AGG 插入對於導致 X 染色體脆折症的 CGG 三核苷酸重複序列形成的髮夾型結構與結構動態學的影響

全文

(1)國立臺灣師範大學理學院化學系碩士論文 Department of Chemistry College of Science. National Taiwan Normal University Master’s Thesis. AGG 插入對於導致 X 染色體脆折症的 CGG 三核苷酸重複序列形成的髮夾型結構與結構動態學的影響 Influences of AGG Insertions on the Structures and Structural Dynamics of CGG Trinucleotide Repeat DNA Hairpins Associated with Fragile X Syndrome. 鄭凱駿 Kai-Chun Cheng 指導教授:李以仁博士 Advisor: I-Ren Lee, Ph.D. 中華民國 109 年 8 月 August 2020.

(2)

(3) 致謝感謝老師實驗上的指導，很慶幸自己能加入李以仁老師實驗室，在訓練解決問題以及邏輯上受益良多，也教導了我許多專業知識。不同於大學時的專題研究，碩士班訓練了獨自進行實驗題目，過程中培養了有效率且正確的解決問題的能力，在未來面對問題也能迎刃而解。. 感謝李弘文老師、溫進德老師、范秀芳老師以及三位老師實驗室的同學在單分子領域上互相交流討論，給予實驗上的幫助與建議；謝謝孫英傑老師在書報討論上給予報告上的建議。還有謝謝沈洋逸學長先前對於 CGG 重複序列的研究，為這個實驗計畫建立良好的基礎。. 我也很感謝實驗室的夥伴們學長姐丞緯、語潔、洋逸、堃愷、陳謙、文昊對於實驗技巧的教導，使我能夠在操作儀器上很快上手；我的同學鴻仁和冠豪與我一起解決課業上和實驗上的難題；學弟妹彥霖、芝綺、思妤、軒皓與我談心聊天，讓我在進行實驗時保持快樂的心情。這些日子感謝大家的陪伴，在我未來的人生規劃中給予許多建議，使我更加成長茁壯。最後也感謝家人對我的栽培，使我不必擔心生活上的困擾，專心於研究。. i.

(4) 摘要染色體脆折症是一種常見的遺傳神經性疾病，其發病原因與人體中 FMR1 中 CGG 三核苷酸重複序列不正常擴張有關。在正常個體中，CGG 重複次數低於 54 次，並會穩定地傳給子代；發病的個體中，CGG 重複次數大於 200 次，造成 FMR1 基因啟動子甲基化區域過多，使腦部無法正常生成 FMRP (Fragile X Mental Retardation 1 fusion protein)，進而影響智力上的發展。正常人體中，每 8 到 11 個 CGG 序列存在著 1 個 AGG 的中斷，且約 65% 個體中的 FMR1 5’UTR 的 CGG 重複序列中含有兩個 AGG 的中斷，但 AGG 序列對於 CGG 重複序列的影響仍尚未釐清。因此我們利用單分子螢光共振能量轉移光譜，配合圓二色性光譜，對於 CGG 重複序列與插入 AGG 的 CGG 重複序列做一系列的結構與結構動態學的研究。研究結果顯示富含 CGG 的重複序列在生理相關鹽類濃度下，難以形成鳥嘌呤四聯體，CGG 重複序列的主要構型為接近對齊之露出 1 個核苷酸的突出的髮夾型結構，透過時間解析發現奇數重複次數的 CGG 重複序列存在髮夾型結構的滑動現象，但以後的序列以露出 1 個核苷酸的突出髮夾型結構為主。當插入一組 AGG 後的序列以露出 1 個及 3 個核苷酸的突出髮夾型結構兩種構型為主，與 CGG 重複序列相同都有髮夾型結構的滑動，但平衡向露出 3 個核苷酸的突出髮夾型結構偏移。插入兩組 AGG 後依中間的 CGG 重複次數分成奇數間隔組與偶數間隔組，奇數間隔組以露出 3 個核苷酸的突出髮夾型結構為主，偶數間隔組則有露出 1 個及 3 個核苷酸的突出髮夾型兩種主要結構，但無論是奇數間隔組或是偶數間隔組皆沒有觀察到構型之間的轉換。根據本實驗室先前提出的擴張理論，CGG 重複序列傾向形成對齊或接近對齊髮夾型結構，較易進行不正常的擴張而變成更長的序列，而髮夾結構的滑動重組可使序列在擴張後回到對齊或接近對齊髮夾型結構而繼續擴張形成循環。而本 ii.

(5) 篇論文發現，插入一組 AGG 後序列構型由長突出髮夾型結構轉變成接近髮夾型結構的速率降低，減緩了序列的擴張，插入兩組 AGG 後序列的構型則是穩定不易產生滑動的，使序列在複製時更不會被擴張，因此我們認為 AGG 插入對於結構動態滑動至利於擴張的對齊髮夾型結構動態平衡影響，是抑制 CGG 重複序列擴張的可能原因。. 關鍵字:單分子螢光共振能量轉移、圓二色性光譜、基因擴張、CGG 三核苷酸重複序列、X 染色體脆折症、結構動態學、DNA 髮夾型結構. iii.

(6) Abstract Overexpansion of the CGG trinucleotide repeat (TNR) in the fragile X mental retardation 1 (FMR1) region is responsible for the fragile X syndrome, a common genetic neurodegenerative disease. In healthy individuals, the repeat number of the healthy individuals remain below 54, while in pathological samples, the repeat number goes exceed 200. Abnormal expansion of CGG leads to hypermethylation of the FMR1 gene, which leads to the inhibition of Fragile X Mental Retardation 1 fusion protein (FMRP), a crucial protein for the development of intelligence production. However, the tandem CGG motif is usually interrupted by an AGG triplet in a frequency of one per 8 to 11 repeats in healthy individuals, and ~65% CGG motif in FMR1 5’UTR carries two AGG interruptions. However, the role of AGG insertion in abnormal expansion remains elusive. Here, we use single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) and circular dichroism (CD) spectroscopy to study the structures and structural dynamics of tandem CGG repeats and those with AGG triplet insertions. Our result shows that G-quadruplexes are unlikely to be formed under physiological conditions in both cases. Instead, CGG repeat folds into a near blunt-end hairpin with 1-nucleotide (nt) overhang. Our time-dependent experiment reveals that the odd-numbered CGG repeat hairpin mainly folds into 3-nt overhang hairpin with transient slippage hairpin structural rearrangement to the 1-nt overhang configuration.. With one AGG insertion,. interconversion between two major configurations in CGG repeats were still observed, but with a new equilibrium lean to the 3-nt overhang state. With two AGG insertion, parity dependence on the repeat number of CGG spacer units between two AGG was found. The odd-numbered CGG spacer sequences mainly fold into a 3-nt overhang iv.

(7) hairpin structure. While the even-numbered CGG spacer unit folds into two major hairpin structures with 1-nt and 3-nt overhang. Neither of them shows interconversion between configurations. With the DNA expansion model proposed by our group, TNR with blunt-end or near blunt-end hairpin configuration has a higher potency of undergoing abnormal expansion. Slippage of TNR hairpins could bring the hairpin with newly synthesized DNA segment back to its (near) blunt-end configuration, and thus, continue another expansion cycle. With one AGG insertion, the conversion from 3-nt overhang hairpin to the 1-nt hairpin gets retarded, which could slow down the abnormal expansion. With two AGG insertions, the slippage hairpin reconfiguration is virtually stopped, possibly inhibits the abnormally expansions. In conclusion, we believe that the impact on the hairpin structures and slippage hairpin reconfiguration by the interruption of AGG insertion to the CGG tandem repeats plays a crucial role in inhibiting the abnormal expansion of CGG repeats.. Keywords: smFRET, CD spectroscopy, Gene expansion, CGG trinucleotide repeat, Fragile X chromosome, Structural dynamics, DNA hairpin v.

(8) 目錄. 致謝................................................................................................................................. i 摘要................................................................................................................................ii Abstract ......................................................................................................................... iv 目錄............................................................................................................................... vi 圖目錄........................................................................................................................... ix 表目錄........................................................................................................................ xiii 第一章、緒論................................................................................................................ 1 1-1 前言..................................................................................................................... 1 1-2 X 染色體脆折症 .................................................................................................. 3 1-2.1 X 染色體脆折症致病原因 ........................................................................... 4 1-3 DNA 重複序列的擴張 ........................................................................................ 6 1-4 CGG 重複序列已知的二級結構 ........................................................................ 8 1-4-1 髮夾型結構.................................................................................................. 8 1-4-2 鳥嘌呤四聯體.............................................................................................. 9 1-5 AGG 插入對於 CGG 重複序列的影響 ........................................................... 10 1-6 重複序列髮夾型結構的動態滑動及其擴張的關係....................................... 11 1-7 研究動機........................................................................................................... 12 第二章、實驗方法與儀器.......................................................................................... 13 2-1 實驗技術........................................................................................................... 13 vi.

