一、香椿萃取液（TSL-1）之製備
本實驗採用香椿葉萃取液真空冷凍乾燥而得的粉末 TSL-1(保存於 -20 ℃) (Chang et al.,1998)，以二次水將TSL-1 粉末充分溶解，配製成所需 濃度進行實驗。
二、香椿萃取液主要成分 Gallic Acid（GA）之製備
本實驗採用之Gallic Acid（GA）購買自美國 Sigma，以二次水將 GA 粉 末充分溶解，配製成所需濃度進行實驗。
三、細胞培養 1. 試劑
1) .DMEM （1 升）：DMEM high glucose Medium (9.5 g)粉狀培養基，
溶於900 mL 二次水中，另加入 3.75 g NaHCO3，一起混合攪拌均勻，調 整 pH 至 7.2~7.4，定量至 1 升，接著加入 1% 抗生素 Penicillin- Streptommycine (PS)，以 0.22 μΜ 孔徑之濾膜杯(bottle top filter)過濾後，
成為細胞培養液。
2). 0.4% trypan blue：取 0.4 g trypan blue，溶於 100 mL PBS ，以 0.45 μΜ 孔徑之濾膜(filter)過濾後，室溫保存。
3). 1×PBS：8 g NaCl、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4和 2.9 g Na2HPO4.12H2O 混 合攪拌均勻，調整pH 至 7.2~7.4，定量至 1 升，經滅菌後使用。
2. 細胞培養的條件 1). 細胞株來源
本實驗使用的細胞來自於新竹食品工業發展研究所生物資源保存 暨應用中心，為大鼠胚胎主動脈的平滑肌細胞株A7r5。
2). 培養條件
大鼠胚胎主動脈平滑肌細胞(A7r5)培養於含 10 ％胎牛血清( Foetal bovine serum；FBS)的 DMEM 培養液中，培養在 T 75 (flask)，置於 37 ℃、
5 ％ CO2培養箱中培養。
3). 繼代培養(secondary culture)
細胞在 T75 (flask)中培養至全滿時，將培養液去除，用 1×PBS 清洗
細胞的培養液：trypan blue = 1：1)，以血球計數器( hemocytometer ) 在 倒立式光學顯微鏡下計數細胞數，依實驗需要將細胞均勻分至培養盤 (culture plates)中，細胞密度為：2 × 106 Cells /100 mm dish；2× 105 Cells /well in 12well。5). 細胞實驗之條件
將細胞密度為 2 ×106 Cells /100 mm dish 或 2 ×105 Cells/well in 12well 均勻分至培養盤(culture plates)中，靜置於 37℃、5％ CO2培養箱中 12 小時。把原本的培養液去除，用1 × PBS 清洗兩次，加入不含胎牛血清
將T75 (flask)中狀態良好的細胞，以Trypasin-EDTA使其懸浮，移至 50 mL離心管，離心5 分鐘、1200 rpm，再加入含7% DMSO (冷凍保護 劑)、10% FBS的DMEM混合均勻，並使細胞密度在2×106 cells/mL，置1 mL於冷凍小管內。冷凍小管依：4℃ 15 分鐘；- 20℃ 15 分鐘；- 80℃
overnight，的過程冷凍後，放入液態氮中保存。
7). 解凍細胞
從液態氮桶中取出大鼠胚胎主動脈平滑肌細胞(A7r5)後，立刻置於 37 ℃水浴槽中，待其完全溶解，將冷凍小管的液體吸出，加到含有 DMEM (10% FBS )的 T75 ( flask）內混合均勻，置於 37℃、5% CO2的 培養箱中培養，隔天更換培養液，當細胞在T75 (flask)中生長到全滿時 做繼代培養(secondary culture)。
四、細胞存活率(viability)之測定 1.原理
測試細胞存活率的方法很多，其中 trypan blue staining 是一種比較 簡單的方式 (Heneka et al., 1998)，依據細胞膜完整性的原理來測定。活的 細胞，因細胞膜完整時Trypan blue染劑無法進入細胞內，所以在顯微鏡 下細胞呈現亮黃色。而受損或死亡的細胞，因細胞膜通透性改變，細胞 膜會破裂而不完整，trypan blue 此種藍色染劑會滲入細胞中，而在顯微 鏡下細胞則呈現藍色。
以經過Trypan blue染色後：細胞呈藍色為死細胞，而呈現亮黃色的 細胞為活細胞。因此可以在光學顯微鏡下，直接觀察去計算測量細胞的 數目。
2. 方法
將大鼠胚胎主動脈平滑肌細胞(A7r5)（2×105 cells/well）種於 12 well 中，待隔天細胞貼壁後，加入不含胎牛血清(FBS)的 DMEM 培養液置於 37℃、5％ CO2培養箱中 12 小時。加入不同濃度的 TSL-1 及其主要成 分Gallic acid（GA），含 1% FBS 的 DMEM 培養液，培養 12 小時後，
以PBS 沖洗 2 次，加入 0.2 mL 的 Trypsin-EDTA，在 37℃下作用 3 分鐘，
