2.2.1 大腸桿菌勝任細胞（Competent cell）的製備
首先取Escherichia coli 之單一菌落培養於 5 ml的LB培養液，於 37℃下 震盪培養（160 rpm/min）過夜後，取 2 ml的菌液轉養於 50 ml的LB培養液 中，繼續於 37℃下震盪培養（160 rpm/min），直到OD600nm 介於 0.4 到 0.6 之間。將培養好的菌液轉移至50 ml離心管中，置於冰上 20 分鐘，之後在 4
℃下以3000 rpm離心 10 分鐘後倒去上清液，接著以 25 ml 4℃預冷的 0.1 M CaCl2懸浮菌體，置於冰上 30 分鐘，在 4℃下以 2000 rpm離心 10 分鐘後去 除上清液，以5 ml 4℃預冷的 0.1 M CaCl2懸浮菌體，於4℃靜置 18 小時，
在4℃下以 2000 rpm離心 5 分鐘後去除上清液，以 5 ml預冷的 0.05 M CaCl2
（含15% Glycerol）懸浮菌體。將菌液以每管 100 µl分裝至預冷好的微量離 心管中，迅速儲存於-80℃冰箱備用。
2.2.2 大腸桿菌轉形作用（transformation）
將儲存於-80℃的勝任細胞取出置於冰上解凍後，加入0.1～1 µg的質體 DNA充分混合，置於冰上25分鐘，再置於42℃水浴中進行熱休克（heat shock）1分鐘，之後加入 500 µl 的LB培養液於37℃震盪培養（160 rpm/min）
1小時，取 100 µl 的菌液均勻塗布於含Ampicillin（50 µg/ml）之LB培養基 上，置於37℃恆溫箱中培養12～16小時。
2.2.3 小量質體 DNA 萃取
使用ExcelPureTM Plasmid Miniprep Purification Kit （PREMIER）抽取並 純化E. coli之質體DNA。操作流程如下：先將菌接種於 5 ml 的LB培養液、
37℃培養 12~16 小時，於室溫 2500 rpm離心 12 分鐘以去除上清液，加入 200 µl SolutionⅠBuffer懸浮菌體並移置微量離心管中，取 200µl SolutionⅡ Buffer緩和地混合均勻後，加入 200 µl SolutionⅢBuffer再次緩和地混合均 勻，在室溫下以 13000 rpm離心 5 分鐘離下菌體，取上層液至Mini-MTM Column，在室溫下以 13000 rpm離心 1 分鐘，倒掉收集管內液體，加入 700 µl Washing buffer，在室溫下以 13000 rpm離心 1 分鐘，倒掉收集管內液體，
加入700 µl Washing buffer，在室溫下以 13000 rpm離心 1 分鐘，倒掉收集管 內液體，再以室溫13000 rpm離心 3 分鐘，將Mini-MTM Column移至新微量 離心管，於60℃的烘箱中 5 分鐘把多餘的酒精去除，最後以 30~50 µl二次 無菌水加入Mini-MTM Column中，以室溫 13000 rpm離心 1 分鐘後，將製備 好的質體DNA儲存於-20℃。【附錄一】。
2.2.4 大量質體 DNA 萃取
使 用 PureLinkTM HiPure Plasmid DNA Maxiprep Purification kit
（Invitrogen）抽取並純化E.coli之質體DNA。操作流程大致如下：先將菌接 種於500 ml 的LB培養液、37℃培養至OD600nm 介於 1.0 到 1.5 之間，於室 溫4000 rpm離心 10 分鐘以去除上清液，加入 10 ml Resuspension Buffer懸浮 菌體並移置高速離心管中，加入10 ml Lysis Buffer緩和地混合均勻後，於室 溫下靜置5 分鐘後，加入 10 ml Precipitation Buffer再次緩和地混合均勻，在 室溫下以12000 g離心 10 分鐘離下菌體，取上層液至Equilibrated Column，