(9) 2-1.1 單分子實驗技術 ........................................................................................ 13 2-1.2 螢光原理介紹 ............................................................................................. 14 2-1.3 螢光共振能量轉移 ..................................................................................... 15 2-1.4 螢光染料的選用 ......................................................................................... 17 2-1.5 全內反射式螢光顯微鏡 ............................................................................ 18 2-1.6 圓二色性光譜 (Circular dichroism spectrum) .......................................... 20 2-2 實驗樣品製備................................................................................................... 21 2-2.1 實驗序列設計 ............................................................................................ 21 2-2.2 螢光分子的標記 ........................................................................................ 23 2-2.3 寡核苷酸黏合反應 .................................................................................... 24 2-2.4 樣品槽製備與組裝 .................................................................................... 25 2-2.5 DNA 黏合反應 (annealing) ...................................................................... 28 2-2.6：樣品固定於樣品槽. ................................................................................. 29 2-2.7：顯像緩衝溶液 (Image Buffer) ................................................................ 30 2-2.8：酵素型除氧系統 ...................................................................................... 32 2-3 數據處理與分析............................................................................................... 34 2-3.1 數據處理 .................................................................................................... 34 2-3.2 動態擬合分析 ............................................................................................ 37 第三章、實驗結果與討論.......................................................................................... 39 3-1 單分子實驗鑑定物 (assay) 設計 ................................................................... 39 3-2 CGG 重複序列 ................................................................................................. 40 3-2.1 單分子結構鑑定 ........................................................................................ 40 3-2.2 鹽類對於序列的影響 ................................................................................ 41 3-2.3 長時間軌跡圖 ............................................................................................ 42 3-3 插入 1 組 AGG 的 CGG 重複序列 ............................................................. 43 vii.

(10) 3-3.1 單分子結構鑑定 ........................................................................................ 43 3-3.2 鹽類對於序列的影響 ................................................................................ 44 3-3.3 長時間軌跡圖 ............................................................................................ 45 3-4 重複序列的圓二色性光譜................................................................................ 47 3-5 髮夾型結構鑑定............................................................................................... 48 3-6 插入 2 組 AGG 的 CGG 重複序列 ................................................................. 51 3-6.1 單分子結構鑑定 ........................................................................................ 51 3-6.2 長時間軌跡圖 ............................................................................................. 54 3-6.3 鹽類對於插入 2 組 AGG 的 CGG 重複序列的影響 ................................ 55 3-7 插入 2 組 AGG 的 CGG 重複序列的圓二色型光譜 ...................................... 57 第四章、結論.............................................................................................................. 60 4-1.CGG 重複序列與插入 AGG 的 CGG 重複序列可能之構型 .................... 60 4-2.DNA 在人體中的擴張模型 .............................................................................. 61 參考文獻...................................................................................................................... 63. viii.

(11) 圖目錄圖一、不同重複序列導致的疾病與其在基因的位置。 ......................................... 1 圖二、各種遺傳性神經疾病與其對應重複序列。 ................................................. 2 圖三、正常個體、準突變個體、全突變個體在 FMR1 的 5'-UTR 的 CGG 重複次數，以及轉譯後的基因產物。 ................................................................... 3 圖四、FMR1 位於人類 X 染色體中 Xq27.3 位置示意圖。 ............................... 4 圖五、DNA 甲基化示意圖。 .................................................................................. 4 圖六、DNA 甲基化影響 DNA 轉錄示意圖。 ...................................................... 5 圖七、複製叉 (Replication fork) 示意圖。 ............................................................ 6 圖八、DNA 不正常複製示意圖。 .......................................................................... 7 圖九、(A) 同源重組錯位導致的擴張事件收縮事件。(B) 雙鏈斷裂修復過程滑動導致的擴張事件或重複序列單元的缺失導致收縮事件。 ........................... 7 圖十、髮夾型結構示意圖 ......................................................................................... 8 圖十一、鳥嘌呤四聯體結構以及常見的折疊方式示意圖。 ................................. 9 圖十二、(A) 為 (CGG)19 在插入 1 個 AGG 序列可能形成的構型。(B)(C) 為 (CGG)19 在插入 2 個 AGG 序列可能形成的構型。 .................................... 10 圖十三、(A) TGGAA 重複序列擴張示意圖。(B) CTG 重複序列擴張示意圖。 ............................................................................................................................. 11 圖十四、單分子實驗技術示意圖。(A) 原子力顯微鏡；(B) 光鉗；(C) 磁鉗； (D) 單分子螢光光譜。 ..................................................................................... 14 圖十五、Jablonski Diagram。 ................................................................................. 14 圖十六、螢光共振能量轉移示意圖。 ................................................................... 15 圖十七、(A) 螢光共振能量轉換效率. 與兩個螢光染料之間距離。(B) 螢光染. 料分子的方向性與能量傳遞關係圖。 ............................................................. 16 ix.

(12) 圖十八、Cy3 和 Cy5 的結構及其激發光譜與放射光譜。................................ 17 圖十九、全內反射式螢光顯微鏡的裝置示意圖。 ............................................... 18 圖二十、稜鏡式全內反射螢光顯微鏡與光路徑示意圖。 ................................... 19 圖二十一、單分子實驗序列設計。 ....................................................................... 21 圖二十二、Cy3 NHS ester 和經 NH2C6 修飾之 DNA 的交聯反應。 ............. 23 圖二十三、黏合反應的示意圖。 ........................................................................... 24 圖二十四、樣品槽製備前置處理示意圖。 ........................................................... 25 圖二十五、樣品槽製備後置處理示意圖。 ........................................................... 27 圖二十六、樣品槽組裝示意圖 ............................................................................... 28 圖二十七、單分子實驗設計示意圖 ....................................................................... 29 圖二十八、實驗中電子躍遷與其放光過程的示意圖 ........................................... 30 圖二十九、Trolox 在含氧的環境下照光氧化為 Trolox quinone。 ..................... 31 圖三十、放光過程中的光漂白現象示意圖。 ....................................................... 31 圖三十一、各除氧系統和氧氣反應並生成酸的比例。 ....................................... 32 圖三十二、各除氧系統條件下 pH 值對時間的改變。 ........................................ 32 圖三十三、DNA 樣品在全內反射式顯微鏡的觀察圖像。 ................................. 34 圖三十四、數據處理與分析程序。 ....................................................................... 36 圖三十五、HaMMy 程式操作介面。 ................................................................... 37 圖三十六、TDP 程式操作介面。 ......................................................................... 38 圖三十七、單分子螢光共振能量轉移實驗樣品設計圖。 ................................... 39 圖三十八、CGG 重複序列在 150 mM 鉀離子所得之 EFRET 直方圖。 ........... 40 圖三十九、(CGG)19 分別在 150 mM 鋰、鉀離子所得之 EFRET 直方圖。 ....... 41 圖四十、(CGG)9、(CGG)10、(CGG)19 與 (CGG)20 在 150 mM 鉀離子下的長時間軌跡圖。 ......................................................................................................... 42 圖四十一、(CGG)19 與(CGG)9AGG(CGG)9 在 150 mM 鉀離子下所得到 EFRET 直方圖。 ............................................................................................................. 43 x.

(13) 圖四十二、(CGG)9AGG(CGG)9 分別在 150 mM 鋰、鉀離子溶液中所得之 EFRET 直方圖 ...................................................................................................... 44 圖四十三、(CGG)9AGG(CGG)9 在 150 mM 鉀離子下的長時間軌跡圖。 ....... 45 圖四十四、(CGG)19 與 (CGG)9AGG(CGG)9 機率轉換密度圖。 ....................... 46 圖四十五、(CGG)19 與 (CGG)9AGG(CGG)9 在 150 mM 鉀離子環境下之圓二色性光譜圖。 ..................................................................................................... 47 圖四十六、(A) (CTG)4T1 與(CTG)4T3 髮夾型結構示意圖。(B) (CGG)19 與 (CGG)9AGG(CGG)9 和髮夾結構鑑定模型(CTG)4T1、(CTG)4T2 與 (CTG)4T3 所得之 EFRET 直方圖。 ................................................................... 48 圖四十七、奇數組 CGG 重複序列主要構型與短暫停留的構型示意圖。 ...... 49 圖四十八、插入一組 AGG 的 CGG 重複序列在 150 mM 鉀離子下的長時間軌跡圖與構型轉換示意圖。 ............................................................................. 49 圖四十九、奇數組與偶數組 CGG 重複序列以及插入一組 AGG 的 CGG 重複序列可能的構型示意圖。 ............................................................................. 50 圖五十、(CGG)19、(CGG)9AGG(CGG)9 、(CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)4 與 (CGG)4AGG(CGG)10AGG(CGG)4 在 150 mM 鉀離子下所得到 EFRET 直方圖。 ..................................................................................................................... 51 圖五十一、增長中間序列的插入兩組 AGG 的 CGG 重複序列實驗設計。 ...... 52 圖五十二、(CGG)4AGG(CGG)nAGG(CGG)4 n = 9、10、15、16 在 150 mM 鉀離子下所得到 EFRET 直方圖。......................................................................... 53 圖五十三、(CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)4 與(CGG)4AGG(CGG)10AGG(CGG)4 在 150 mM 鉀離子下的長時間軌跡圖。 ........................................................ 54 圖五十四、奇數間隔組 (CGG)4AGG(CGG)nAGG(CGG)4 在 150 mM 鋰、鈉、鉀離子環境下所得之 EFRET 直方圖。............................................................. 55 圖五十五、偶數間隔組 (CGG)4AGG(CGG)nAGG(CGG)4 在 150 mM 鋰、鈉、鉀離子環境下所得之 EFRET 直方圖。............................................................. 56 xi.

(14) 圖五十六、偶數間隔組 (CGG)4AGG(CGG)nAGG(CGG)4 在 150 mM 鋰、鈉、鉀離子環境下額外添加 5 mM 鎂離子所得之 EFRET 直方圖。 .................... 56 圖五十七、奇數間隔組 (CGG)4AGG(CGG)nAGG(CGG)4 在 150 mM 鋰、鈉、鉀離子環境所得之圓二色性光譜圖。 ............................................................. 57 圖五十八、偶數間隔組 (CGG)4AGG(CGG)nAGG(CGG)4 在 150 mM 鋰、鈉、鉀離子環境所得之圓二色性光譜圖。 ............................................................. 57 圖五十九、(CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)4 與(CGG)4AGG(CGG)10AGG(CGG)4 (A)結構鑑定 (B)可能的構型示意圖。 ............................................................ 59 圖六十、富含 CGG 的重複序列在 150 mM 鉀離子濃度下難以形成 G-四聯體。 ..................................................................................................................... 60 圖六十一、CGG 重複序列複製擴張模型預測圖以及插入一組與兩組 AGG 對於滑動現象的影響。 ......................................................................................... 62. xii.

