3-1 單分子實驗鑑定物 (assay) 設計
Delaney 團隊的研究指出重複次數為奇數 CGG 重複序列，形成露出一個核 苷酸的突出髮夾型 (Single-nucleotide overhang hairpin) 結構[25]；Usdin 團隊的 研究則指出重複次數為偶數時，形成對齊髮夾型 (Blunt-end hairpin) 結構[39]，
因此本論文中實驗採用如圖三十七所示的序列設計。
兩種不同的結構因螢光分子對距離不同而造成 EFRET 值不同，利用單分子 螢光共振能量轉移光譜研究其結構與結構動態學 (structural dynamics)。為了瞭解 AGG 對於 CGG 重複序列的影響，將同樣長度重複序列中的 C (Cytosine) 單點 突變成 A (Adenine)，並利用單分子共振能量轉移光譜的量測，研究其對於結構 與結構動態學的影響，以及是否有形成其他結構，如 G-四聯體。
圖 三十七、單分子螢光共振能量轉移實驗樣品設計圖。
3-2 CGG 重複序列 3-2.1 單分子結構鑑定
Gang Wu 團隊的研究指出鉀離子能夠使富含鳥嘌呤的序列形成 G-四聯體 [40]，為了確認 CGG 重複序列是否能夠形成 G-四聯體，我們對重複次數為 9、
10、19、20 次的 CGG 重複序列在 150 mM 鉀離子環境下進行實驗，如圖三十 八所示。發現奇數組重複序列
E
FRET 值的主要分布略低於偶數組重複序列[41]。而奇數組重複序列在 EFRET 值約 0.7 左右有一個比例較小的分布，顯示可能存 在另一種的構型，例如 G-四聯體或更長的突出髮夾型結構。
圖 三十八、CGG 重複序列在 150 mM 鉀離子所得之 EFRET 直方圖。
3-2.2 鹽類對於序列的影響
陽離子對於 G-四聯體的形成極為重要，已知鉀離子有助於形成 G-四聯體，
而鋰離子則被認為不利於形成 G-四聯體[40]。若序列有形成 G-四聯體的傾向，
在此兩種離子的溶液中應該會觀察到明顯不同的分布。
將 (CGG)19 在鋰離子濃度 150 mM 環境下進行實驗，並與相同濃度的鉀離 子環境下的實驗結果做比較，如圖三十九，整體分布峰值中心並沒有因為不同鹽 類而改變，且在
E
FRET 值約 0.7 仍有一個比例較小的分布，故推測 (CGG)19 在 鋰離子及鉀離子應具相似的構型組成。兩個分布說明了有兩種以上的構型，且E
FRET 值在 0.7 附近對應的構型，由於未隨著離子由鉀離子換成鋰離子而消失推 斷應非 G-四聯體。圖 三十九、(CGG)19分別在150 mM 鋰、鉀離子所得之 EFRET 直方圖。
3-2.3 長時間軌跡圖
除了主要分布以外，從直方圖無法看出構型之間是否有變化，必須藉由記錄 即時的長時間軌跡圖來觀察單一分子構型狀態隨時間的變化，在本論文中的實驗 中，我們以30 frame per second (fps) 條件連續記錄約 100 秒，觀察構型之間是否 有動態變化。
在鉀離子濃度 150 mM 環境下對 (CGG)9、(CGG)10、(CGG)19、(CGG)20記 錄長時間軌跡圖，如圖四十。在同一個時間尺度下，奇數組重複序列可觀察到構 型之間的變化，而偶數組重複序列則是存在單一種穩定的構型。
圖 四十、(CGG)9、(CGG)10、(CGG)19 與 (CGG)20 在150 mM 鉀離子下的長時間軌跡圖。紅線 為 Cy5 的螢光放光強度；綠線為 Cy3 的螢光放光強度；灰線為計算出來的 EFRET值；與灰線 重疊的紅線則為使用 HaMMy 程式進行 Hidden Markov Model 擬合出的結果。
3-3 插入 1 組 AGG 的 CGG 重複序列
3-3.1 單分子結構鑑定
Nelson 團隊研究指出，在正常 FMR1 基因中每 8 到 11 個 CGG 重複單元 存在一個 AGG 的中斷[24]。於是以 (CGG)19 做為模板，將 (CGG)19 的第十次 重複單元上的 C 置換成 A 形成 (CGG)9AGG(CGG)9，將其在 150 mM 鉀離子 環境下進行實驗，觀察序列結構是否受到改變，結果如圖四十一。我們可以觀察 到出現兩個主要分布 (EFRET 值約在 0.82 與 0.7)，在原先 CGG 的奇數組重複序 列 EFRET 值約 0.7 就有少量的分布，置換成 AGG 之後，EFRET 在0.7 附近的分 布顯著增加，形成兩種數量相當的主要分布，但分布中各自對應何種構型，仍需 做進一步的探討。
圖 四十一、(CGG)19與(CGG)9AGG(CGG)9在150 mM 鉀離子下所得到 EFRET 直方圖。
3-3.2 鹽類對於序列的影響
鉀離子有助於形成 G-四聯體，而鋰離子則被認為不利於形成 G-四聯體[40]。
