸鈣與奈米級碳酸鈣水溶液，施倒於直 徑 9 cm 的 PP 塑膠材質圓形培養皿，靜置於室溫 25 ℃，於 14 天後待其水分 完全蒸發，拍照記錄並觀察外觀，以 Adobe Photoshop CS5 軟體計算附著分布 面積，附著區塊以附著面積比率呈現，計算公式為附著分布面積 / 直徑 9 cm 的 圓形培養皿面積 × 100。以鐵勺清筆畫過目標區觀察附著黏力，拍照記錄並觀察

外觀。

四、

取葉片樣本約 0.5 g 以研缽壓榨出葉部汁液，反覆吸放三次後，取約 200 µL 於筆式鈣離子度計 (HORIBA, LAQUAtwin, japan) 參照廠商給予之操作說明書 進行鈣離子含量測量，並以樣本重量標準化。

五、

將番茄植株培養於土壤中，於 30 天大時進行藥劑施用，於第一次處理 7 天 後每 7 天測量高度及葉片數，並拍照記錄外觀 (未呈現所有時間點)，於鈣離子 第一次處理 28 天後進行鮮重測量，於鮮重測量 6 天後進行乾重測量。

將植株種植於土壤中，生長至 40 天後移植至田間網室，移植於 1.2 尺 (36

× 36 cm) 美植袋，移植 14 天後，處理 0.2% 及 2% 奈米級碳酸鈣，每株 100 mL，每週處理一次，於每次處理後測量高度、葉片數、花苞數、花朵數、青果 數、熟果數，並拍照記錄外觀 (未呈現所有時間點)。試驗時間為 2017 年 11 月 至 2018 年 5 月。試驗地點為台東大學試驗農場。

植株高度測量方式為以土壤基部向上測量至植株頂芽。葉片數測量方式為計 算除子葉與褐化葉外之所有葉片。花苞數測量方式為計算花萼未完整打開之花苞。

花朵數測量方式為計算花苞完整打開之花朵。青果數測量方式為計算肉眼可見之 青色果實。熟果數測量方式為計算未脫落之黃紅色果實。植株重量測量方式為使 用電子磅秤秤取去除土壤後秤取全株植株鮮重，之後將植株置於 25 ℃ 培養箱 靜置乾燥 6 天後，再次使用電子磅秤秤取全株植株乾重。

六、

P. syringae pv. tomato (Pst) DC3000 接種分為菌液浸泡、葉部抽氣及擦手紙 浸泡三種方法。接種前先將培養 18 小時的病原菌以 RO 水將菌液調整至 10⁷ CFU / mL。菌液浸泡方法為將番茄植株子葉以上地上部浸泡於 10⁷ CFU / mL P.

syringae pv. tomato DC3000 (含 0.025 % Silwet L-77 surfactant, Helena Chemical,

US) 菌液內 10 秒鐘，之後以塑膠袋套袋保濕，靜置 7 天待其葉部產生病斑後，

拍照記錄外觀，並以Pst DC3000 造成葉片損傷程度分級將病害損傷數據化 (附 錄 2A)。葉部抽氣方法是將田間處理 12 次奈米級碳酸鈣後之番茄葉片採回以 75% 酒精進行表面消毒後，浸泡於 10⁷ CFU / mL Pst DC3000 (含 0.025 % Silwet L-77 surfactant) 利用幫浦抽氣 5 分鐘兩次，每次間隔 3 分鐘洩壓，之後以保鮮 膜封閉保濕，靜置 2 天待其葉部產生病斑後，拍照記錄外觀。擦手紙浸泡方法 為將田間處理 10 次奈米級碳酸鈣後之番茄青果採回以 75% 酒精進行表面消 毒後，將擦手紙浸泡於 10⁷ CFU / mL Pst DC3000 菌液內潤濕後，包覆番茄青果 並置於潮濕環境下使其發病，於接種 7 和 15 天待青果產生病斑後，拍照記錄 外觀，並以 Pst DC3000 於青果病害發生程度分級將病害損傷數據化 (附錄 3B)。

R. solanacearum Rd4 接種為根部澆灌。接種前先將培養 16 小時的病原菌 以 RO 水與磷酸鹽緩衝溶液 (pH7.0) 將菌液調整至 10⁷ CFU / mL 並含 100 mM 磷酸鹽緩衝溶液。根部澆灌方法為將 50 mL 10⁷ CFU / mL 菌液施倒於番茄 植株根部，於 7 天後追加處理一次，於第一次處理 10 天後待其植株產生葉部 缺 水 萎 凋 與 莖 部 受 損 倒 伏 病 癥 後 ， 拍 照 記 錄 外 觀 ， 並 以 細 菌 性 病 源 菌 R.