(15) 表目錄表一、G4 結構於圓二色光譜中的特徵峰值。 ..................................................... 20 表二、實驗所使用之目標序列，紅字為經過突變後的位置。............................ 22 表三、實驗設計的副序列及其互補股。................................................................ 22 表四、黏合反應配方。............................................................................................ 24 表五、顯像緩衝溶液的最終濃度。........................................................................ 33. xiii.

(16) 第一章、緒論. 1-1 前言微衛星 (microsatellites) 序列又被稱為簡單重複序列（Simple Sequence Repeats，SSRs），通常由一個到六個鹼基對的基本單元重複片段所組成[1]，常分布於染色體中，分布的範圍包含編碼區 (coding region)、非編碼區 (non-coding region)、啟動子 (promotor) 和三端非轉譯區 (3’ untranslated region, 3’ UTR) 與五端非轉譯區 (5’ untranslated region, 5’ UTR) [1]，如圖一所示。三核苷酸重複 (trinucleotide repeats, TNR) 序列是以三個核苷酸為單位的重複序列，為微衛星重複序列的主要種類之一。TNR 序列的不正常擴張 (expansion) 被認為與許多遺傳性神經疾病有關[2]，當重複次數超過特定數量時，可能導致神經退化性疾病[3]。且當基因遺傳至子代時，有可能進一步擴張，使重複序列更加增長，導致發病 (onset) 年齡更早甚至更嚴重[2,4,5]。. 圖一、不同重複序列導致的疾病與其在基因的位置。摘錄自參考資料 [1]。. 1.

(17) 不同的遺傳性神經疾病有其對應的重複序列，正常個體與發病個體的序列重複次數也各不相同，如圖二所示[5]。而本篇研究的目標為引發 X 染色體脆折症 (Fragile X syndrome) 的 CGG 重複序列。. 圖二、各種遺傳性神經疾病與其對應重複序列，藍色為正常的重複次數範圍，紅色為發病的重複次數範圍。摘錄自參考資料[5]. 2.

(18) 1-2 X 染色體脆折症 X 染色體脆折症是一種常見的性聯遺傳性神經性疾病，僅次於唐氏症 (Down syndrome) 為造成智能障礙的第二大原因。致病的主因與 FMR1 (Fragile X Mental Retardation 1) 基因中五端非轉譯區的 CGG 重複次數異常擴張有關[3]。在 1969 年 Herbert Lubs 透過標記 X 染色體，在 X 染色體下端觀察到一個脆折的特徵，證明了與 X 染色體有關[6]，直到 1991 年，Verkerk 及其同事鑑定了 X 染色體上 FMR1 基因與 X 染色體脆折症關係，建立了整個疾病的分子基礎[7]。一般正常女性的染色體為 XX，若只有一個 X 染色體為異常，可以在另一個正常的 X 染色體的保護下變成帶因者；而一般男性則為 XY，缺乏另一正常 X 染色體保護而顯現症狀。這也就說明了女性帶因率高，但症狀卻在男性身上出現機率較高[3]。. 圖三、正常個體、準突變個體、全突變個體在 FMR1 的 5'-UTR 的 CGG 重複次數，以及轉譯後的基因產物。摘錄自參考資料 [8]。. 3.

(19) FMR1 基因在正常個體中 CGG 序列重複次數通常低於 54，並會穩定地傳給子代;若重複次數在 55~200 之間，則為準突變 (pre-mutation) 狀態，個體本身通常無任何症狀，但若此基因經由女性傳給下一代時，可能造成 CGG 重複序列進一步擴增，而達到全突變 (full- mutation) 狀態，此時 CGG 序列重複次數大於 200，而個體具有上述症狀，如圖三[3,8,9]。. 1-2.1 X 染色體脆折症致病原因病患的 FMR1 基因中除了發現有大量的 CGG 序列片段外，也發現其 X 染色體 Xq27.3 位置的 CpG 位點 (CpG sites) 如圖四，有過甲基化 (Hypermethylated) 的現象[9,10]。CpG 位點指 DNA 某個區域鹼基序列以胞嘧啶 (cytosine) 連接鳥嘌呤 (guanine)，CpG 位點上的胞嘧啶可以被甲基化成 5’-甲基胞嘧啶 (methylated cytosine) ，如圖五所示[10]。. 圖四、FMR1 位於人類 X 染色體中 Xq27.3 位置示意圖。鍵頭指的位置是 Xq27.3。摘錄自參考資料 [9]. 圖五、DNA 甲基化示意圖。左邊是胞嘧啶，右邊是甲基化後的胞嘧啶，摘錄自參考資料[11]. 4.

(20) 組蛋白 (Histone) 為真核生物中的核內蛋白，與 DNA 纏繞組成核小體，是真核生物染色質的基本單位。在正常情況下，未甲基化的 DNA 能自行與轉錄因子 (Transcription factor) 結合，但 DNA 甲基化後被甲基結合蛋白 (methyl-CpGbinding domain proteins, MBD, 圖六綠色部分）和 DNA 甲基化轉移酶 (DNA methyl transferases, 圖六橙色部分)辨識並附著，使更多蛋白質附著在基因座 (locus)，像是組蛋白脫乙醯酶 (Histone deacetylases, HDACs)、組蛋白甲基轉移酶 (Histone methyl transferases, HMTs)，形成緊密的染色質，使得轉錄因子難以與 DNA 結合，進一步抑制基因表達[12]。. 圖六、DNA 甲基化影響 DNA 轉錄示意圖。摘錄自參考資料[12]. 由於 CGG 重複序列的異常擴張，導致 FMR1 基因啟動子中的甲基化區域過多，而在 FMR1 基因受影響的區域會使腦部無法正常生成 FMRP (Fragile X Mental Retardation 1 fusion protein) 基因產物，進而影響智力的發展[10]。. 5.

(21) 1-3 DNA 重複序列的擴張 CGG 重複序列在擴張所引起染色體脆折症的成因已有相當程度的了解[7]，但在 DNA 層級如何引起序列擴張的機制仍不清楚[13]。Mirkin 提出在複製 (replication)、修復 (repair) 或重組 (recombination) 過程中，因為二級結構的形成而可能造成擴張的機制[14]，簡述如下: DNA 在複製過程中，會先利用 DNA 解旋酶於複製起點解開雙股之間的氫鍵，各自分開成單股核苷酸當複製的模板，形成複製叉 (Replication fork) 的結構 [15]。. 圖七、複製叉 (Replication fork) 示意圖。摘錄自參考資料[15]. 形成複製叉後，引子酶 (primase) 分別與單股 DNA 結合，成為 DNA 聚合酶 (DNA polymerase) 作用的起點，以互補鹼基的方式複製。但 DNA 聚合酶會辨認方向性，因此僅其中一段能連續的進行複製，為領先股 (leading strand) (複製方向從 5’端到 3’端)；另一段則是分段複製，為延遲股 (legging strand) (複製方向從 5’端到 3’端)。在延遲股上形成的 DNA 片段稱為岡崎片段 (Okazaki fragment)，最後由 DNA 連接酶串聯起來如圖七[15]。若在領先股形成髮夾型結構，領先股會重複延伸滑出模板外，當反向複製叉向後翻轉重新啟動複製時，使領先股多出了新的重複序列，最終導致序列的擴張如圖八[14]。. 6.

(22) 圖八、DNA 不正常複製示意圖。二級結構分別在領先股與延遲股上，造成 DNA 複製的擴張或縮短摘錄自參考資料[14]. DNA 重組與修復亦會導致序列擴張，核苷酸序列在損傷時，引發同源重組 (Homologous recombination)、錯配修復 (Mismatch repair) 等修復機制來修復已損傷的 DNA，同源重組修復期間的錯位如圖九 (A)；或在雙鏈斷裂修復過程中產生滑動 (slippage)，如圖九 (B)，都可能導致重複序列擴張[16]。. 圖九、(A) 同源重組錯位導致的擴張事件(左) 收縮事件(右)。(B) 雙鏈斷裂修復過程滑動導致的擴張事件 (左)，或重複序列單元的缺失導致收縮事件 (右)。摘錄自參考資料[16]。. 7.

(23) 1-4 CGG 重複序列已知的二級結構在上一節提到的重複序列擴張機制中，重複序列折疊成的二級結構扮演了重要的角色，而 CGG 三重複核苷酸序列可能形成的二級結構大致上分為兩種，一種是與 CNG (N 可以是 A 、 T 、 C) 相同折疊成髮夾型的結構 (hairpin structure)[17]；另一種則是因 CGG 重複序列富含鳥嘌呤，在特定條件下可能形成鳥嘌呤四聯體 (G- quadruplex)[18]。. 1-4-1 髮夾型結構髮夾型結構是指反向重複單鏈 DNA，以互補鹼基對的方式，長鏈反摺的一種二級結構。互補鹼基對形成的雙股螺旋稱為莖 (stem)，無鹼基配對的區域稱為環 (loop)如圖十[19]。. 圖十、髮夾型結構示意圖. (CGG)n 會以本身的 C-G 配對與 G-G 錯誤配對形成髮夾型結構，折疊方式與重複次數為奇數或偶數有關。Kazuhiko Nakatani 團隊透過聚丙烯醯胺膠體電泳 (Polyacrylamide gel electrophoresis) 與圓二色性光譜 (Circular dichroism spectroscopy) 確認了 CGG 髮夾型結構的存在[17]。 Mergny 團隊也透過溫度紫外光吸收光譜 (Temperature UV-absorbance spectrum) 發現 CGG 重複序列的構型並非 G –四聯體，更加確立了 CGG 重複序列應是髮夾型結構[20]。. 8.

