第三章 研究材料和方法
第二節 實驗方法
奈米化與傳統方劑三黃瀉心湯之指標成分比較分析研究 1. 粒徑分析
以量尺與穿透式、掃描式電子顯微鏡觀察及測量三黃瀉心湯粒徑 大小。
2.紅外光光譜分析
以 KBr 粉末作為打碇稀釋劑；單位為波數(cm-1)，分析比較標準 品與奈米化三黃瀉心湯、濃縮方劑、奈米化濃縮方劑三種粒徑之 紅外光光譜，比較奈米化前後結構是否發生變化。
3.紫外光光譜分析
標準品和樣品定容在甲醇中分別測定其紫外吸收光譜圖，各指標 成分共同吸收波長以 276 nm 為測定波長。
4.三黃瀉心湯標準品分離度(Resolution)
層析的分離效果一般是是以分離度(Resolution)來評估，R 越大 表示分離度越佳，一個好的層析結果分離度 R 值應在 1.5 以上，公 式如下：
R＝t2－t1/1/2(tw1+tw2)
t2－t1：兩個尖峰之間的距離
5. HPLC 分析條件
層析管(Column) XBridge C18 (3.5 µm, 15 cm x 4.6 mm)
保護管柱(Pre-column XBridge C18 (5 µm, 20 mm x 4.6 mm)
檢測波長 UV 276 nm 流速 0.6 mL/min 移動相 A :ACN
B：0.11% H3PO4 Solution(pH=2.04)
梯度分析之程式為:
時間(分) A(%) B(%)
0 15 85
15 20 80
50 55 45
60 90 10
65 90 10
注入量 10 µL 分析時間 65 min
6.配製標準品溶液
精秤 baicalin、baicalein 、wogonin、berberine、palmatine、
chrysophanol 等各 1.0 mg 標準品，溶於甲醇定容至 10.0 mL，超 音波振盪後，作為標準品儲備母液(0.1 mg/mL)。
7.配製內部標準品溶液
精秤 2.5 mg 的 indomethacin 標準品，溶於甲醇，定容至 25 mL，
超音波振盪後，作為內部標準品儲備母液(0.1 mg/mL)。
8.三黃瀉心湯飲片甲醇溶液的配製
精確秤取三黃瀉心湯方劑原藥藥材大黃 1 克、黃芩 0.5 克、黃 連 0.5 克，加入甲醇 20 mL，超音波震盪 20 分鐘，殘渣再加入 20 mL 甲醇後超音波震盪，合併兩次溶液，離心取上清液後以濾紙過 濾，以甲醇定容至 50 mL 製成儲備檢品溶液，取作為定量之檢液。
9.不同粒徑三黃瀉心湯檢品甲醇溶液的配製
不同粒徑三黃瀉心湯粉末檢品各 2 克樣品，加入甲醇 20 mL，
超音波震盪 20 分鐘，殘渣再加入 20 mL 甲醇後超音波震盪，合併 兩次溶液，離心取上清液後以濾紙過濾，以甲醇定容至 50 mL 製 成儲備檢品溶液，作為定量之檢液。
10.三黃瀉心湯飲片水萃溶液的配製
精確秤取三黃瀉心湯方劑原藥藥材大黃 1 克、黃芩 0.5 克、
黃連 0.5 克，加入去離子水 20 mL，超音波震盪 20 分鐘，殘渣再 加入 20 mL 去離子水後超音波震盪，合併兩次溶液，離心取上清 液後以濾紙過濾，以去離子水定容至 50 mL 製成儲備檢品溶液，
作為定量之檢液。
11.不同粒徑之三黃瀉心湯檢品水萃溶液的配製
精秤不同粒徑三黃瀉心湯檢品粉末各 2 克樣品，加入去離子 水 20 mL，超音波震盪 20 分鐘，殘渣再加入 20 mL 去離子水後超 音波震盪震盪，合併兩次溶液，離心後取上清液後用濾紙過濾，
以去離子水定容至 50 mL 製成儲備檢品溶液，作為定量之檢液。
12.三黃瀉心湯飲片水煎溶液的配製
精確秤取三黃瀉心湯方劑原藥藥材大黃 1 克、黃芩 0.5 克、 黃 連 0.5 克，加入去離子水 20 mL，浸泡 30 分鐘，直火加熱 20 分鐘 後，殘渣再加入 20 mL 去離子水繼續加熱，重複兩次合併溶液；
高速離心取上清液以濾紙過濾，定容至 50 mL 製成貯備檢品溶 液，作為定量之檢液。
13.不同粒徑之三黃瀉心湯檢品水煎溶液的配製
精確秤取不同粒徑三黃瀉心湯方劑粉末檢品 2 克，加入去離 子水 20 mL，浸泡 30 分鐘，直火加熱 20 分鐘後過濾，殘渣再加 入 20 mL 去離子水繼續加熱，重複兩次合併溶液；溶液離心取上 清液，以濾紙過濾定容至 50 mL 製成儲備檢品溶液，作為定量之 檢液。
14.檢品溶液之前處理
(1)奈米化與非奈米化檢品甲醇萃取之檢品溶液
精取奈米化檢品與非奈米化甲醇儲備檢品溶液 0.5 mL 置 於 10 mL 之容量瓶以甲醇定容至 10 mL，經 0.22 µm 過濾膜過 濾，精取過濾之稀釋檢品 200 µL，加入 200 µL indomethacin 內 標準品(0.1 mg/mL)，以振盪器振搖 30 秒，混合均勻。以 HPLC 分析，每一檢品三重覆測定。(n=3)
(2)水萃及水煎之檢品溶液