在室溫下利用重力讓溶液全部自然流下後，加入60 ml Wash Buffer，利用重 力讓其慢慢自然流下，將Equilibrated Column移至新的離心管，加入 15 ml Elution Buffer，利用重力讓其自然流下後，加入 10.5 ml isopropanol至所得 之elute DNA溶液中並混合均勻，在 4℃下以 15000 g離心 30 分鐘，移除上 清液，加入5 ml 70％ ethanol懸浮pellet，在 4℃下以 14000 rpm離心 5 分鐘，
移除上清液，將離心管的蓋子打開，斜放置於室溫下10 分鐘以去除多餘的 酒精，最後加入 500 µl TE Buffer懸浮pellet，將製備好的質體DNA儲存於 -20℃。【附錄二】。
2.2.5 限制酵素反應
為製備實驗所需的DNA 片段，取適量 DNA（約 0.5～10 µg；視反應需 要）到適量反應體積（20 µl）以限制酵素切割（Sambrook et al, 1989）（酵 素的用量及反應溫度、時間都依照廠商所提供的條件資料進行），反應完 後，利用洋菜膠體電泳分析。所需的DNA 片段在經限制酵素切割後，視需 要以PREMIER 之 Gel Extraction Kit 或 PCR Clean-up Kit 來純化 DNA 並去 除限制酵素及鹽類。
2.2.6 萃取洋菜膠內之 DNA 片段
使用Gel Extraction Kit(PREMIER)萃取出洋菜膠內之DNA片段。操作流
程如下：將切下之洋菜膠(約 50-200 mg)，置於微量離心管內，加入 500 µl Binding Solution，60℃加熱至完全溶解後，將混合液移至Gel-MTM Column，
以室溫 13000 rpm離心 1 分鐘，倒掉收集管內液體，加入 700 µl Washing Buffer，以室溫 13000 rpm離心 1 分鐘，倒掉收集管內液體，再加入 700 µl Washing Buffer，以室溫 13000 rpm離心 1 分鐘，倒掉收集管內液體，再以 室溫13000 rpm離心 3 分鐘，將Gel-MTM Column移至新微量離心管，於 55~60
℃的烘箱中 5 分鐘把多餘的酒精去除，再加入 30 µl二次無菌水於Gel-MTM Column中，以室溫 13000 rpm離心 1 分鐘後，將萃取出之DNA儲存於-20℃。
【附錄三】。
2.2.7 重組 E 蛋白在大腸桿菌之誘導表現
將 建 構 好 的pcDNA3-E14 及 pET-30a(+)-E14 質 體 轉 形 於 大 腸 桿 菌 BL21(DE3) 或 NovaBlue(DE3) ， 隔 天 挑 單 一 菌 落 於 含 有 Ampicillin 或 Kanamycin（50 µg/ml）之LB培養液中於 37℃培養箱震盪培養，隔夜後，取 1/100 之菌液於 5 ml的LB培養液並於 37℃培養箱震盪培養，至OD600nm介於 0.6 到 0.8 之間時，加入 1 mM IPTG誘導基因表現四小時。
2.2.8 大腸桿菌蛋白質之萃取
大腸桿菌經IPTG 誘導表現後，於室溫下以 2500 rpm 離心 12 分鐘後 去除上清液，接著取200 µl 的 1M Tris-HCl（pH8.0）懸浮菌體並移置微量 離心管中，以13000 rpm 離心 3 分鐘後去除上清液，將此菌體之微量離心 管於液態氮及42℃恆溫水槽中來回反覆處理 5~6 次，每次 2 分鐘，以打破 細胞。然後再取200 µl 1M Tris-HCl（pH8.0）懸浮，在 4℃下以 13000 rpm 離心5 分鐘後，取上清液至另一微量離心管中。最後將 pellet 與上清液加入 適量的2X SDS-PAGE loading dye（含 200 mM β-mercaptoethanol 及 8M
Urea）混合均勻，於室溫放置 30 分鐘以上後，即可用於 run gel 或儲存於-20
℃備用。
2.2.9 哺乳動物細胞蛋白質之萃取
將細胞的培養液移除，以 1X PBS 清洗細胞一次後，用細胞刮勺（cell scraper）刮下細胞後，用 1X PBS 沖洗細胞並將細胞懸浮液移至離心管，在 4℃下以 1000 rpm 離心 10 分鐘，去除上清液後，加入 100 ~ 200 µl 含有 1 mM PMSF 之 RIPA buffer（成分見 2.1.7）與細胞混合均勻以溶解細胞，接 著於4℃下以 13000 rpm 離心 5 分鐘後，取上清液至另一微量離心管中。最 後將細胞殘骸與上清液加入適量的2X SDS-PAGE loading dye （含 200 mM β-mercaptoethanol 及 8M Urea）混合均勻，於室溫放置 30 分鐘以上後，即 可用於run gel 或儲存於-20℃備用。