若有形成 G-四聯體的傾向，在兩種離子的溶液中應該會觀察到不同的分布。將 (CGG)9AGG(CGG)9 在鋰離子濃度 150 mM 環境下進行實驗，觀察是否因鹽類 的不同而造成構型的改變與數量的變化。從圖四十二中可看出整體依然維持兩個 主要分布，峰值中心也沒有因鹽類的變化而改變，推測(CGG)9AGG(CGG)9 在鋰 離子及鉀離子均形成相似的兩種構型，且未隨著離子由鉀離子換成鋰離子而變化 來推斷兩種主要構型應非 G-四聯體。
圖 四十二、(CGG)9AGG(CGG)9分別在150 mM 鋰、鉀離子溶液中所得之 EFRET 直方圖
3-3.3 長時間軌跡圖
(CGG)9AGG(CGG)9 在150 mM 鉀離子形成兩種主要構型，為了觀察構型間 是否有互相轉換，以長時間軌跡圖記錄，如圖四十三。在插入 AGG 後的 CGG 重複序列明顯比 CGG 重複序列構型轉換次數更多，且頻率更為頻繁。
圖 四十三、(CGG)9AGG(CGG)9 在150 mM 鉀離子下的長時間軌跡圖。紅線為 Cy5 的螢光放 光強度；綠線為 Cy3 的螢光放光強度；灰線為計算出來的 EFRET值；與灰線重疊的紅線則為使 用 HaMMy 程式進行 Hidden Markov Model 擬合出的結果。
為了知道構型間的轉換速率，將長時間軌跡圖進行轉換機率分析後，繪製成 轉換機率密度圖 (transition density plot, TDP)，如圖四十四。圖中分析 (CGG)19
與 (CGG)9AGG(CGG)9，以 (CGG)19 為例，右邊的主峰，起始值為 0.8，終點值 則是 0.68；另一主峰則剛好相反，起始值為 0.68，終點值為 0.8，峰值代表起始 狀態變化到終點狀態發生的事件數，分析結果中，這兩種不同的構型會互相轉換。
(CGG)19 大多處於高 EFRET (~0.8) 狀態，不僅轉換至低 EFRET (~0.68) 狀態 速率 (k = 0.01 s-1 )非常低，且低 EFRET 狀態轉換至高 EFRET 狀態速率 (k = 0.17 s-1 )較高，亦即低 EFRET 狀態僅是短暫停留的狀態。
相反的，(CGG)9AGG(CGG)9 的高 EFRET 狀態轉換至低 EFRET 狀態速率 (k
= 0.04 s-1 )與低 EFRET 狀態轉換至高 EFRET 狀態速率 (k = 0.07 s-1 )較為相近，因 此我們認為加入一個 AGG 促使滑動平衡向低 EFRET 狀態偏移。
圖 四十四、(CGG)19 與 (CGG)9AGG(CGG)9機率轉換密度圖。X 軸為起始的 EFRET 值；Y 軸為變化後的終點 EFRET 值；色溫代表起始狀態變化到終點狀態發生的事件數。
3-4 重複序列的圓二色性光譜
為 了 進 一 步 確 認 構 型 中 是 否 含 有 G- 四 聯 體 ， 將 (CGG)19 與 (CGG)9AGG(CGG)9 在相同條件下進行圓二色性光譜實驗，如圖四十五。我們猜 測在 EFRET 值約 0.7 的構型可能為混合型 G-四聯體 (hybrid G-quadruplex) 或反 平行 G-四聯體 (anti-parallel G-quadruplex) ，若重複序列含上述構型，則它們的 圓二色性光譜預期在 295nm 波長有明顯的正值峰[34]。但我們在兩種序列皆未 觀測到預期的 G-四聯體特徵峰，加上單分子實驗中未隨鋰、鉀離子條件而改變，
因此我們排除此兩種序列形成 G-四聯體的可能性，推測應有其他結構，例如更 長突出的髮夾型結構。
圖 四十五、(CGG)19 與 (CGG)9AGG(CGG)9 在 150 mM 鉀離子環境下之圓二色性光譜圖。
3-5 髮夾型結構鑑定
我們利用 (CTG)4T1、(CTG)4T2 與(CTG)4T3 做為構型鑑定的標準，已知 (CTG)4 可形成對齊髮夾型結構，且 (CTG)4T1 中的 T (Thymine) 並不會參與重 複序列形成的髮夾結構的鹼基配對[4]，因此會形成露出一個核苷酸之突出髮夾 型結構；(CTG)4T2 包含兩個 T 形成露出兩個核苷酸之突出髮夾型結構；(CTG)4T3
則是形成露出三個核苷酸之突出髮夾型結構，如圖四十六 (A)[4,32,41]。由圖四 十六 (B) 中 (CGG)19 的高 EFRET 峰值 (中心在 0.8)，與(CTG)4T1幾乎重合，推 測 (CGG)19 的主要構型為露出一個核苷酸的突出髮夾型結構[27]。由圖四十六 (B) 中 (CGG)9AGG(CGG)9的低 EFRET 峰值 (中心約為 0.7)，與(CTG)4T3 的最 高
E