(24) 1-4-2 鳥嘌呤四聯體鳥嘌呤四聯體由富含鳥嘌呤的 DNA 序列所組成，在特定的離子條件下，以四個鳥嘌呤為單位，彼此以 Hoogsteen 氫鍵配對形成鳥嘌呤四分體 (G-quartet)，再以多層的鳥嘌呤四分體堆疊成鳥嘌呤四聯體。層與層中間通常會有陽離子以減少鳥嘌呤之間的靜電排斥力而穩定。可依四股的方向分成平行 (parallel)、反平行 (antiparallel) 以及混合型 (hybrid) ，如圖十一[21]。. 圖十一、鳥嘌呤四聯體結構以及常見的折疊方式示意圖。摘錄自參考資料[21]. 2004 年時 Michaela 團隊透過圓二色性光譜與膠體電泳研究 CGG 重複序列，當重複次數小於 7 時，在加入 2M 鉀離子溶液加熱至 90℃，等待五分鐘後緩慢降溫至隔夜，CGG 重複序列會形成分子間的 (intermolecular) 鳥嘌呤四聯體 [18]。隨後該研究團隊在 2008 年時，重複次數大於 7 的 CGG 重複序列在 2mM 的鉀離子條件下加入乙醇，也能夠折疊成鳥嘌呤四聯體[22]。雖然這些研究中鳥嘌呤四聯體的形成並非在生理 (physiological) 條件下，但也不能排除此一結構在生理條件下少量存在的可能。. 9.

(25) 1-5 AGG 插入對於 CGG 重複序列的影響正常人類的 FMR1 基因中，每 8 到 11 個 CGG 重複序列，存在著 AGG 序列的中斷，在具有 AGG 插入的 CGG 重複序列並不會致病，並且穩定不會被不正常擴張[23]。AGG 序列的插入可能改變了原本序列的穩定性，使 CGG 重複序列形成不同的構型[23,24]，便是本篇想要探討的重點。 Sarah Delaney 團隊在 2010 年時，對於 (CGG)19 與 (CGG)39 進行構型分析，發現在插入 1 個 AGG 序列的情況下，DNA 仍維持一般髮夾型結構，如圖十二 (A)所示；但在插入 2 個 AGG 序列時，有可能形成兩個環的髮夾型結構，如圖十二 (B)(C)所示，但他們無法判斷何者為主要構型[25]。. 圖十二、(A) 為 (CGG)19 在插入 1 個 AGG 序列可能形成的構型。(B)(C) 為 (CGG)19 在插入 2 個 AGG 序列可能形成的構型。摘錄自參考資料[25]. Michaela 團隊則對於 AGG 插入 CGG 重複序列形成鳥嘌呤四聯體的影響進行了研究，在序列長度較短的情況下，AGG 序列是有助於形成四聯體的；隨著序列長度越長，鳥嘌呤四聯體就越難生成。在加入其他誘導劑如:乙醇，使其形成 G-四聯體，插入 AGG 的序列也是相對穩定的[22]。. 10.

(26) 1-6 重複序列髮夾型結構的動態滑動及其擴張的關係在本實驗團隊先前發表的結果中，分別對於 TGGAA 重複序列[26]，如圖十三 (A)，與 CTG 重複序列[4]，如圖十三(B)，提出了滑動動態擴張 (dynamic slippage expansion) 的模型:若 DNA 在複製、修復、重組的過程中，新增一組重複序列，形成突出型髮夾型結構，將不利於進行進一步的擴張。但此時序列可藉由滑動進行動態結構重組，使其形成有利於近一步的擴張的對齊型髮夾結構，在此情況下多次循環將連續擴張成更長序列[4,26]。藉著 AGG 序列的插入對於 CGG 重複序列構型上的變化，找出 AGG 序列在 CGG 重複序列擴張機制中造成的影響。. 圖十三、(A) TGGAA 重複序列擴張示意圖。摘錄自參考資料[26]。(B) CTG 重複序列擴張示意圖。摘錄自參考資料 [4]. 11.

(27) 1-7 研究動機已知 X 染色體脆折症與 CGG 三重複序列的擴張有關，在研究擴張機制中，二級結構及其動態滑動尤其重要。CGG 三重複核苷酸序列主要有髮夾型結構與 G-四聯體兩種構型。AGG 序列插入對於 CGG 重複序列構型的影響是本篇探討的重點，過去只粗略知道 AGG 序列的插入使得 CGG 重複序列有機會形成其他構型，但無論是存在 1 個環以上的髮夾型結構，亦或是有機會形成 G-四聯體，過去難以解析超過一種的情況，構型之間的比例與動態更無法得知。本篇論文透過單分子螢光共振轉移能量 (Single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer) 光譜，配合圓二色性光譜輔助，對於 CGG 重複序列與插入 AGG 的 CGG 重複序列作一系列的測量，分析其主要構型，及是否能在一般生理條件鹽類濃度下，產生一定比例的 G-四聯體，更想透過時間解析來判斷是否有滑動現象，或是構型之間的轉換。藉以瞭解 AGG 序列插入在結構與結構動態學上對避免造成 X 染色體脆折症上所扮演的角色。. 12.

(28) 第二章、實驗方法與儀器 2-1 實驗技術 2-1.1 單分子實驗技術單分子實驗 (single-molecule experiment) 成為近年來生物物理學的熱門主題，是相對於整體實驗 (ensemble experiment) 的一種技術，只針對單一分子進行觀察，進而得到在一定時間內的分子動力學與動態學。生物相關的分子本身較為複雜，若是以巨觀 (bulk) 的實驗條件下，僅能觀察到整體的平均值，且因濃度較高而易形成聚合物。單分子技術則突破了過去生物學的的研究，藉由單一分子的觀察，可能發現過去未能發現的亞族群 (subpopulation) 或中間體 (intermediates) [27]。. 現今單分子技術分為兩種方式，一種是以力為主的方式，例如透過對單一分子施加機械力的原子力顯微鏡 (atomic force microscope) 圖十四(A)，藉由施力操控分子，以得到生物分子中與力以及能量相關的資訊；利用雷射操控聚合球的光鉗 (optical tweezers) 圖十四(B)，以及用磁力操控磁球的磁鉗 (magnetic tweezers) 圖十四(C)，都是以力為主的方法。另一種則是以螢光為基礎的方式，以螢光標記欲實驗的分子，藉著偵測螢光的方式來分析分子的行為，如圖十四(D)[27]。本篇實驗所採取的實驗方法是單分子螢光光譜。. 13.

(29) 圖十四、單分子實驗技術示意圖。(A) 原子力顯微鏡；(B) 光鉗；(C) 磁鉗；(D) 單分子螢光光譜。摘錄自參考資料[27]。. 2-1.2 螢光原理介紹大多情況下分子皆處於最低能量的狀態，稱做基態 (S0) 。當吸收了特定光源後，電子便躍至單重激發態 (Sn)。經一段時間後，螢光分子可能產生振動鬆弛 (vibration relaxation) 降至最低能量的激發態，此時再以光的形式釋放能量回至基態，放出的光即是螢光 (fluorescence) [28]。但也可能經內轉換過程躍遷至三重激發態 (T1)，以發出磷光 (phosphorescence) 的方式回到基態，如圖十五。. 圖十五、Jablonski Diagram。修改自參考資料[28]。. 14.

(30) 2-1.3 螢光共振能量轉移在欲研究的單一分子上不同位置標記上供體 (donor) 和受體 (acceptor) 兩種螢光分子，供體吸收特定的波長，電子自基態躍遷至激發態，因電子處於激發態時能量太高且不穩定，分子間產生振動鬆弛下降到激發態的最低能階。若此時供體與受體距離小於 10 nm，且兩者間的偶極矩 (dipole moment) 不是垂直的情況，能量藉由共振轉移至受體，受體吸收能量躍遷至激發態，再以釋放螢光回到基態。為了更加了解蛋白質、DNA 等生物分子的結構，透過兩種以上螢光染料標記，藉此得知其動力學及動態學，稱為螢光共振能量轉移[29]，如圗十六。. 圖十六、螢光共振能量轉移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 示意圖。. 15.

(31) 圖十七、(A) 螢光共振能量轉換效率 (EFRET) 與兩個螢光染料之間距離。(B) 螢光染料分子的方向性與能量傳遞關係圖。摘錄自參考資料 [29]. 螢光共振能量轉移效率與距離十分相關，當供體與受體的距離較小時，傳遞效率較高，反之則變低，如圖十七(A)。螢光共振能量轉移效率的公式 (1) 如下所示 : 𝐸FRET =. 𝐼𝑎𝑐𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟 1 = 𝑅 𝐼𝑑𝑜𝑛𝑜𝑟 + 𝐼𝑎𝑐𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟 1 + (𝑅 )6. (1). 0. EFRET : 螢光共振能量轉移效率。 IA : 受體螢光強度。 ID: 供體螢光強度。 R：受體與供體分子間實際距離。 R0：Förster distance。螢光共振能量轉移效率為 50% 時供體與受體的距離。以此公式能得出如圖十七 (A) 的趨勢圖，最靈敏的偵測範圍為 3~8 nm。公式中與距離的六次方成反比，因螢光共振能量轉移是透過螢光分子間的偶極-偶極交互作用 (dipole-dipole coupling) 。但能量要能順利的傳遞，供體的放射光譜 (emission spectrum) 與受體的激發光譜 (excitation spectrum) 需有部分重疊。. 16.