solanacearum Rd4 損傷程度的分級將病害損傷數據化 (附錄 2B)。莖部菌數取離 番茄植株地上部 1 cm 處向上計算 1 cm 長莖部組織以無菌水研磨後進行序列 稀釋，將稀釋後菌液於 NB 培養基滾珠塗盤，於 28 ℃培養箱培養 2 天後進行

菌落數計算，並以樣本重量標準化。

C. gloeosporioides 1-36-2 接種分為葉部噴灑與果實注射。接種前先將培養於 斜面 1/5 PDA 培養基上的炭疽病菌以 5 mL 含 0.05% Tween 20 的 0.1% water agar 震盪 5 分鐘後，利用血球計數器計算孢子數量。將分生孢子調整濃度至 10⁶ spores / mL (含 1/5 PDB 及 10 mM MgSO4)。葉部噴灑方法為將 10⁶ spores / mL 孢子懸浮液以噴灑器噴灑 10 mL 於番茄葉片，之後以塑膠袋套袋或保鮮膜封閉 保濕，靜置 2 與 7 天待其葉部產生病斑後，拍照記錄外觀，並以葉片發病程度 分級將病害損傷數據化 (附錄 2C)。果實注射方法為將 10⁶ spores / mL 孢子懸浮 液以針筒注射 10 µL 於果皮三點，靜置 10 與 15 天後待其果實產生壞疽病斑，

拍照記錄外觀，並以熟果發病程度分級將病害損傷數據化 (附錄 3C)。

七、

參考 Jana 等人 (1981) 的方法，取植物頂部第二片葉片 0.05 g 放入 1.5 mL 微量離心管中，加入液態氮磨碎。加入 600 μL 磷酸鹽緩衝液 (50 mM, pH 6.8)，經震盪機均勻震盪 10 秒後，以 9,000 g 離心 25 分鐘取 400 μL 上層溶 液，換至新的微量離心管，加入 200 μL 硫酸鈦 (TiSO4) 溶液，經震盪機均勻震 盪 10 秒後，以 6,000 g 離心 15 分鐘取 200 μL 上層溶液，即為待偵測過氧化 氫溶液，利用波長 410 nm 檢測，以 {[(X410-0.0011)/0.0004]*1.5} / 葉片重量 (mg) 換算過氧化氫含量 (Jana et.al., 1981)。

八、

參考 MacAdam 等人 (1992) 的方法，取植物頂部第二片葉片 0.05 g 放入 1.5 mL 微量離心管中，加入液態氮磨碎。加入 1,000 μL 磷酸鹽緩衝液 (50 mM,

pH 5.8)，經震盪機均勻震盪 10 秒後，以 12,000 g 離心 20 分鐘取 10 μL 上層 溶液。加入 100 μL 磷酸鹽緩衝液、100 μL 鄰甲氧基苯酚 (Guaiacol) 與 90 μL 過氧化氫 (39 mM)，均勻混合後，即為待偵測過氧化氫酶溶液。利用波長 470 nm 檢測，以 [(△A470) / 26.6*反應體積 (mL)*稀釋倍率 / 反應時間 / 葉片重量 (g)]

換算過氧化氫酶活性 (MacAdam et.al., 1992)。

九、

參考 Heath 等人 (1968) 的方法，取植物頂部第二片葉片 0.05 g 放入 1.5 mL 微 量 離 心 管 中 ， 加 入 液 態 氮 磨 碎 。 加 入 800 μL 三 氯 乙 酸 (TCA,  trichloroacetic acid)，經震盪機均勻震盪 10 秒後，以 10,000 g 離心 5 分鐘取 200 μL 上層溶液，換至新的微量離心管，加入 800 μL 硫代巴比妥酸 (TBA,  thiobarbituric acid) 溶液，於 95 ℃ 熱水浴 30 分鐘，經震盪機均勻震盪 10 秒 後，以 3,000 g 離心 10 分鐘取 200 μL 上層溶液，即為待偵測丙二醛溶液，利 用波長 532 與 600 nm 檢測，以 [(△A532-△A600) / 155*反應體積 (mL)*稀釋倍 率 / 葉片重量 (mg)] 換算丙二醛含量 (Heath et.al., 1968)。