使細胞呈現懸浮的狀況，加入0.8 mL 含 10% FBS 的 DMEM 混和均勻，
取0.1 mL 細胞液和 0.1 mL 0.4% Trypan blue，用血球計數器來計數細胞 數。
五、以倒立式顯微鏡觀察細胞型態(Morphology) 方法
培養細胞2×105 cells/well種於12 well中，隔天細胞貼壁後，加入不 含胎牛血清(FBS)的DMEM培養液置於37℃、5％ CO2培養箱中12小時，
再加入不同濃度的香椿萃取液TSL-1 ( 0、25、50、75、100 μg/mL ) 及其 主要成分Gallic acid（5、10 μg/mL），含1% FBS的DMEM培養液，放置 於37℃培養箱培養12小時後，以倒立式顯微鏡觀察細胞型態。
六、細胞增生(Proliferation)之測定 1.原理
MTT assay 可用來測量細胞的生長率 (Plumb et al., 1989; Huang et al.,
2002)，是利用活細胞將黃色的 tetrazolium salt (MTT) 還原為非水溶性紫
色結晶的 formazan，再以有機溶劑溶解後， 以 ELISA 分析儀測量吸光 值。
本 實 驗 測 試 細 胞 生 長 率 (Proliferation) 所 使 用 的 方 法 為 WST-1
(4-[3-(4-lodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene
disulfonate) test，其原理同 MTT assay，但最大的差異在於 MTT assay 最後形成的是非水溶性 formazan；然而 WST-1 test形成的則是水溶性 formazan (Iwaki et al., 1995)，分析會較便利。
2.方法
培養細胞（5×103 cells/well）種於 96 well，隔天細胞貼壁後，加入不含 胎牛血清(FBS)的 DMEM 培養液置於 37℃、5％ CO2培養箱中12 小時，
再加入LPS 100 ng/mL 含 1% FBS 的 DMEM 培養液反應，放置於 37℃
培養箱分別培養2、4、6、8、10、12 小時，加入 20 μl WST (WST-1/ECS) 混勻後，置於 37°C，5% CO2培養 2 小時。隔 2 小時後加入 1% SDS 終止反應，利用 ELISA 分析測量 O.D. 450 nm、reference wavelength 650 nm 的吸光值。
七、細胞內亞硝酸產量測定法 1.原理
細胞產生的Nitric oxide（NO）會經由代謝形成 Nitrite（NO2-）及nitrate
（NO3-），Griess reagent（含 0.75% sulfanilamide 及 0.075% naphthylene diamine dihydrochloride）可以和 Nitrite 反應，可測 540 nm 吸光值得知 細胞產生Nitrite（NO2-）的量，作為細胞產生 Nitric oxide（NO）量的評 估。
2. 試劑
1).Griess reagent 配置：
A. 0.75% sulfanilamide：取 0.9 g sulfanilamide 用 0.5 N HCl 定量到 30 ml。
B. 0.075% naphthylene diamine dihydrochloride：取 0.09 g naphthylene diamine dihydrochloride，用二次水定量至 30 ml。
C. 0.75% sulfanilamide 與 0.075% naphthylene diamine dihydrochloride 1:1 混和(需避光)。
2). Nitrite(NO2-)標準品配置：
以sodium nitrite（NaNO2）為標準品，等比稀釋做出標準曲線。
3. 方法
使用不含 phenol red 的 medium，將細胞依實驗條件反應後，在避光的 情況下以100 μl Griess reagent 和 100 μl 細胞上清液混和均勻，室溫反應 10 分鐘，加到 96 孔盤中，以不含 phenol red 的 medium 作為 Blank，測 波長540 nm 的吸光值。
八、細胞內活性氧物質(Reactive oxygen species)產量測定法 1.原理
2,7- dichlorofluorescein diacetate(H2DCF-DA)是一種脂溶性染劑，可 以通過細胞膜，進入細胞後會被細胞內的乙醯脂酶(esterases)去乙醯化形 成 非 螢 光 性 還 原 型 的 2’,7’-dichlorofluorescin （ DCFH2 ） ， 接 著 2’,7’-dichlorofluorescin （ DCFH ） 會 被 H2O2 氧 化 成 具 螢 光 性 的 2’,7’-dichlorofluorescein（DCF），當DCF 受到485 nm 波長的光激發後，