(32) 2-1.4 螢光染料的選用本篇實驗使用的螢光染料分別是: 供體為 Cy3，受體為 Cy5，圖十八上方為其結構圖，圗十八為光譜圖，Cy3 的放射波長 (Dex) 與 Cy5 激發波長 (Aem) 重疊(overlap)，因此能有效的將能量傳遞。Cy3 訊號因能量傳遞下降時，Cy5 訊號隨之上升，是目前較為廣泛應用於螢光共振能量轉移的螢光分子對[29]。. 圖十八、Cy3 和 Cy5 的結構及其激發光譜與放射光譜。摘錄自參考資料[29]. 17.

(33) 2-1.5 全內反射式螢光顯微鏡為了只量測一對染料分子的螢光訊號，提高訊雜比 (signal-to-noise ratio) 就變得格外重要。當光自高密度的介質入射到低密度介質時，若入射角 (incident angle, θi) 大於臨界角 (critical angle, θc) 時，光會產生全反射 (Total internal reflection)。然而在兩介質之間，發生全反射的位置，存在微量的穿透，稱之為漸逝波 (evanescent wave)，藉此作為激發光源，使帶螢光之樣品產生全反射螢光影像。因單分子實驗是將實驗分子固定在玻片表面，此方法能有效降低雜訊，大幅地提升訊雜比[30]。全內反射式螢光顯微鏡 (Total internal reflection fluorescence microscope, TIRF-M) 依光入射方式主要分為兩種類型，稜鏡式 (prism type) 與物鏡式 (objective type)。稜鏡式以顯微鏡與稜鏡方式產生全反射如圖十九(A) 所示，而物鏡式一般只建立於倒立顯微鏡上如圖十九(B)，本實驗所選用的是稜鏡式全內反射式顯微鏡。. 圖十九、全內反射式螢光顯微鏡的裝置示意圖。 (A) 稜鏡式。 (B) 物鏡式。修改自參考資料 [30]。. 18.

(34) 受激發的螢光染料，供體自身或受體受螢光共振能量轉移放出的螢光，均經物鏡、濾鏡以及長狹縫，再經由兩消色差透鏡 (achromat) ，將影像聚在位於焦面 (focal plane) 的影像偵測器上，最後於相機前放置雙色鏡 (dichroic mirror)，將供體與受體放出的光分開，使其進入電子放大式電荷耦合器 (Electron Multiplying Charge-Coupled Device, EMCCD)，放大螢光訊號以供單分子實驗的測量，同時觀察兩頻道的影像[31]，如圖二十所示。. 圖二十、稜鏡式全內反射螢光顯微鏡與光路徑示意圖。修改自參考資料[32]. 19.

(35) 2-1.6 圓二色性光譜 (Circular dichroism spectrum) 圓二色性光譜是鑑定生物分子重要的光譜技術之一，大部分的生物分子具對掌性 (chirality)，其鏡像無法與原物重合，如同左右手。當平面偏極光通過該分子，分成左旋與右旋兩種圓偏極光，因其結構而有不同吸收度，重合其訊號產生橢圓偏振光，即圓二色性 (circular dichroism, CD)[33]。核酸在生物體內會形成一級至四級的結構，圓二色光譜儀是鑑定核酸構型變化的重要工具，於本實驗用來確定目標 DNA 序列是否有 G-四聯體的產生，以及是何種形式的結構。判斷構型的依據主要依靠左旋減掉右旋圓偏振吸收度，其差值亦會受到樣品濃度與光徑之影響，但主要以正負值來分析，判讀上與其無關。如表一所示，混合型結構 (hybrid) 於波長 240nm 有明顯負值峰，265nm 與 295nm 則為正值峰；反平行結構 (anti-parallel) 在波長 240nm 與 295nm 具正值峰；平行結構 (parallel) 則在 265nm 有正值峰，245nm 為負值峰，依特徵峰判斷是否有其構型[34]。 CD profile at λ (nm). Type of the Gquadruplex. 210. 240. 265. 295. Parallel. +. -. +. +. Anti-parallel. +. +. -. +. Hybrid. +. -. +. +. 表一、G4 結構於圓二色光譜中的特徵峰值。修改自參考資料[34]。. 20.

(36) 2-2 實驗樣品製備 2-2.1 實驗序列設計實驗序列的設計上，分為目標序列、副序列、副序列互補股 (Complementary strand)。主要序列 (Major) 包含目標序列與副序列，並於 5’端位置修飾 NH2C6，以連接供體螢光基團 Cy3。副序列互補股在 A11 與 G12 接上另一受體螢光基團 Cy5，並於 5’端尾端修飾上生物素 (biotin) ，可與中性親合素 (NeutrAvidin) 結合，藉此固定於玻片表面上。而主序列上的副序列會與其互補股接合，並不會影響實驗序列上的判斷。. 圖二十一、單分子實驗序列設計。. 序列名稱. 序列 (5’-3’). (CGG)9. CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG. (CGG)10. CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG. (CGG)19. CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG. (CGG)20. CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG 21.

(37) (CGG)9AGG(CGG)9. CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG. (CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)4. CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG CGG. (CGG)4AGG(CGG)8AGG(CGG)4. CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG CGG. (CGG)4AGG(CGG)10AGG(CGG)4. CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG CGG. (CGG)4AGG(CGG)12AGG(CGG)4. CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG CGG. (CGG)4AGG(CGG)13AGG(CGG)4. CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG CGG. (CGG)4AGG(CGG)15AGG(CGG)4. CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG CGG. (CGG)4AGG(CGG)16AGG(CGG)4. CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG AGG CGG CGG CGG CGG. 表二、實驗所使用之目標序列，紅字為經過突變後的位置。. 名稱. 序列(5’-3’). 副序列互補股. Biotin-TGG CGA CGG CA/iCy5/G CGA GGC. 副序列. GCC TCG CTG CCG TCG CCA. 表三、實驗設計的副序列及其互補股。. 22.

(38) 2-2.2 螢光分子的標記於設計 DNA 時，將目標序列的 5’端處第一個核苷酸，加以連接六個碳的氨基 (NH2C6) ，透過氨基的交聯反應 (cross-linking reaction) ，與 Cy3 NHS ester 反應，使 Cy3 標記於目標序列 5’端上，反應如圖二十二所示，Cy3 與目標序列距離約為 2 nm，不影響整體折疊的狀況。. 圖二十二、Cy3 NHS ester 和經 NH2C6 修飾之 DNA 的交聯反應。摘錄自參考資料[31]. 修飾螢光染料分子步驟如下： 1.. 離心機離心以修飾好氨基的 DNA，避免其沾黏於管壁上。. 2.. 從 -20℃ 冰箱中取出已分裝好的 Cy3 NHS ester 粉末，將 0.2 mg Cy3 NHS ester 加入 35 μL 四硼酸鈉 (sodium tetraborate decahydrate, 0.1 M, pH = 8.6)，配置成 Cy3 溶液。. 3.. 加入 Cy3 溶液於 DNA 粉末中，於室溫下避光慢速旋轉 12 小時。. 4.. 對混合好的溶液施以酒精沉降法 (ethanol precipitation)，加入 3.5 μL 氯化鈉 (NaCl, 3M)、87.5 μL 乙醇 (C2H5OH, -20℃, 99.5%)，並於 -20℃ 冰箱避光靜置 30 分鐘後，再以 4℃、11200 rpm 條件高速離心 30 分鐘。. 5.. 取出上清液，重複步驟 4。. 6.. 取出上清液，以氮氣吹乾，再以超純水回溶至 100 μM。. 23.

(39) 2-2.3 寡核苷酸黏合反應修飾完 Cy3 的目標序列，需再和連接生物素與 Cy5 之副序列互補股黏合 (anneal)。依表三所示之配方，放入聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction, PCR) 機器中，，加熱至 95℃維持 5 分鐘，隨後以每分鐘下降 1℃ 的速率降溫至 22℃，最後為避免樣品汙染，將樣品以 T0 buffer (20μL Tris 7 : 3 + 980μL ddH2O) 稀釋至 250 nM 與 10 nM 的濃度後存放於 -20℃ 冰箱，即完成實驗用的 DNA 樣品。名稱. 加入體積 (μL). 副序列互補股(100 μM). 1. 目標序列與副序列 (100 μM). 3. T0 buffer (20μL Tris 7 : 3 + 980μL ddH2O). 16. 表四、黏合反應配方。. 黏合反應是將 DNA 先加熱至超過熔點，DNA 構型會完全打開，再以緩慢降溫的方式回至室溫，以此種方式使副序列與其互補股形成雙股結構，折疊成最穩定之構型。. 圖二十三、黏合反應的示意圖。. 24.

(40) 2-2.4 樣品槽製備與組裝樣品槽的製備分為前置處理 (清理殘膠) 和後置處理 (修飾表面)。前置處理步驟如圖二十四： 1.. 回收用過的完整樣品槽，拋棄其蓋玻片，將石英載玻片用刀片刮除邊緣殘膠 (應避免刮到實驗區域)。. 2.. 泡入超純水放入微波爐加熱十分鐘，再用丙酮 (CH3COCH3) 及超純水沖洗乾淨，最後泡入食人魚試劑 (雙氧水與硫酸比例為 1:3) 靜置 30 分鐘。. 3.. 取出石英載玻片，以超純水洗淨後以火燒乾表面，放入洗淨之染色壺，加入丙酮保存。. 4.. 另準備一乾淨染色壺，放入乾淨的蓋玻片，加入丙酮保存。. 圖二十四、樣品槽製備前置處理示意圖。. 25.