十、

取番茄葉部組織，利用總量 RNA 迷你試劑 (Tissue Total RNA Mini Kit) (Favorgen, Taiwan) 抽 取 植 物 葉 部 組 織 總 量 RNA ， 經 由 MMLV Reverse Transcription kit (Protech, Taiwan) 將 1 μg RNA 反轉錄成 cDNA，再加入 1 μL 10 mM Q-Forward primer, Q-Reverse primer (Blossom, Taiwan) (附錄 20)、2 μL 10X PCR 緩衝液、1 μL 2.5 mM dNTP、0.1 μL 5 units / μL Pro Taq DNA polymerase、

10 μL 2X super SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, US) 與無菌水

體積填補至 20 μL，以 Quantitative real-time PCR StepOne 儀器 (附錄 21) 進行 Q-RT-PCR，以 ∆∆Ct 法計算相對基因表現量，將待測基因的 Ct 值減去 LeEFlα 基因的 Ct 值得出 ∆Ct 值，將每處理組的 ∆Ct 值減去控制組的 ∆Ct 值得出

∆∆Ct 值，以控制組相對基因表現量為 1 換算各組相對基因表現量。

十一、

鹽害逆境處理方式為澆灌高濃度食鹽水，配置 300 mM NaCl 水溶液於番茄 植株根部澆灌 25 mL，使植株吸收後造成損傷 24 小時後，拍照記錄外觀，並 以鹽害造成的莖部倒伏損傷程度分級將逆境損傷數據化 (附錄 1A)。

UV 逆境處理方式為照射 UV-C 紫外線光，將番茄植株置於光波長 253.7 nm UV-C 燈管(功率 15 W) ，距離 30 cm 處照射 30 分鐘，使植株造成損傷， 處 理 12 小時後，測量葉片光合作用效率，造成損傷 24 小時後，拍照記錄外觀，

並以 UV 造成的葉片捲曲損傷程度分級將逆境損傷數據化 (附錄 1B)。

乾旱逆境處理方式為停止植株水分供給，將番茄植株施用藥劑後，停止任何 水分供給來源，靜置 22 天使植株產生缺水葉片萎凋後，拍照記錄外觀，並以乾 旱造成的葉片萎凋損傷程度分級將逆境損傷數據化 (附錄 1C)。

十二、

葉片光合作用效率使用葉綠素螢光光合作用測定分析儀 (JUNIOR-PAM Teaching Chlorophyll Fluorometer, WALZ, Germany) 配合 WinControl-3 軟體 (WALZ, WinControl-3 Software) 參照廠商給予之操作說明書進行測定。本研究以 Fv / Fm（最大螢光參數）的比值代表光合作用胞器生理狀況的參數，Fm 是黑暗 狀態下，照射飽和光源後螢光最高值，其數值會受到葉片處於暗適應與光適應狀

態而變動，為準確測定Fm 值，參照說明書建議於測定前先將番茄植株於黑暗環 境靜置 8 小時以上，以確保葉片完全處於暗適應狀態。

十三、

水溶液的自然蒸發率將 25 mL 水溶液施倒於直徑 9 cm 的圓形培養皿，靜 置於室溫 25 ℃，待其水分自然蒸發，於 2 天後以量筒進行剩餘水分含量測量，

將第 0 天水分含量 (25 mL) 扣除第 2 天水分含量推算水分自然蒸發率。

在土壤中的自然蒸發率將 25 mL 水溶液施倒於約 50 g 的介質 (真珠石 : 泥炭土 = 1 : 1)，施倒 2 天後以電子磅秤秤取土壤重量，於 9 天後再次以電子 磅秤秤取土壤重量，將第 2 天土壤重量扣除第 9 天土壤重量，推算土壤水分自 然蒸發率。

植株水分自然流失率將 50 mL 水溶液施倒於 30 天大番茄植株，於處理藥 劑後 2 天後以電子磅秤秤取全株植株重量，於 9 天後再次以電子磅秤秤取全株 植株重量，將第 2 天全株植株重量扣除第 9 天全株植株重量推算植株水分自然 流失率。

十四、

以 1 M 磷酸鹽緩衝溶液配置各 pH 值 6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、

7.4 液態 NB 培養基，取 10³ CFU / mL R. solanacearum Rd4 菌液 50 μL 培養於 NB 培養基中，在全黑暗中培養於 28 °C，震盪轉速 150 rpm 的 NB 培養基中 生長。培養 42 及 46 小時後於分光光度計 (U-1900 UV-VIS spectrophotometer, Hitachi) 測 OD 值，以 Rd4 標準曲線進行菌數計算。

