實驗方法與儀器 - AGG 插入對於導致 X 染色體脆折症的 CGG 三核苷酸重複序列形成的髮夾型結構與結構動態學的影響

2-1 實驗技術

2-1.1 單分子實驗技術

單分子實驗 (single-molecule experiment) 成為近年來生物物理學的熱門主題，是相對於整體實驗 (ensemble experiment) 的一種技術，只針對單一分子進行觀察，進而得到在一定時間內的分子動力學與動態學。生物相關的分子本身較為子施加機械力的原子力顯微鏡 (atomic force microscope) 圖十四(A)，藉由施力操控分子，以得到生物分子中與力以及能量相關的資訊；利用雷射操控聚合球的光鉗 (optical tweezers) 圖十四(B)，以及用磁力操控磁球的磁鉗 (magnetic tweezers) 圖十四(C)，都是以力為主的方法。另一種則是以螢光為基礎的方式，以螢光標記欲實驗的分子，藉著偵測螢光的方式來分析分子的行為，如圖十四(D)[27]。本篇實驗所採取的實驗方法是單分子螢光光譜。

圖十四、單分子實驗技術示意圖。(A) 原子力顯微鏡；(B) 光鉗；(C) 磁鉗；(D) 單分子螢光光譜。摘錄自參考資料[27]。

2-1.2 螢光原理介紹

大多情況下分子皆處於最低能量的狀態，稱做基態 (S0) 。當吸收了特定光源後，電子便躍至單重激發態 (Sn)。經一段時間後，螢光分子可能產生振動鬆弛 (vibration relaxation) 降至最低能量的激發態，此時再以光的形式釋放能量回至基態，放出的光即是螢光 (fluorescence) [28]。但也可能經內轉換過程躍遷至三重激發態 (T1)，以發出磷光 (phosphorescence) 的方式回到基態，如圖十五。

圖十五、Jablonski Diagram。修改自參考資料[28]。

2-1.3 螢光共振能量轉移

在欲研究的單一分子上不同位置標記上供體 (donor) 和受體 (acceptor) 兩種螢光分子，供體吸收特定的波長，電子自基態躍遷至激發態，因電子處於激發態時能量太高且不穩定，分子間產生振動鬆弛下降到激發態的最低能階。若此時供體與受體距離小於 10 nm，且兩者間的偶極矩 (dipole moment) 不是垂直的情況，能量藉由共振轉移至受體，受體吸收能量躍遷至激發態，再以釋放螢光回到基態。為了更加了解蛋白質、DNA 等生物分子的結構，透過兩種以上螢光染料標記，藉此得知其動力學及動態學，稱為螢光共振能量轉移[29]，如圗十六。

圖十六、螢光共振能量轉移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 示意圖。

圖十七、(A) 螢光共振能量轉換效率 (EFRET) 與兩個螢光染料之間距離。(B) 螢光染料分子的極交互作用 (dipole-dipole coupling) 。但能量要能順利的傳遞，供體的放射光譜 (emission spectrum) 與受體的激發光譜 (excitation spectrum) 需有部分重疊。

2-1.4 螢光染料的選用

本篇實驗使用的螢光染料分別是: 供體為 Cy3，受體為 Cy5，圖十八上方為其結構圖，圗十八為光譜圖，Cy3 的放射波長 (Dex) 與 Cy5 激發波長 (Aem) 重疊(overlap)，因此能有效的將能量傳遞。Cy3 訊號因能量傳遞下降時，Cy5 訊號隨之上升，是目前較為廣泛應用於螢光共振能量轉移的螢光分子對[29]。

圖十八、Cy3 和 Cy5 的結構及其激發光譜與放射光譜。摘錄自參考資料[29]

2-1.5 全內反射式螢光顯微鏡

為了只量測一對染料分子的螢光訊號，提高訊雜比 (signal-to-noise ratio) 就變得格外重要。當光自高密度的介質入射到低密度介質時，若入射角 (incident angle, θi) 大於臨界角 (critical angle, θc)時，光會產生全反射 (Total internal reflection)。然而在兩介質之間，發生全反射的位置，存在微量的穿透，稱之為漸逝波 (evanescent wave)，藉此作為激發光源，使帶螢光之樣品產生全反射螢光影像。因單分子實驗是將實驗分子固定在玻片表面，此方法能有效降低雜訊，大幅地提升訊雜比[30]。

全內反射式螢光顯微鏡 (Total internal reflection fluorescence microscope, TIRF-M) 依光入射方式主要分為兩種類型，稜鏡式 (prism type) 與物鏡式 (objective type)。稜鏡式以顯微鏡與稜鏡方式產生全反射如圖十九(A) 所示，而物鏡式一般只建立於倒立顯微鏡上如圖十九(B)，本實驗所選用的是稜鏡式全內反射式顯微鏡。