FRET 峰值較為接近，推測 EFRET 約 0.7 的分布是露出一組 CGG 序列的突 出髮夾型結構[43]。偶數組重複序列 EFRET 值 (0.84) 相較奇數組重複序列高，故 推測其形成對齊髮夾型結構，與 Usdin 團隊研究相符[39]。
圖 四十六、(A) (CTG)4T1 與(CTG)4T3 髮夾型結構示意圖。(B) (CGG)19 與 (CGG)9AGG(CGG)9
和髮夾結構鑑定模型(CTG)4T1、(CTG)4T2 與 (CTG)4T3 所得之 EFRET 直方圖。
由於奇數組CGG 重複序列具有動態構型轉換，因此利用長時間軌跡圖進行 結構鑑定，由 HMM 擬合與 TDP 分析 (圖四十四)，可知此序列在 EFRET 等於 0.8 與 0.68 之間進行構型轉換，因此推測奇數組 CGG 重複序列形成的髮夾型結 構存在短暫停留的構型，如圖四十七所示。
圖 四十七、奇數組 CGG 重複序列主要構型與短暫停留的構型示意圖。
而插入一組 AGG 的 CGG 重複序列則形成兩種主要構型，以露出一個核 苷酸的突出髮夾型結構以及露出一組 CGG 序列的突出髮夾型結構為主，且構 型間具有動態轉換，因此利用長時間軌跡圖進行結構鑑定，由 HMM 擬合與 TDP 分析 (圖四十四)，可知此序列也在 EFRET 等於 0.8 與 0.68 之間進行構型轉換，
兩種構型之間比起 CGG 重複序列更加頻繁的轉換，如圖四十八所示。
圖 四十八、插入一組 AGG 的 CGG 重複序列在 150 mM 鉀離子下的長時間軌跡圖與構型轉 換示意圖。
插入一組 AGG 後的 CGG 重複序列，形成兩種髮夾型結構，在我們的實驗 條件下並無觀測到該序列形成 G-四聯體，而 EFRET 狀態之間的轉換也相較於 CGG 重複序列頻率更高。奇數組 CGG 重複序列與插入一組 AGG 後的 CGG 重複序列都具有在露出一個核苷酸與露出一組 CGG 的突出髮夾型結構狀態之 間的轉換，與我們之前實驗室所發表的 (CTG)n 滑動現象相似[4]，推測此狀態狀 態改變極有可能是重複序列的滑動現象，其構型圖如圖四十九。
圖 四十九、奇數組與偶數組 CGG 重複序列以及插入一組 AGG 的 CGG 重複序列可能的構 型示意圖。
3-6 插入 2 組 AGG 的 CGG 重複序列 3-6.1 單分子結構鑑定
據統計資料顯示，在正常人類的 FMR1 基因 5’UTR 區的 CGG 重複序列 中約 65% 含有兩個 AGG 的中斷[42,43]，且 FMR1 基因中每 8 到 11 個 CGG 存在一個 AGG 的中斷[24]，為了模擬較接近人體真實狀況的序列，我們採用 Delaney 團隊所設計的插入兩個 AGG 的 CGG 重複序列[25]，分別是 2 個 AGG 中間間隔序列重複次數為奇數的 (CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)4 以及偶數的 (CGG)4AGG(CGG)10AGG(CGG)4。
將兩條實驗序列在鉀離子濃度 150 mM 的實驗條件下進行單分子的測量，
如圖五十，發現兩個 AGG 中間間隔 CGG 序列重複次數為 9 次時，以 EFRET
值 0.68 為主要分布，與相同長度的 (CGG)19 及 (CGG)9AGG(CGG)9相比，整體 構型更加傾向於形成
E
FRET 值 0.68 的分布。而當中間間隔序列重複次數為 10 次時，則E
FRET 值 0.68 與 EFRET 值 0.8 兩個分布比例相當。圖 五十、(CGG)19、(CGG)9AGG(CGG)9 、(CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)4 與 (CGG)4AGG(CGG)10AGG(CGG)4 在150 mM 鉀離子下所得到 EFRET 直方圖。
過去Delaney 團隊的研究，以化學探針分析 (CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)4
的可能構型，指出該序列除了可以形成單莖髮夾型結構，也有可能形成雙莖髮夾 型結構[25]。為了證實雙莖髮夾型結構是否為主要構型，將中間間隔九個 CGG 序列的部分延長，若構型中含有雙莖髮夾型結構，中間未配對的部分會隨之延長，
應該會出現較低的 EFRET 分布，如圖五十一。
圖 五十一、增長中間序列的插入兩組 AGG 的 CGG 重複序列實驗設計。
為了增加中間間隔序列的長度，以(CGG)4AGG(CGG)nAGG(CGG)4, n = 9、
10、15、16 在 150 mM 鉀離子的環境下做初步的觀察，結果如圖五十二。EFRET
峰值中心並沒有明顯變化，否定了雙莖髮夾型結構為主要構型的可能性，可能仍
峰值中心並沒有明顯變化，否定了雙莖髮夾型結構為主要構型的可能性，可能仍