會 散 發 出530 nm 波 長 的 螢 光 ， 可 利 用 螢 光 光 譜 儀 （ fluorescence spectrophotometer）偵測到。利用H2DCF-DA的螢光特性對細胞進行染 色，可評估細胞內H2O2的濃度變化，作為ROS產量的測定。
2.方法
將平滑肌細胞(A7r5)（2×105 cells/well）種於 12well 中，隔天細胞貼
壁後，加入不含胎牛血清(FBS)的 DMEM 培養液置於 37℃、5％ CO2 培養箱中 12 小時。加入不同濃度的 TSL-1 及其主要成分 Gallic acid
（GA），含 1% FBS 的 DMEM 培養液，培養 2 小時後，以 PBS 清洗，
加入 LPS 100 ng/mL 作用，用 PBS 清洗後，再加入含有 10 μM DCFH2-DA 的培養液，於 37℃下培養 30 分鐘，以 PBS 洗 3 次去除多 餘染劑後，最後以0.25％ Tritox-100 打破細胞。激發波長設定為 485 ±20 nm，散射波長設定為 530 ± 25 nm，利用螢光光譜分析儀測定吸光值。
九、MMPs 活性分析 1.原理
MMP-2 和 MMP-9 都 是 屬 於 gelatinases ， 所 以 可 以 利 用 Gelatin zymography來分析MMP-2和MMP-9的酵素活性，當細胞上清液中含有 MMP-2 和 MMP-9 時 ， 會 將 膠 體 中 的 gelatin 分 解 ， 而 在 分 子 量 72kD (MMP-2)和92kD (MMP-9)位置呈現透明的條紋。
2.試劑
1). 6× protein dye：1.5M Tris HCl (Ph 6.8)、 30％ SDS、60％ glycerol、
0.3％ bromophenol blue
2). 10× Running buffer：取2.9 g Tris base、144 g Glycine、10 g SDS、以 二次水定量到1000mL
3). 10×Renaturing buffer：25％ TritonX-100 (以二次水配製)
4). 10× Developing buffer：取12.1 g Tris base、60 g HCl、117 g NaCl、7.4 g CaCl2、Brij 0.2％，以二次水定量到1000mL
5). 0.5％Coomassie Blue：0.5％ Coomassie Blue R-250、50％ methanol、
10％ acetic acid
3.方法
1).將平滑肌細胞(A7r5)（3×105 cells/well）種於 12well，隔天細胞貼壁後，
加入不含胎牛血清(FBS)的 DMEM 培養液置於 37℃、5％ CO2培養箱中 12 小時。加入不同濃度的 TSL-1 及其主要成分 Gallic acid（GA），含1%
FBS 的 DMEM 培養液，培養 2 小時後，以 PBS 清洗，加入 LPS 100 ng/mL 作用24 小時，將 cell culture medium 抽起來放進微量離心管中，離心 1500 rpm，10 min，取上清液並保存在-80℃。
2). 取上清液，加入 6× protein dye，充分混合，靜置 10 分鐘。將電泳膠 片置於電泳槽上，並加入Running buffer，以 8％ SDS-PAGE (含 gelatin 1mg/mL)、50 V 進行電泳，將檢體及 5 μL 的蛋白質標記 (protein marker) 注入到各個電泳膠片槽溝中。直到蛋白質標記 (protein marker)：50 kD 移至膠底介面後，停止電泳。以Renaturing buffer ( 2.5% Triton X-100 ) 和 gel 室溫反應 30 分鐘，以去除 SDS，然後到掉 Renaturing buffer 並 且 加 入 Developing buffer 室 溫 下 先 反 應 30 分鐘後，再加入新的 Developing buffer，在 37℃下作用 20 小時以上。以 0.5％ Coomassie Blue 在室溫下，置於shaker 上染色約半小時，將 gel 以二次水浸泡至隔天，
然後再用玻璃紙進行封膠並掃描。
十、tPA 活性分析 1.原理
組織型纖維酶原活化因子( Tissue Plasminogen Activator, tPA )是屬於 Plasminogenases，所以可以利用Plasminogen zymography來分析tPA的酵 素活性，當細胞上清液中含有tPA時，會將膠體中的Plasminogen分解，
在分子量68kD位置呈現透明的條紋。
2.試劑
1). 6× protein dye：1.5M Tris HCl (Ph 6.8)、 30％ SDS、60％ glycerol、
0.3％ bromophenol blue
2). 10× Running buffer：取2.9 g Tris base、144 g Glycine、10 g SDS、以 二次水定量到1000mL