(41) 後置處理的步驟如圖二十五：將前置處理好的載玻片與蓋玻片，置換新的丙酮，用超音波震盪 30 分鐘，以超純水重複洗淨。 1.. 倒入氫氧化鉀 (KOH, 3 M) 完全淹沒載玻片及蓋玻片，用超音波震盪 30 分鐘，以超純水洗淨。. 2.. 倒入甲醇完全淹沒載玻片及蓋玻片，用超音波震盪 30 分鐘，超純水洗淨並以氮氣吹乾。. 3.. 用火反覆燒載玻片上實驗區域，約 2 至 3 分鐘。蓋玻片則放入空氣電漿清洗機 (plasma cleaner PDC-32G) 以功率 11 W 清洗 5 分鐘。. 4.. 另外取出兩個乾淨的空染色壺及一個乾淨的錐形瓶，倒入氫氧化鉀 (KOH 3 M)，用超音波震盪 30 分鐘。. 5.. 再將染色壺及錐形瓶裝滿甲醇，用超音波震盪 30 分鐘後，以甲醇潤洗並用氮氣吹乾。. 6.. 把步驟 4 清洗好之載玻片與蓋玻片放入處理過的染色壺中。. 7.. 錐形瓶中加入 100 ml 甲醇、5 ml 醋酸 (CH3COOH)、1 ml 三甲氧矽丙基乙二胺 (aminosilane)，將混合好溶液倒入裝有載玻片與蓋玻片的染色壺中，靜置 10 分鐘後，使用超音波震盪 1 分鐘，再靜置 10 分鐘後，以超純水潤洗載玻片及蓋玻片，並用氮氣吹乾。. 8.. 取 (玻片數+0.5)*16 mg 的聚乙二醇 (mPEG-SVA)、(玻片數+0.5)*0.32 mg 的含生物素修飾之聚乙二醇 (biotin-PEG-SVA) 與 (玻片數+0.5)*64 μL 的碳酸氫鈉 (NaHCO3, 0.1 M) 配製成 PEG 溶液，以冷凍離心機於 25℃ 離心 2 分鐘，並使其混合均勻。. 9.. 將 PEG 溶液取 60 至 70 μL 加在載玻片中心呈一直線，蓋上蓋玻片，放在暗處靜置 4 小時。. 26.

(42) 10. 以超純水清洗玻片後，直至有明顯疏水面，裝入 50 ml 離心管 (瓶身需用鋁箔紙包起來)，最後放進密封袋裡抽真空，存放於 -20℃ 冰箱。. 圖二十五、樣品槽製備後置處理示意圖。. 27.

(43) 樣品槽組裝步驟如下 (圖二十六)： 1.. 將保存於 -200C 的載玻片與蓋玻片取出，於避光處放置室溫。. 2.. 將載玻片以修飾表面朝上，黏貼雙面膠帶分隔出迴流通道。. 3.. 將蓋玻片以修飾表面朝下，覆蓋黏貼於載玻片上。. 4.. 利用刀片將多於雙面膠帶切除. 5.. 用環氧樹脂 (epoxy) 黏於兩側，形成封閉之迴流通道，將樣品槽移至陰暗處，待環氧樹脂乾後，即可使用。. 圖二十六、樣品槽組裝示意圖. 2-2.5 DNA 黏合反應 (annealing) 由於單分子實驗在觀測時，應避免實驗樣品過多，形成聚集現象，難以觀測單分子的異質性，因此會將實驗樣品再稀釋到更低的濃度。取 0.2 µL 10 nM 目標 DNA、2 μL 20 μg/μL 牛血清蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 和 197.8 μL Tris salt buffer (1 M Tris buffer, pH = 8.3 及實驗條件之鹽類)，配製成 10 pM 的 DNA 樣品。於操作單分子實驗前，將配置好的樣品放入聚合酶連鎖反應器進行黏合反應，以下列溫度進行：先加熱樣品至 50℃維持該溫度 12 分鐘，接著以 12 分鐘降 1 ℃ 降至 22 ℃ 確保其形成熱力學最穩定的結構。. 28.

(44) 2-2.6：樣品固定於樣品槽. 本實驗利用表面束縛 (surface tethering) 使樣品能附著於玻片上，樣品原先已鋪有 PEG 與少量的 Biotin-PEG ，在樣品槽中打入抗生物素醣蛋白 (NeutrAvidin Protein)，在控制其濃度與反應時間下，與 Biotin-PEG 結合，以此達到單分子的實驗條件。其步驟以 [K+ ] = 150 mM 為例，如圖二十七所示: 1.. 將已組裝好的玻片通道孔朝上，取 45 μL 的 0.2 μg/μL 的抗生物素醣蛋白注入通道，等待約三分鐘。. 2.. 取 45 μL Tris Salt Buffer (20 mM, pH = 8.3, KCl = 150 mM) 沖洗移除過多未結合的抗生物素醣蛋白，並保持通道在反應鹽類條件環境。. 3.. 取 45 μL 的 10 pM 實驗樣品注入樣品槽，不同序列反應時間可能不同，視結合狀況進行調整，再以 Tris Salt Buffer 沖洗未附著之實驗樣品。. 圖二十七、單分子實驗設計示意圖. 29.

(45) 2-2.7：顯像緩衝溶液 (Image Buffer) 螢光染料分子在實驗觀察中，常常會發生閃爍 (blinking) 以及光漂白 (photobleaching) 的現象，使訊號不穩定不易觀察。螢光的放光過程中，電子可能經系統間跨越 (intersystem crossing) 的方式轉到激發三重態 (excited triplet state)，再放出磷光 (phosphorescence)回到基態，此過程所需的時間為 10-3 - 102 秒，相較於放出螢光過程的 10-7 - 10-9 秒多了許多倍，視其為暗態 (dark state)，如圖二十八。在觀測中若電子亮、暗態轉換會發生閃爍現象，螢光放出亮度會不穩，因此需在顯像緩衝溶液中，額外添加三重態淬熄劑 (triplet quencher)，減少閃爍現象的發生[28,35]。本實驗所選用 Trolox 作為三重態淬滅劑，若有氧化態的 Trolox quinone 出現時，去除三重態的效率會較佳，如圖二十九。. 圖二十八、實驗中電子躍遷與其放光過程的示意圖。摘錄自參考資料 [29]。. 30.

(46) 圖二十九、Trolox 在含氧的環境下照光氧化為 Trolox quinone 。摘錄自參考資料[36]。. 光漂白現象為螢光染料分子在放光過程中被永久中斷，如圖三十所示，原先於溶液中的氧氣在高強度雷射照射下，形成單重態氧分子 (singlet oxygen)，與處在激發三重態的電子反應，導致染料無法正常放光[29]。因此在影像緩衝溶液中添加除氧系統，除去實驗中的氧分子，如圖三十。. 圖三十、放光過程中的光漂白現象示意圖。摘錄自參考資料[29]。. 31.

(47) 2-2.8：酵素型除氧系統常見的酵素型除氧系統有兩種類型。有葡萄糖氧化酶 -過氧化氫酶系統 (glucose oxidase and catalase, GOC)、兒茶酸-3,4-雙加氧酶系統(protocatechuate-3,4dioxygenase, PCD) ，以及吡喃糖氧化酶-過氧化氫酶系統 (pyranose oxidase and catalase, POC) ，圖三十一為試劑消耗氧氣所需反應物，以及生成酸的莫耳數比較，圖三十二則為其 pH 值隨時間下降的關係[37]。. 圖三十一、各除氧系統和氧氣反應並生成酸的比例。摘錄自參考資料[37]。. 圖三十二、各除氧系統條件下 pH 值對時間的改變。摘錄自參考資料[37]。. 32.

(48) 本實驗所選用的除氧系統為 GOC 與 POC 系統，兩者皆以葡萄糖做反應物消耗氧氣，GOC 系統在反應中 pH 值下降較大，容易造成螢光分子的不穩定，不適合用於長時間的測量。而 POC 系統雖較為穩定，適合作長時間的觀測，但對於 G-四聯體的形成可能有影響，故用兩種系統去作比較較為適合，配方如表五。. 顯像緩衝溶液 (GOC 系統). 顯像緩衝溶液 (POC 系統). 藥品. 緩衝溶液中濃度藥品. 緩衝溶液中濃度. Trolox D-Glucose Glucose oxidase. 1.55 mM 0.5 (w/w) 165 unit/mL. Trolox D-Glucose Pyranose oxidase. 1.55 mM 0.5 (w/w) 2.7 unit/mL. catalase Na+/K+ ions Tris buffer. 2170 unit/mL 0~150 mM 20 mM. catalase Na+/K+ ions Tris buffer. 90 unit/mL 0~150 mM 20 mM. 表五、顯像緩衝溶液的最終濃度。. 33.

(49) 2-3 數據處理與分析 2-3.1 數據處理電荷耦合元件 (charge-coupled device, CCD)，是一種積體電路，電荷數量與入射光強度成正比，而電子放大式電荷耦合器與其不同的點是，將倍增暫存器放大的電子，再經由低雜訊的讀出倍增器放大，轉成電壓輸出。因內含致冷器，可使感測晶片降溫至 -70℃，降低暗電流的產生並減少雜訊，將特定訊號區域放大至 200 倍，以 smCamera 軟體記錄 (由 Taekjip Ha 團隊提供)。觀察到的影像分為左、右兩個畫面，如圖三十三所示，同一條 DNA 在左右兩邊相同位置顯示，如紅色圈圈中的 5 個 DNA 分子，左側為供體 (Cy3) 的螢光訊號，右側則為受體 (Cy5) 螢光訊號，如圖三十三。. 圖三十三、DNA 樣品在全內反射式顯微鏡的觀察圖像。. 34.