圖十九、全內反射式螢光顯微鏡的裝置示意圖。 (A) 稜鏡式。 (B) 物鏡式。修改自參考資料 [30]。

受激發的螢光染料，供體自身或受體受螢光共振能量轉移放出的螢光，均經物鏡、濾鏡以及長狹縫，再經由兩消色差透鏡 (achromat) ，將影像聚在位於焦面 (focal plane) 的影像偵測器上，最後於相機前放置雙色鏡 (dichroic mirror)，

將供體與受體放出的光分開，使其進入電子放大式電荷耦合器 (Electron Multiplying Charge-Coupled Device, EMCCD)，放大螢光訊號以供單分子實驗的測量，同時觀察兩頻道的影像[31]，如圖二十所示。

圖二十、稜鏡式全內反射螢光顯微鏡與光路徑示意圖。修改自參考資料[32]

2-1.6 圓二色性光譜 (Circular dichroism spectrum)

圓二色性光譜是鑑定生物分子重要的光譜技術之一，大部分的生物分子具對掌性 (chirality)，其鏡像無法與原物重合，如同左右手。當平面偏極光通過該分子，分成左旋與右旋兩種圓偏極光，因其結構而有不同吸收度，重合其訊號產生橢圓偏振光，即圓二色性 (circular dichroism, CD)[33]。

核酸在生物體內會形成一級至四級的結構，圓二色光譜儀是鑑定核酸構型變

2-2 實驗樣品製備

表三、實驗設計的副序列及其互補股。

2-2.2 螢光分子的標記

2-2.3 寡核苷酸黏合反應

修飾完 Cy3 的目標序列，需再和連接生物素與 Cy5 之副序列互補股黏合 (anneal)。依表三所示之配方，放入聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction, PCR) 機器中，，加熱至 95℃維持 5 分鐘，隨後以每分鐘下降 1℃ 的速率降溫

2-2.4 樣品槽製備與組裝

樣品槽的製備分為前置處理 (清理殘膠) 和後置處理 (修飾表面)。

前置處理步驟如圖二十四：

1. 回收用過的完整樣品槽，拋棄其蓋玻片，將石英載玻片用刀片刮除邊緣殘膠

(應避免刮到實驗區域)。

2. 泡入超純水放入微波爐加熱十分鐘，再用丙酮 (CH3COCH3) 及超純水沖洗乾淨，最後泡入食人魚試劑 (雙氧水與硫酸比例為 1:3) 靜置 30 分鐘。

3. 取出石英載玻片，以超純水洗淨後以火燒乾表面，放入洗淨之染色壺，加入

丙酮保存。

4. 另準備一乾淨染色壺，放入乾淨的蓋玻片，加入丙酮保存。

圖二十四、樣品槽製備前置處理示意圖。

後置處理的步驟如圖二十五：

10. 以超純水清洗玻片後，直至有明顯疏水面，裝入 50 ml 離心管 (瓶身需用鋁箔紙包起來)，最後放進密封袋裡抽真空，存放於 -20℃ 冰箱。

圖二十五、樣品槽製備後置處理示意圖。

樣品槽組裝步驟如下 (圖二十六)：

2-2.6：樣品固定於樣品槽.

本實驗利用表面束縛 (surface tethering) 使樣品能附著於玻片上，樣品原先已鋪有 PEG 與少量的 Biotin-PEG ，在樣品槽中打入抗生物素醣蛋白 (NeutrAvidin Protein)，在控制其濃度與反應時間下，與 Biotin-PEG 結合，以此達到單分子的實驗條件。

其步驟以 [K⁺] = 150 mM 為例，如圖二十七所示:

1. 將已組裝好的玻片通道孔朝上，取 45 μL 的 0.2 μg/μL 的抗生物素醣蛋白注入通道，等待約三分鐘。

2. 取45 μL Tris Salt Buffer (20 mM, pH = 8.3, KCl = 150 mM) 沖洗移除過多未結合的抗生物素醣蛋白，並保持通道在反應鹽類條件環境。

3. 取 45 μL 的 10 pM 實驗樣品注入樣品槽，不同序列反應時間可能不同，視結合狀況進行調整，再以Tris Salt Buffer 沖洗未附著之實驗樣品。

圖二十七、單分子實驗設計示意圖

2-2.7：顯像緩衝溶液 (Image Buffer)

螢光染料分子在實驗觀察中，常常會發生閃爍 (blinking) 以及光漂白 (photobleaching) 的現象，使訊號不穩定不易觀察。螢光的放光過程中，電子可能經系統間跨越 (intersystem crossing) 的方式轉到激發三重態 (excited triplet state)，