2.2.10 以 SDS-PAGE 分析並以 Coomassie blue staining 及西方轉漬分析 (Western blot analysis)偵測蛋白質表現
2.2.10.1 SDS-PAGE 電泳
首先配製下層 12% resolving gel，室溫靜置 1 小時，膠凝後再配製上層 4% stacking gel，室溫靜置 30 分鐘，待膠體硬化後移至 Mini-Protein 電泳槽
（Bio-Rad），加入SDS-PAGE running buffer，接著將樣品以微量吸管置入膠 體之孔洞中，先以120 伏特 15 分鐘，待樣品均成一直線後，再以 100 伏特 電泳2 小時，直到 protein marker 的 24 kDa 跑到底部位置。
2.2.10.2 Coomassie blue staining
將 SDS-PAGE 膠體直接浸泡於 0.25% Coomassie blue staining solution
（0.25% Coomassive brilliant blue，50% methanol，10% acetic acid）染 1 小 時，再以Destain solution（30% methanol，10% acetic acid）褪染膠體直到 結果顯現後，以清水清洗膠體數次，取玻璃紙濕貼於玻璃上，放上膠體，
蓋上玻璃紙，完全包裹並用夾子固定，待完全乾燥後即可保存。
2.2.10.3 西方轉漬分析(Western blot analysis)
SDS-PAGE膠體電泳完成後，利用TRANS-BLOT○R SD CELL 221BR
（Bio-Rad） 0.09 安培 40 分鐘，使膠體上的protein轉漬至醋酸纖維膜
（nitrocellulose membrane，PROTRAN，Schleicher& Schuell），把膜置入 20~25 ml Blocking buffer（5% skim milk in 1X TBS buffer）於室溫下平面震 盪 1 小時後，再加入稀釋 1/1000 倍的Anti-His 結合HRP之抗體（SC-8036 HRP，Santa Cruz）於 Blocking buffer 中於室溫下平面震盪 1 小時以偵測有 His標誌的蛋白，而Blocking buffer中Anti-His之抗體最終濃度為 0.2µg/ml，
之後再以20 ml之 1X TBST buffer於室溫下平面震盪 5 分鐘 3 次，最後將 700 µl之 ECL substrate (PIERCE)均勻地加到膜上，在暗房內以X光底片進行壓 片，感光適當時間後，取出底片沖洗顯像。首先，用夾子將底片浸入顯影 液（developer）中搖晃約 30 秒後，將底片換到清水中漂洗底片約 30 秒，
接著將底片浸入定影液（fixer）中搖晃約 1 分鐘，最後以大量的流動水清洗 底片，將底片晾乾保存。
2.2.11 細胞培養（cell culture）
BHK-21 cell培養於添加 5％FBS（Fetal Bovine Serum）與0.22％碳酸氫鈉的 MEM（Minimum Essential Medium; Gibco）培養液中。
293T cell培養於添加 10％FBS 與 0.22％碳酸氫鈉的MEM培養液中。
C6/36 cell 培養於添加 10％FBS 與 0.22％碳酸氫鈉的 MEM 培養液中。
以上這些細胞除了C6/36細胞株置於28℃培養箱外，其餘皆置於37℃、5％
CO2及飽和溼度之恆溫培養箱中進行培養。並視該細胞株之生長速度，以不 同稀釋倍數，不同時間間隔做細胞繼代培養。
2.2.12 細胞株轉染（Transfection）