(50) 實驗設定的曝光時間 (exposure time) 為每幀 (frame) 30 毫秒，但曝光時間僅是各個影像的偵測時間，實際時間仍須考量相機的快門耗時，因此實際每幀的時間是 31.75 毫秒。數據的記錄上分為兩種，一種為短時間錄影，依照每組實驗畫面不同，錄製 20 到 40 個錄影檔，每個錄影檔案含有 30 幀影像，前 20 幀以 532 nm 綠光雷射激發 Cy3 染料所得的訊號，後 10 幀則以 638 nm 紅光雷射激發 Cy5 染料，以偵測 Cy5 受體分子是否仍為有效光。另一種則為長時間錄影，錄製三組以上的錄影檔，內含 3000 幅影像，皆以綠光雷射激發樣品所得的訊號。實驗上採用哈佛大學 (Harvard University, USA) 莊小威 (XiaoWei Zhung) 實驗室已發展的程序 (script)，將實驗得之影像進行疊圖分析，進行單分子的辨識與選取誤差，並排除因分子之間距離過近產生之異常光點。數據處理上使用 MATLAB (Matrix Laboratory, The MathWorks, Inc) 程序將校正好的數據進行後續分析，短時間的檔案分析，取其錄影檔中第 3 到 12 幀影像，將其中螢光分子對分別對時間取其平均，在實驗過程中，供體的螢光訊號再通過濾光片時，會有部分溢漏 (leakage)，需以以下公式 (2) 去計算：. 𝐸FRET =. 𝐼A − 𝛼 𝐼D 𝐼A + 𝛾𝐼D. (2). 𝐼A 及 𝐼D 分別是受體與供體的螢光強度，𝛼 為溢漏修正值 (此實驗的系統 𝛼 值約為 0.2)，γ為量子產率的修正項，在此本實驗裝置中γ接近 1。以此公式得之 EFRET 值匯集即可繪製出圖三十四 (B) 之直方圖. 長時間分析方式則以每個螢光分子對時間變化之訊號，經擬合分析，可得出單分子跟隨時間變化的長時間軌跡圖 (time-dependent long traces)，再以 Origin (OriginLab Corporation) 繪製成圖三十四 (C)。 35.

(51) 圖三十四、數據處理與分析程序。 (A) 錄影檔疊圖分析與校正。 (B) 經 MATLAB 計算後數據繪製成的 EFRET 直方圖。 (C) 單分子長時間軌跡圖，綠線為供體隨時間變化的放光強度，紅線為受體隨時間變化的放光強度，灰線為隨時間變化的 EFRET 值，淺灰色區域部分為螢光強度至 0 時的光漂白現象。. 36.

(52) 2-3.2 動態擬合分析實驗所記錄的長時間軌跡數據，經由 Taekjip Ha 團隊提供的 HaMMy 軟體，以隱藏式馬可夫模型 (Hidden Markov Model) 進行擬合，分析各個分子改變軌跡，如圖三十五所示，辨別具雜訊中的狀態變化，統計出變化機率，進而得到各個狀態發生的次數與構型互換的速率[38]。. 圖三十五、HaMMy 程式操作介面。藍線為長時間軌跡，綠線為演算後得到的狀態變化。. 37.

(53) HaMMy 演算得出的數據利用轉換密度圖 (transition density plot, TDP, Taekjip Ha 團隊提供) 統計出擬合後的起始位置，藉著兩狀態之間互相改變的轉換機率 (transition probability) 相加並以高斯函數 (Gaussian function) 擬合，得到狀態改變的數量以及相關的動力學速率常數[38]，如圖三十六。. 圖三十六、TDP 程式操作介面。左上角 TDP 圖中，以橫軸為狀態變化終點，縱軸為狀態變化起點，以色溫顯示其數量，左下角畫面為 TDP 圖的擬合曲線。. 38.

(54) 第三章、實驗結果與討論 3-1 單分子實驗鑑定物 (assay) 設計 Delaney 團隊的研究指出重複次數為奇數 CGG 重複序列，形成露出一個核苷酸的突出髮夾型 (Single-nucleotide overhang hairpin) 結構[25]；Usdin 團隊的研究則指出重複次數為偶數時，形成對齊髮夾型 (Blunt-end hairpin) 結構[39]，因此本論文中實驗採用如圖三十七所示的序列設計。兩種不同的結構因螢光分子對距離不同而造成 EFRET 值不同，利用單分子螢光共振能量轉移光譜研究其結構與結構動態學 (structural dynamics)。為了瞭解 AGG 對於 CGG 重複序列的影響，將同樣長度重複序列中的 C (Cytosine) 單點突變成 A (Adenine)，並利用單分子共振能量轉移光譜的量測，研究其對於結構與結構動態學的影響，以及是否有形成其他結構，如 G-四聯體。. 圖三十七、單分子螢光共振能量轉移實驗樣品設計圖。. 39.

(55) 3-2 CGG 重複序列 3-2.1 單分子結構鑑定 Gang Wu 團隊的研究指出鉀離子能夠使富含鳥嘌呤的序列形成 G-四聯體 [40]，為了確認 CGG 重複序列是否能夠形成 G-四聯體，我們對重複次數為 9、 10、19、20 次的 CGG 重複序列在 150 mM 鉀離子環境下進行實驗，如圖三十八所示。發現奇數組重複序列 EFRET 值的主要分布略低於偶數組重複序列[41]。而奇數組重複序列在 EFRET 值約 0.7 左右有一個比例較小的分布，顯示可能存在另一種的構型，例如 G-四聯體或更長的突出髮夾型結構。. 圖三十八、CGG 重複序列在 150 mM 鉀離子所得之 EFRET 直方圖。. 40.

(56) 3-2.2 鹽類對於序列的影響陽離子對於 G-四聯體的形成極為重要，已知鉀離子有助於形成 G-四聯體，而鋰離子則被認為不利於形成 G-四聯體[40]。若序列有形成 G-四聯體的傾向，在此兩種離子的溶液中應該會觀察到明顯不同的分布。將 (CGG)19 在鋰離子濃度 150 mM 環境下進行實驗，並與相同濃度的鉀離子環境下的實驗結果做比較，如圖三十九，整體分布峰值中心並沒有因為不同鹽類而改變，且在 EFRET 值約 0.7 仍有一個比例較小的分布，故推測 (CGG)19 在鋰離子及鉀離子應具相似的構型組成。兩個分布說明了有兩種以上的構型，且 EFRET 值在 0.7 附近對應的構型，由於未隨著離子由鉀離子換成鋰離子而消失推斷應非 G-四聯體。. 圖三十九、(CGG)19 分別在 150 mM 鋰、鉀離子所得之 EFRET 直方圖。. 41.

(57) 3-2.3 長時間軌跡圖除了主要分布以外，從直方圖無法看出構型之間是否有變化，必須藉由記錄即時的長時間軌跡圖來觀察單一分子構型狀態隨時間的變化，在本論文中的實驗中，我們以 30 frame per second (fps) 條件連續記錄約 100 秒，觀察構型之間是否有動態變化。在鉀離子濃度 150 mM 環境下對 (CGG)9、(CGG)10、(CGG)19、(CGG)20 記錄長時間軌跡圖，如圖四十。在同一個時間尺度下，奇數組重複序列可觀察到構型之間的變化，而偶數組重複序列則是存在單一種穩定的構型。. 圖四十、(CGG)9、(CGG)10、(CGG)19 與 (CGG)20 在 150 mM 鉀離子下的長時間軌跡圖。紅線為 Cy5 的螢光放光強度；綠線為 Cy3 的螢光放光強度；灰線為計算出來的 EFRET 值；與灰線重疊的紅線則為使用 HaMMy 程式進行 Hidden Markov Model 擬合出的結果。. 42.

(58) 3-3 插入 1 組 AGG 的 CGG 重複序列 3-3.1 單分子結構鑑定 Nelson 團隊研究指出，在正常 FMR1 基因中每 8 到 11 個 CGG 重複單元存在一個 AGG 的中斷[24]。於是以 (CGG)19 做為模板，將 (CGG)19 的第十次重複單元上的 C 置換成 A 形成 (CGG)9AGG(CGG)9，將其在 150 mM 鉀離子環境下進行實驗，觀察序列結構是否受到改變，結果如圖四十一。我們可以觀察到出現兩個主要分布 (EFRET 值約在 0.82 與 0.7)，在原先 CGG 的奇數組重複序列 EFRET 值約 0.7 就有少量的分布，置換成 AGG 之後，EFRET 在 0.7 附近的分布顯著增加，形成兩種數量相當的主要分布，但分布中各自對應何種構型，仍需做進一步的探討。. 圖四十一、(CGG)19 與(CGG)9AGG(CGG)9 在 150 mM 鉀離子下所得到 EFRET 直方圖。. 43.

(59) 3-3.2 鹽類對於序列的影響鉀離子有助於形成 G-四聯體，而鋰離子則被認為不利於形成 G-四聯體[40]。若有形成 G-四聯體的傾向，在兩種離子的溶液中應該會觀察到不同的分布。將 (CGG)9AGG(CGG)9 在鋰離子濃度 150 mM 環境下進行實驗，觀察是否因鹽類的不同而造成構型的改變與數量的變化。從圖四十二中可看出整體依然維持兩個主要分布，峰值中心也沒有因鹽類的變化而改變，推測(CGG)9AGG(CGG)9 在鋰離子及鉀離子均形成相似的兩種構型，且未隨著離子由鉀離子換成鋰離子而變化來推斷兩種主要構型應非 G-四聯體。. 圖四十二、(CGG)9AGG(CGG)9 分別在 150 mM 鋰、鉀離子溶液中所得之 EFRET 直方圖. 44.