精取不同粒徑之檢品溶液 2 mL 以 12000 轉高速離心，經 0.22 µm 過濾膜過濾，精取過濾之檢品 200 µL，加入 200 µL indomethacin 內標準品(0.1 mg/mL)，以振盪器振搖 30 秒，混合
均勻。以 HPLC 分析之，每一檢品三重覆測定。(n=3)
15.檢量線製作
以微量吸管(micropipet)精確量取適量之 baicalin、baicalein、
wogonin、berberine、palmatine、chrysophanol 標準溶液(0.1mg/mL)，
分別加適量甲醇稀釋成濃度為 3.125 µg/mL、6.25 µg/mL、12.5 µg/mL、25 µg/mL、50 µg/mL、100 µg/mL(即以甲醇稀釋 32 倍 16 倍、8 倍、4 倍、2 倍)的標準溶液，各取 200 µL 不同濃度的標準溶 液，加入 200 µL indomethacin 內標準品(0.1 mg/mL)，以振盪器振搖 30 秒， 混合均勻。以 HPLC 分析之。由所得的標準品 baicalin、
baicalein、wogonin、berberine、palmatine、chrysophanol 與內標準 品 indomethacin 之面積比(peak area ratio)和標準品濃度作線性迴歸 以製作檢量線。
16.分析方法之確效
(1)精密度(Precision)
為了確認 baicalin、baicalein、wogonin、berberine、
palmatine、chrysophanol 定量分析方法之精確性，所以作同 日內(intraday)和間日內(interday)的精確性比較。
(i)同日內(intraday)試驗：
同日內個別精確量取 200 µL 不同濃度含 baicalin、
baicalein 、wogonin、berberine、palmatine、chrysophanol ( 6.25 µg/mL、25 µg/mL、100 µg/mL)之標準溶液，再分別 各加入 200 µL indomethacin 內標準品(0.1 mg/mL)，振搖 30 秒，混合均勻。分別於同日內早、午、晚以 HPLC 各測 定三次，來評估本分析法之同日變異性。計算各個校正濃 度之相對標準偏差(R.S.D.)。
(ii)間日內(interday)試驗：
於不同天以同日內(intraday)試驗方法操作，即可得 到間日內(interday)的精確性比較。
於不同日個別精確量取 200 µL 含不同濃度 baicalin、
baicalein、wogonin、berberine、palmatine、chrysophanol (6.25 µg/mL、25 µg/mL、100 µg/mL)之標準溶液，再分別各加 入 200 µL 內標 indomethacin 標準品，振搖 30 秒，混合均 勻。分別於同日內早、午、晚以 HPLC 各測定三次，來評 估本分析法之異日變異性。計算各個校正濃度之相對標準 偏差(R.S.D.)。
(2)準確度(Accuracy)
三次同日及三次異日間，實驗濃度的平均值與理論濃度
值之相對誤差(relative error) 。
17.最低檢測濃度 LOD (Limit of Detection)偵測極限
機器所能測得之樣本 baicalin、baicalein、wogonin、
berberine、palmatine、chrysophanol 最低極限濃度。為樣本 peak 高度(signal)小於或等於雜訊(noise) peak 高度之 3 倍謂之。
取檢量線含 baicalin、baicalein、wogonin、berberine、
palmatine、chrysophanol 最小標準濃度 3.125 µg/mL(以甲醇稀 釋 32 倍)為主，持續對半稀釋至如下濃度 1.562 µg/mL、0.781 µg/mL、0.391 µg/mL、0.195 µg/mL、0.0976 µg/mL、0.0488 µg/mL，各取 100 µL 不同濃度的標準溶液，以氮氣吹乾，加 入 300µL 甲醇，振搖 30 秒，混合均勻，再以 HPLC 測之。
即測得指標成份之峰高(signal)與雜訊(noise)峰高，當
signal/noise≧3，此時 baicalin、baicalein、wogonin、berberine、
palmatine、chrysophanol 之濃度極為 LOD。
18.最低定量濃度 LOQ(Limit of Quantitation)定量極限
機器所能定量樣本 baicalin、baicalein、wogonin、berberine、
palmatine、chrysophanol 最低濃度謂之。為樣本 peak 高度 (signal)小於或等於雜訊(noise) peak 高度之 10 倍謂之。
機器所能測得之樣本 baicalin、baicalein、wogonin、
