一、細胞培養(Cell culture)
本實驗所使用之人類前列腺癌細胞株(PC3, DU145 及 LnCaP)購
自American Type Culture Collection。前列腺癌細胞使用含 10% Fetal bovine serum (FBS)、1% penicillin/streptomycin 的 RPMI-1640 培養液，
靜置於37℃、含 5% CO2培養箱中培養。
二、細胞移行實驗(Migration assay)
細胞移行實驗使用 Transwell (Costar, Corning Life Sciences, Acton, MA; pore size, 8 μM)，並將其置放於 24 孔盤中。在執行細胞移行實驗 前，細胞會預先使用不同的抑制劑包括：Ly294002、Akt inhibitor、
PDTC、TPCK 或 vehicle control (0.1% dimethyl sulfoxide)處理 30 分鐘。
將約2 X 104個細胞與 200 μl 無添加血清的 RPMI-1640 培養液置放於 transwell 的上層；300 μl 含 1% FBS 及 leptin 的培養液置放於 transwell 的下層。24 孔盤靜置於 37℃、含 5% CO2培養箱內培養 16 至 18 小時，
然後用1% formaldehyde 固定 5 分鐘並用 0.05% crystal violet 染色 15 分 鐘。上層的細胞使用棉花棒將其移除，並且用 PBS 清洗，移行至下層 貼附的細胞可在顯微鏡底下觀察，並計算其數量。每次實驗皆為三重
數量需藉由細胞存活實驗(cell viability assay) 的結果調整，以校正由 leptin 所引起的細胞增生效應。(正確的細胞移行數量 = 計數細胞移行 的數量/細胞存活百分比)(Chu et al.,2007；Huang et al., 2007)。
三、流式細胞技術分析(Flow cytometric analysis)
將人類前列腺癌細胞株 PC3 先分盤培養於 6 孔盤中。實驗前先以 PBS 溶液清洗，再以 37℃的 trypsin 將細胞自培養盤中分離。接著使用 含1% paraformaldehyde 的 PBS 溶液中固定十分鐘，固定完畢後用 PBS 溶液清洗並將細胞與不同的mouse anti-human antibody against integrin (1:100)一起置放於 4℃培養 1 小時。然後將細胞再次用 PBS 溶液洗淨，
並將細胞與接有fluorescein isothiocyanate-conjugated 的 goat anti-rabbit secondary IgG (1：100；Leinco Tec., St Louis, MO) 一起培養 45 分鐘，
然後使用流式細胞技術進行實驗，並使用 FACS Calibur 及 CellQuest software (BD Biosciences , San Jose, CA)分析(Tang et al., 2006)。
四、西方墨點法分析(Western blot analysis)
首 先 準 備 細 胞 的 溶 解 液 及 蛋 白 ， 接 著 用 sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel 電 泳 分 離 並 轉 移 到 Immobilon polyvinyldifluoride membranes 上。在室溫下用 4% BSA 阻斷非專一結
antihuman antibodies against (1:1000)在室溫下作用 1 小時。經過三次清
洗，隨後與donkey anti-rabbit peroxidase-conjugated secondary antibody (1:1000) 於室溫下培養 1 小時。實驗結果所發之化學冷光可藉著使用 Kodak X-OMAT LS film (Eastman Kodak, Rochester, NY)顯示出來。
五、轉染實驗及報導基因分析(Transfection and Reporter Gene Assay)
將人類前列腺癌細胞株 PC3 先分盤培養於 12 孔盤中，當其長到八 分滿時，利用Lipofectamine 2000 (LF2000; Invitrogen)進行轉染實驗。
將含有1 μg κB-luciferase plasmid 及 1 μg DNA plasmid 的 serum free 培 養液混合5 分鐘，再將其與含有 2 μl Lipofectamine 2000 的培養液混合 30 分鐘，隨後加入細胞內。轉染 24 小時後，再將細胞與含有 leptin 的
培養液一同培養，24 小時將培養液移除並用冰的 PBS 溶液清洗。取 100 μl 的 reporter lysis buffer (Promega)加入 12 孔盤的每個孔內作用，並將 細胞從孔璧上刮下。將懸浮的細胞液經由5 分鐘 13,000 rpm 的轉速離 心分離後，收取上清液。在每20 μl 的細胞上清液中約含有等量(20-30 μl) 的蛋白，取出20 μl 的細胞上清液置放於不透光的 96 孔盤中，將等體 積的螢光受質(luciferase subatrate)加入細胞上清液中，樣品所發出的冷 光會透過Luminometer 被偵測出來。