3). 10×Renaturing buffer：25％ TritonX-100 (以二次水配製)
4). 10× Developing buffer：取12.1 g Tris base、60 g HCl、117 g NaCl、7.4 g CaCl2、Brij 0.2％，以二次水定量到1000mL
5). 0.5％Coomassie Blue：0.5％ Coomassie Blue R-250、50％ methanol、
10％ acetic acid 3.方法
1).將平滑肌細胞(A7r5)（3×105 cells/well）種於 12well，隔天細胞貼壁後，
加入不含胎牛血清(FBS)的 DMEM 培養液置於 37℃、5％ CO2培養箱中 12 小時。加入不同濃度的 TSL-1 及其主要成分 Gallic acid（GA），含1%
FBS 的 DMEM 培養液，培養 2 小時後，以 PBS 清洗，加入 LPS 100 ng/mL 作用24 小時，將 cell culture medium 抽起來放進微量離心管中，離心 1500 rpm，10 min，取上清液並保存在-80℃。
2). 取上清液，加入 6× protein dye，充分混合，靜置 10 分鐘。將電泳膠 片 置 於 電 泳 槽 上 ， 並 加 入 Running buffer，以 8％ SDS-PAGE (含 Plasminogen 25~50 μg/mL)、50 V 進行電泳，將檢體及 5 μl 的蛋白質 標記 (protein marker)注入到各個電泳膠片槽溝中。直到蛋白質標記 (protein marker)：37 kD 移至膠底介面後，停止電泳。以 Renaturing buffer ( 2.5% Triton X-100 )和 gel 室溫反應 30 分鐘，以去除 SDS，然後到掉 Renaturing buffer 並且加入 Developing buffer 室溫下先反應 30 分鐘後，
再加入新的 Developing buffer，在 37℃下作用 20 小時以上。以 0.5％
然後 PGE2 -antibody complex 結合到含有二級抗體（goat anti-mouse polyclonal antibody）的 96 孔盤底，培養一段時間後，移除未結合的物 質後，加入 substrate solution 作用，再加入硫酸終止反應，產生深淺不 一的黃色產物，於 450 nm 下測吸光值，用來評估 PGE2酵素的活性。吸 光值越高代表培養液中 PGE2含量越少，並可以利用標準品序列稀釋得 到的標準曲線來換算，細胞培養液中PGE2的含量。
2. 試劑( 市售試劑 prostaglandin E2 Immunoassay kit; R&D System ) 1). Goat anti-mouse Microplate
2). PGE2 conjugate 3). PGE2 Standard
4). Primary Antibody Solution：用於稀釋標準品以及培養液 5). Calibrator Diluent RD5-39
6). Wash Buffer：取 25 ml 的 Wash buffer concentrate 加二次水到 500 ml 7). Color Reagent A and B：使用前以 1：1 方式混合，15 分鐘內用完，需 避光。
3. 方法
1). 加入 150 μl 的 Calibrator Diluent RD5-39 作為 NSB 組，
2). 加入 100 μl 的 Calibrator Diluent RD5-39 作為 zero standard (B0) 3). 加入 100 μl 的 standard、以及 sample
4). 加入 50 μl 的 Primary Antibody Solution， NSB 組除外
5). 再加入 50 μl 的 PGE2 conjugate，室溫反應 2 小時，並置於 500 rpm 的shaker 上
6). 用 wash buffer 清洗 4 次，加入 200 μl substrate solution 避光反應 30 分鐘
7). 加入 50 μl stop solution 8). 測波長 450 nm 之吸光值
9). 以% B/B0對標準品濃度建構標準曲線，並以4-PL 求出樣品中 PGE2 濃度。
十二、西方墨點分析法(Western blotting) 1.原理
細胞中含有許多種類的蛋白質，以 SDS-PAGE 將蛋白依分子量分開 後，想觀察特定蛋白質的含量時，可利用抗體和抗原專一性結合，將特 定的蛋白質找出，分析其含量的相對多寡。先加入能和特定蛋白質結合
細胞中含有許多種類的蛋白質，以 SDS-PAGE 將蛋白依分子量分開 後，想觀察特定蛋白質的含量時，可利用抗體和抗原專一性結合，將特 定的蛋白質找出，分析其含量的相對多寡。先加入能和特定蛋白質結合