berberine、palmatine、chrysophanol 最低定量濃度。為樣本 peak 高度(signal)小於或等於雜訊(noise) peak 高度之 10 倍謂之。
取檢量線含 baicalin、baicalein、wogonin、berberine、
palmatine、chrysophanol 最小標準濃度 3.125 µg/mL(以甲醇稀 釋 32 倍)為主，持續對半稀釋至如下濃度 1.562 µg/mL、0.781 µg/mL、0.391 µg/mL、0.195 µg/mL、0.0976 µg/mL、0.0488 µg/mL，各取 100 µL 不同濃度的標準溶液，以氮氣吹乾，加 入 300µL 甲醇，振搖 30 秒，混合均勻，再以 HPLC 測之。
即測得指標成份之峰高(signal)與雜訊(noise)峰高，當 signal/noise≧10，此時 baicalin、baicalein、wogonin、
berberine、palmatine、chrysophanol 之濃度極為 LOQ。
19.Recovery(回收率)
(1) 三黃瀉心湯奈米化原藥材甲醇溶液
選定三個已知濃度之 baicalin、baicalein、wogonin、
berberine、palmatine、chrysophanol (100 µg/mL、50 µg/mL、25 µg/mL)標準溶液各 100 µL，以氮氣吹乾，加入已知 baicalin、
baicalein、wogonin、berberine、palmatine、chrysophanol 濃度之 奈米化原藥材甲醇檢品各 200 µL，以及內部標準品 indomethacin 200 µL，振搖 30 秒，使混合均勻。如上三個樣本以 HPLC 各測 三次(n=3)，經標準檢量線換算，求得 mean &及 S.D.及 R.S.D.。
(2)三黃瀉心湯原藥材甲醇溶液
選定三個已知濃度之 baicalin、baicalein、wogonin、
berberine、palmatine、chrysophanol (100 µg/mL、50 µg/mL、25 µg/mL)標準溶液各 100 µL，以氮氣吹乾，加入已知 baicalin、
baicalein、wogonin、berberine、palmatine、chrysophanol 濃度之 原藥材甲醇方劑檢品各 200 µL，以及內部標準品 indomethacin 200 µL，振搖 30 秒，混合均勻。如上三個樣本以 HPLC 各測三次 (n=3)，經標準檢量線換算，求得 mean 及 S.D. 及 R.S.D.。
(3)三黃瀉心湯原藥材粗粉甲醇溶液
選定三個已知濃度之 baicalin、baicalein、wogonin、berberine、
palmatine、chrysophanol (100 µg/mL、50 µg/mL、25 µg/mL) 標準溶液各 100 µL，以氮氣吹乾，加入已知 baicalin、baicalein、
wogonin、berberine、palmatine、chrysophanol 濃度之原藥材粗粉 甲醇方劑檢品各 200 µL，以及內部標準品 indomethacin 200 µL，
振搖 30 秒，混合均勻。如上三個樣本以 HPLC 各測三次(n=3)，
經標準檢量線換算，求得 mean 及 S.D. 及 R.S.D.。
(4)三黃瀉心湯奈米化濃縮方劑甲醇溶液
選定三個已知濃度之 baicalin、baicalein、wogonin、berberine、
palmatine、chrysophanol (100 µg/mL、50 µg/mL、25 µg/mL) 標準溶液各 100 µL，以氮氣吹乾，加入已知 baicalin、baicalein、
wogonin、berberine、palmatine、chrysophanol 濃度之濃縮方劑甲 醇檢品各 200 µL，以及內部標準品 indomethacin 200 µL，振搖 30 秒，混合均勻。如上三個樣本以 HPLC 各測三次(n=3)，經標準檢 量線換算，求得 mean 及 S.D. 及 R.S.D.。
(5)三黃瀉心湯濃縮方劑甲醇溶液
選定三個已知濃度之 baicalin、baicalein、wogonin、berberine、
palmatine、chrysophanol (100 µg/mL、50 µg/mL、25 µg/mL) 標準溶液各 100 µL，以氮氣吹乾，加入已知 baicalin、baicalein、
wogonin、berberine、palmatine、chrysophanol 濃度之濃縮方劑甲 醇檢品各 200 µL，以及內部標準品 indomethacin 200 µL，振搖 30 秒，混合均勻。如上三個樣本以 HPLC 各測三次(n=3)，經標準檢 量線換算，求得 mean 及 S.D. 及 R.S.D.。