(60) 3-3.3 長時間軌跡圖 (CGG)9AGG(CGG)9 在 150 mM 鉀離子形成兩種主要構型，為了觀察構型間是否有互相轉換，以長時間軌跡圖記錄，如圖四十三。在插入 AGG 後的 CGG 重複序列明顯比 CGG 重複序列構型轉換次數更多，且頻率更為頻繁。. 圖四十三、(CGG)9AGG(CGG)9 在 150 mM 鉀離子下的長時間軌跡圖。紅線為 Cy5 的螢光放光強度；綠線為 Cy3 的螢光放光強度；灰線為計算出來的 EFRET 值；與灰線重疊的紅線則為使用 HaMMy 程式進行 Hidden Markov Model 擬合出的結果。. 為了知道構型間的轉換速率，將長時間軌跡圖進行轉換機率分析後，繪製成轉換機率密度圖 (transition density plot, TDP)，如圖四十四。圖中分析 (CGG)19 與 (CGG)9AGG(CGG)9，以 (CGG)19 為例，右邊的主峰，起始值為 0.8，終點值則是 0.68；另一主峰則剛好相反，起始值為 0.68，終點值為 0.8，峰值代表起始狀態變化到終點狀態發生的事件數，分析結果中，這兩種不同的構型會互相轉換。. 45.

(61) (CGG)19 大多處於高 EFRET (~0.8) 狀態，不僅轉換至低 EFRET (~0.68) 狀態速率 (k = 0.01 s-1 )非常低，且低 EFRET 狀態轉換至高 EFRET 狀態速率 (k = 0.17 s-1 )較高，亦即低 EFRET 狀態僅是短暫停留的狀態。相反的，(CGG)9AGG(CGG)9 的高 EFRET 狀態轉換至低 EFRET 狀態速率 (k = 0.04 s-1 )與低 EFRET 狀態轉換至高 EFRET 狀態速率 (k = 0.07 s-1 )較為相近，因此我們認為加入一個 AGG 促使滑動平衡向低 EFRET 狀態偏移。. 圖四十四、(CGG)19 與 (CGG)9AGG(CGG)9 機率轉換密度圖。X 軸為起始的 EFRET 值；Y 軸為變化後的終點 EFRET 值；色溫代表起始狀態變化到終點狀態發生的事件數。. 46.

(62) 3-4 重複序列的圓二色性光譜為了進一步確認構型中是否含有. G- 四聯體，將. (CGG)19 與. (CGG)9AGG(CGG)9 在相同條件下進行圓二色性光譜實驗，如圖四十五。我們猜測在 EFRET 值約 0.7 的構型可能為混合型 G-四聯體 (hybrid G-quadruplex) 或反平行 G-四聯體 (anti-parallel G-quadruplex) ，若重複序列含上述構型，則它們的圓二色性光譜預期在 295nm 波長有明顯的正值峰[34]。但我們在兩種序列皆未觀測到預期的 G-四聯體特徵峰，加上單分子實驗中未隨鋰、鉀離子條件而改變，因此我們排除此兩種序列形成 G-四聯體的可能性，推測應有其他結構，例如更長突出的髮夾型結構。. 圖四十五、(CGG)19 與 (CGG)9AGG(CGG)9 在 150 mM 鉀離子環境下之圓二色性光譜圖。. 47.

(63) 3-5 髮夾型結構鑑定我們利用 (CTG)4T1 、(CTG)4T2 與(CTG)4T3 做為構型鑑定的標準，已知 (CTG)4 可形成對齊髮夾型結構，且 (CTG)4T1 中的 T (Thymine) 並不會參與重複序列形成的髮夾結構的鹼基配對[4]，因此會形成露出一個核苷酸之突出髮夾型結構；(CTG)4T2 包含兩個 T 形成露出兩個核苷酸之突出髮夾型結構；(CTG)4T3 則是形成露出三個核苷酸之突出髮夾型結構，如圖四十六 (A)[4,32,41]。由圖四十六 (B) 中 (CGG)19 的高 EFRET 峰值 (中心在 0.8)，與(CTG)4T1 幾乎重合，推測 (CGG)19 的主要構型為露出一個核苷酸的突出髮夾型結構[27]。由圖四十六 (B) 中 (CGG)9AGG(CGG)9 的低 EFRET 峰值 (中心約為 0.7)，與(CTG)4T3 的最高 EFRET 峰值較為接近，推測 EFRET 約 0.7 的分布是露出一組 CGG 序列的突出髮夾型結構[43]。偶數組重複序列 EFRET 值 (0.84) 相較奇數組重複序列高，故推測其形成對齊髮夾型結構，與 Usdin 團隊研究相符[39]。. 圖四十六、(A) (CTG)4T1 與(CTG)4T3 髮夾型結構示意圖。(B) (CGG)19 與 (CGG)9AGG(CGG)9 和髮夾結構鑑定模型(CTG)4T1、(CTG)4T2 與 (CTG)4T3 所得之 EFRET 直方圖。. 48.

(64) 由於奇數組 CGG 重複序列具有動態構型轉換，因此利用長時間軌跡圖進行結構鑑定，由 HMM 擬合與 TDP 分析 (圖四十四)，可知此序列在 EFRET 等於 0.8 與 0.68 之間進行構型轉換，因此推測奇數組 CGG 重複序列形成的髮夾型結構存在短暫停留的構型，如圖四十七所示。. 圖四十七、奇數組 CGG 重複序列主要構型與短暫停留的構型示意圖。. 而插入一組 AGG 的 CGG 重複序列則形成兩種主要構型，以露出一個核苷酸的突出髮夾型結構以及露出一組 CGG 序列的突出髮夾型結構為主，且構型間具有動態轉換，因此利用長時間軌跡圖進行結構鑑定，由 HMM 擬合與 TDP 分析 (圖四十四)，可知此序列也在 EFRET 等於 0.8 與 0.68 之間進行構型轉換，兩種構型之間比起 CGG 重複序列更加頻繁的轉換，如圖四十八所示。. 圖四十八、插入一組 AGG 的 CGG 重複序列在 150 mM 鉀離子下的長時間軌跡圖與構型轉換示意圖。. 49.

(65) 插入一組 AGG 後的 CGG 重複序列，形成兩種髮夾型結構，在我們的實驗條件下並無觀測到該序列形成 G-四聯體，而 EFRET 狀態之間的轉換也相較於 CGG 重複序列頻率更高。奇數組 CGG 重複序列與插入一組 AGG 後的 CGG 重複序列都具有在露出一個核苷酸與露出一組 CGG 的突出髮夾型結構狀態之間的轉換，與我們之前實驗室所發表的 (CTG)n 滑動現象相似[4]，推測此狀態狀態改變極有可能是重複序列的滑動現象，其構型圖如圖四十九。. 圖四十九、奇數組與偶數組 CGG 重複序列以及插入一組 AGG 的 CGG 重複序列可能的構型示意圖。. 50.

(66) 3-6 插入 2 組 AGG 的 CGG 重複序列 3-6.1 單分子結構鑑定據統計資料顯示，在正常人類的 FMR1 基因 5’UTR 區的 CGG 重複序列中約 65% 含有兩個 AGG 的中斷[42,43]，且 FMR1 基因中每 8 到 11 個 CGG 存在一個 AGG 的中斷[24]，為了模擬較接近人體真實狀況的序列，我們採用 Delaney 團隊所設計的插入兩個 AGG 的 CGG 重複序列[25]，分別是 2 個 AGG 中間間隔序列重複次數為奇數的 (CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)4 以及偶數的 (CGG)4AGG(CGG)10AGG(CGG)4。將兩條實驗序列在鉀離子濃度 150 mM 的實驗條件下進行單分子的測量，如圖五十，發現兩個 AGG 中間間隔 CGG 序列重複次數為 9 次時，以 EFRET 值 0.68 為主要分布，與相同長度的 (CGG)19 及 (CGG)9AGG(CGG)9 相比，整體構型更加傾向於形成 EFRET 值 0.68 的分布。而當中間間隔序列重複次數為 10 次時，則 EFRET 值 0.68 與 EFRET 值 0.8 兩個分布比例相當。. 圖五十、(CGG)19、(CGG)9AGG(CGG)9 、(CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)4 與 (CGG)4AGG(CGG)10AGG(CGG)4 在 150 mM 鉀離子下所得到 EFRET 直方圖。. 51.

(67) 過去 Delaney 團隊的研究，以化學探針分析 (CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)4 的可能構型，指出該序列除了可以形成單莖髮夾型結構，也有可能形成雙莖髮夾型結構[25]。為了證實雙莖髮夾型結構是否為主要構型，將中間間隔九個 CGG 序列的部分延長，若構型中含有雙莖髮夾型結構，中間未配對的部分會隨之延長，應該會出現較低的 EFRET 分布，如圖五十一。. 圖五十一、增長中間序列的插入兩組 AGG 的 CGG 重複序列實驗設計。. 為了增加中間間隔序列的長度，以(CGG)4AGG(CGG)nAGG(CGG)4, n = 9、 10、15、16 在 150 mM 鉀離子的環境下做初步的觀察，結果如圖五十二。EFRET 峰值中心並沒有明顯變化，否定了雙莖髮夾型結構為主要構型的可能性，可能仍是以單莖髮夾型結構為其主要結構。. 52.

(68) 圖五十二、(CGG)4AGG(CGG)nAGG(CGG)4 n = 9、10、15、16 在 150 mM 鉀離子下所得到 EFRET 直方圖。. 53.

(69) 3-6.2 長時間軌跡圖插入兩組 AGG 的 CGG 重複序列，偶數間隔組序列也具有兩種主要構型，記錄長時間軌跡圖，觀察是否有構型之間的動態變化，如圖五十三。在插入兩組 AGG 序列後，無論是奇數間隔組重複序列或是偶數間隔組重複序列，大於 90% 的分子都未觀察到 EFRET 狀態互相轉換，皆是穩定的構型。. 圖五十三、(CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)4 與 (CGG)4AGG(CGG)10AGG(CGG)4 在 150 mM 鉀離子下的長時間軌跡圖。紅線為 Cy5 的螢光放光強度；綠線為 Cy3 的螢光放光強度；與灰線重疊的紅線則為使用 HaMMy 程式進行 Hidden Markov Model 擬合出的結果。. 54.