本研究轉染方式採用碳酸鈣（Calcium Phosphate）法作細胞株轉染，將 細胞種於培養皿，使其達到約70％的滿度。以 3.5 cm 培養盤為例，將 4 µg 的質體DNA，加入25 µl 的2 M CaCl2，加滅菌二次水補至總體積250 µl，充 分 混 和 。 接 著 將 此 混 和 溶 液 逐 滴 慢 慢 加 入 裝 有250 µl 2X HeBS
（HEPES-buffered saline: 0.28 M NaCl，0.05 M HEPES，1.5 mM Na2HPO4） 溶液的試管中，在加入過程中，並以pasteur pipet在 2X HeBS 中打氣，最 後vortex 5秒鐘使其充分混合後，於室溫下靜置20分鐘。將上述DNA/磷酸鈣 複合物平均滴入細胞培養盤中，充分混合均勻後，於37℃細胞培養箱中培 養16~18小時後，更換新鮮的培養液，繼續於37℃細胞培養箱中培養，每2~3 天更換一次新鮮的培養液。
2.2.13 細胞株 RNA 萃取（RNA extraction）
以 3.5 cm細胞培養盤為列，吸去細胞培養液，以1 X PBS清洗細胞一次 後，加入1 ml的TRI reagent，以pipette抽吸細胞數次，使細胞和TRI reagent 充分均質化，將溶液轉移至微量離心管內，於室溫下靜置 5 分鐘，然後在 室溫下加入 200 µl chloroform，以手搖方式充份混合均勻，於室溫下靜置15 分鐘後，在 4℃下以 12,000 rpm 離心 15 分鐘後，去除下層液，將上清液 吸取到另一乾淨微量離心管內，加入 600 µl isopropanol 及 40 µl 3 M sodium acetate（pH 5.2），於室溫下靜置 8 分鐘，此目的在於沉澱RNA。
然後於 4 ℃下以 12,000 rpm 離心 8 分鐘，吸去上清液後留下 RNA 沉澱
物，加入 1 ml已於4℃預冷之75%冰乙醇充分懸浮RNA沉澱物後，於 4 ℃ 以 7500 rpm 離心 5 分鐘，用微量吸管吸掉上清液後，將微量離心管的蓋
子打開，斜放置於室溫下10分鐘以去除多餘的酒精，最後加入適量的
DEPC-treated ddH2O 將RNA沉澱物溶解，測定 OD260 及 OD280 吸光值，
確定 RNA 的濃度及純度。剩餘之 RNA 樣本儲存於 -80℃冰箱內保存。
2.2.14 北方轉漬分析(Northern blot analysis) 2.2.14.1 製備 DNA 探針 （DNA probe labeling）
使用 Roche 廠商產品 DIG system（Cat.No.1175033），以 digoxigenin- 11-dUTP（DIG）標記 DNA，取欲標記的 DNA 15 µl（約 10-30 ng）置於微 量離心管中，於 95℃加熱 10 分鐘後迅速置於冰上 5 分鐘，然後加入 2 µl 的 hexanucleotide、2 µl 的 10X dNTP labeling mixture 及 1 µl 的 Klenow enzyme（100 unit/ml），在 37℃水浴槽中反應 20 小時後，最後加入 2 µl 的 0.2 M EDTA 並於 65℃加熱 10 分鐘作終止反應，製備完成之 DNA 探針儲存 於-20℃備用。
2.2.14.2 轉漬 RNA （transfer）
首 先 進 行 1.2 % 洋 菜 膠 配 製 ， 秤 取 0.6 g 的 agarose 於 36 ml 的 DEPC-treated H2O中，微波加熱溶解，待稍微冷卻後加入 5 ml 的 10X MOPS 及9 ml的甲醛（formaldehyde）混合均勻並製成膠體。而RNA樣品進行電泳 前 之 處 理 ： 將 12 µg 的 RNA 、 3.5 µl 的 10X MOPS 、 5 µl 的 37%
formaldehyde、10 µl 的formamide、3 µl 的dye以及 1 µl 的 10 mg/liter ethidium bromide分別加入微量離心管內並充分混合均勻，於 65℃加熱 10
formaldehyde、10 µl 的formamide、3 µl 的dye以及 1 µl 的 10 mg/liter ethidium bromide分別加入微量離心管內並充分混合均勻，於 65℃加熱 10