十五、

植株莖部 pH 值，取離番茄植株地上部 1 cm 處向上計算 3 cm 長莖部組 織，放至研缽加入 10 mL RO 水進行研磨，以酸鹼測定儀 (MP200 pH-meter, METTLER Toledo, Switzerland)，測定溶液 pH 值。

土壤 pH 值，將施倒藥劑 2 天後植株於盆栽底底部洞口擠出土壤溶液 10 mL，以酸鹼測定儀 (MP200 pH-meter, METTLER Toledo, Switzerland)，測定溶液 pH 值。

十六、

將真菌病源菌培養於 PDA 培養基 28 ℃ 4 天，切下直徑 0.6 cm 之菌絲 盤放至 PDA 培養基中央，於距離中央 1.5 cm 處放置直徑 0.8 cm 之濾紙，將 10 μL 無菌水、0.2 % 奈米級碳酸鈣滴至濾紙，將培養基置於 28 ℃ 培養箱，

培養 2 天後，於菌絲生長至無菌水之濾紙時，拍照記錄外觀。

十七、

將分生孢子調整濃度至 10⁶ spores / mL (含 1/5 PDB 及 10 mM MgSO4)。取 20 µL 的分生孢子懸浮液滴在 2 % water agar 中。於室溫 25 ℃ 靜置六小時後 隨機取樣 50 顆孢子計算孢子發芽率。孢子發芽標準為，當發芽管長度達到孢子 長度一半判定為發芽。

十八、

本實驗所有數據皆經由 SPSS 12.0 統計軟體，單因子變異數分析 (One way analysis of variance, ANOVA)，進行 Fisher 的最小顯著差異性檢定分析 (Fisher

｀s protected least significant difference test, LSD test)，以不同英文字母 (a,b,c) 標 示，代表統計分析結果具有顯著差異 (p＜0.05)。平均值 + 標準誤差。比較平均 數經由 Microsoft Excel 2013 計算所得。

第三章、 結果

第一節、奈米級碳酸鈣與一般碳酸鈣物理性質比較

一、

為了解兩種不同顆粒直徑的碳酸鈣在物理性質上的差異，本研究選用經過高 溫鍛燒處理後的奈米級碳酸鈣進行試驗，試圖了解該奈米級碳酸鈣與一般碳酸鈣 在水溶液懸浮能力、結晶團粒大小分布、蒸發後附著能力與分布等能力的差異。

測試結果顯示，經過均勻攪拌後，兩種碳酸鈣水溶液都呈現混濁的情況，但是靜 置經過一分鐘以後，一般碳酸鈣水溶液已經開始出現沉澱的現象，而奈米級碳酸 鈣水溶液則沒有明顯可見的沉澱現象發生，靜置 5 分鐘之後，一般碳酸鈣水溶 液之碳酸鈣幾乎已經完全沉澱於燒杯底部，但是 0.2% 的奈米級碳酸鈣水溶液則 依然還沒有出現任何明顯可見的沉澱現象，此差異在靜置 10 分鐘後更加明顯，

在一般碳酸鈣水溶液的組別，其上部溶液已經完全呈現清澈透明的狀態，而奈米 級碳酸鈣水溶液的上部溶液則依然保持白色混濁的均勻分布狀態。這些現象顯示，

奈米級碳酸鈣的水溶液較不容易出現碳酸鈣沉澱的現象，具有高度的懸浮能力 (圖 1A)。

進一步利用光學顯微鏡檢視奈米級碳酸鈣水溶液的結晶團粒，藉此來探討其 與植株根部的接觸面積。結果顯示，一般碳酸鈣的結晶團粒分布較不均勻，結晶 團粒之間呈現不規則的散佈，而奈米級碳酸鈣的結晶團粒分布則較為均勻，結晶 團粒分布的間隔較小且比較規則分佈，此外一般碳酸鈣的結晶團粒會有大於 0.0025 mm² 的大型結晶團粒存在，而奈米級碳酸鈣的結晶團粒皆小於 0.0025 mm²，沒有大型的結晶團粒 (圖 1B)。

二、

在農業作業環境中，水溶液中碳酸鈣的附著能力，會直接影響到鈣離子存留