再放出磷光 (phosphorescence)回到基態，此過程所需的時間為 10^-3- 10² 秒，相較於放出螢光過程的10^-7- 10^-9 秒多了許多倍，視其為暗態 (dark state)，如圖二十八。在觀測中若電子亮、暗態轉換會發生閃爍現象，螢光放出亮度會不穩，因此需在顯像緩衝溶液中，額外添加三重態淬熄劑 (triplet quencher)，減少閃爍現象的發生[28,35]。本實驗所選用 Trolox 作為三重態淬滅劑，若有氧化態的 Trolox quinone 出現時，去除三重態的效率會較佳，如圖二十九。

圖二十八、實驗中電子躍遷與其放光過程的示意圖。摘錄自參考資料 [29]。

圖二十九、Trolox 在含氧的環境下照光氧化為 Trolox quinone 。摘錄自參考資料[36]。

光漂白現象為螢光染料分子在放光過程中被永久中斷，如圖三十所示，原先於溶液中的氧氣在高強度雷射照射下，形成單重態氧分子 (singlet oxygen)，與處在激發三重態的電子反應，導致染料無法正常放光[29]。因此在影像緩衝溶液中添加除氧系統，除去實驗中的氧分子，如圖三十。

圖三十、放光過程中的光漂白現象示意圖。摘錄自參考資料[29]。

2-2.8：酵素型除氧系統

常見的酵素型除氧系統有兩種類型。有葡萄糖氧化酶-過氧化氫酶系統

(glucose oxidase and catalase, GOC)、兒茶酸-3,4-雙加氧酶系統(protocatechuate-3,4-dioxygenase, PCD) ，以及吡喃糖氧化酶-過氧化氫酶系統 (pyranose oxidase and catalase, POC) ，圖三十一為試劑消耗氧氣所需反應物，以及生成酸的莫耳數比較，圖三十二則為其 pH 值隨時間下降的關係[37]。

圖三十一、各除氧系統和氧氣反應並生成酸的比例。摘錄自參考資料[37]。

圖三十二、各除氧系統條件下 pH 值對時間的改變。摘錄自參考資料[37]。

本實驗所選用的除氧系統為 GOC 與 POC 系統，兩者皆以葡萄糖做反應物消耗氧氣，GOC 系統在反應中 pH 值下降較大，容易造成螢光分子的不穩定，

不適合用於長時間的測量。而 POC 系統雖較為穩定，適合作長時間的觀測，但

對於 G-四聯體的形成可能有影響，故用兩種系統去作比較較為適合，配方如表五。

顯像緩衝溶液 (GOC 系統) 顯像緩衝溶液 (POC 系統)

藥品緩衝溶液中濃度藥品緩衝溶液中濃度

Trolox 1.55 mM Trolox 1.55 mM

D-Glucose 0.5 (w/w) D-Glucose 0.5 (w/w) Glucose oxidase 165 unit/mL Pyranose oxidase 2.7 unit/mL catalase 2170 unit/mL catalase 90 unit/mL Na⁺/K⁺ ions 0~150 mM Na⁺/K⁺ ions 0~150 mM Tris buffer 20 mM Tris buffer 20 mM

表五、顯像緩衝溶液的最終濃度。

2-3 數據處理與分析 2-3.1 數據處理

電荷耦合元件 (charge-coupled device, CCD)，是一種積體電路，電荷數量與入射光強度成正比，而電子放大式電荷耦合器與其不同的點是，將倍增暫存器放大的電子，再經由低雜訊的讀出倍增器放大，轉成電壓輸出。因內含致冷器，可使感測晶片降溫至 -70℃，降低暗電流的產生並減少雜訊，將特定訊號區域放大至 200 倍，以 smCamera 軟體記錄 (由 Taekjip Ha 團隊提供)。

觀察到的影像分為左、右兩個畫面，如圖三十三所示，同一條DNA 在左右

兩邊相同位置顯示，如紅色圈圈中的 5 個 DNA 分子，左側為供體 (Cy3) 的螢光訊號，右側則為受體 (Cy5) 螢光訊號，如圖三十三。

圖三十三、DNA 樣品在全內反射式顯微鏡的觀察圖像。

實驗設定的曝光時間 (exposure time) 為每幀 (frame) 30 毫秒，但曝光時間

數據處理上使用MATLAB (Matrix Laboratory, The MathWorks, Inc) 程序將校

在文檔中 AGG 插入對於導致 X 染色體脆折症的 CGG 三核苷酸重複序列形成的髮夾型結構與結構動態學的影響 (頁 28-54)