所有基質金屬蛋白酶皆有signal peptide、propeptide、catalytic domain 和hemopexin-like domain 的類似結構 (Egeblad and Werb, 2002；圖十一)。當 基質金屬蛋白酶要分泌時，要先切除signal peptide domain才能離開細 胞。propeptide domain中含有一個半胱胺酸 (cystiene)，能與catalytic domain上的鋅結合，使分泌到體內的基質金屬蛋白酶維持在未活化的狀 態。catalytic domain上接的鋅離子是基質金屬蛋白酶功能執行時最重要 的決定因素，同時也是基質金屬蛋白酶作用的位置。MMP-2和MMP-9 的catalytic domain末端有三個fibronectin-type II domain，可協助MMP-2 和MMP-9與膠原蛋白、gelatin之間的作用 (Allan et al., 1995；Steffensen et al.,
1995)。而C端的hemopexin-like domain在膠原蛋白酶中具有分解膠原蛋白
特殊結構的功能 (Bode, 1995)，在MMP-2中，hemopexin-like domain 則與 pro-MMP-2 受活化的機制有關 (Strongin et al.,1995)。
(Egeblad and Werb, 2002) 圖十一 MMPs的結構圖
MMP-2是一種在體內能夠持續性表現的基質金屬蛋白酶，它能夠 分解gelatin和血管基底膜 (vascular basement membrane)，因此它會影響 血管細胞外基質的再塑 (remodeling)，而且MMP-2能調控細胞的增生、
移行以及黏附作用。另外，MMP-2以及和它相關的tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-1、TIMP-2會去影響多種細胞的複製作用 (Bello
et al., 2001)。更有研究指出在人類的主動脈血管中，MMP-2的活性會隨著 年齡的老化而增加 (McNulty et al., 2005)。MMP-9 是一種誘發性的基質金 屬蛋白酶，它能分解laminin 和膠原蛋白type IV 等，MMP-9 的過量表 現，會促使血管的平滑肌細胞移行，進而導致動脈硬化的發生，另外，
在血管受傷之後，MMP-9 會使血管中層的平滑肌細胞移行至內層，並 產生動脈硬化的現象。更有研究指出，LPS 所誘發產生的發炎作用，會 去刺激COX-2 和MMP-9 等蛋白質的表現 (Marcet-Palacios et al., 2003)。因 此gelatinases 對於動脈硬化及心血管疾病的形成，扮演著一個極關鍵的 角色。
有研究已發現在動脈粥狀硬化斑塊中，有三種基質金屬蛋白酶 (Matrix MetalloProteinase, MMP )：MMP-1、MMP-8 以及 MMP-13 的大 量表現(Galis et al., 1994；Sukhova et al., 1999；Herman et al., 2001)。當間質性膠 原蛋白酶破壞膠原後，其他的MMPs 會繼續降解膠原蛋白。從動脈粥狀 硬化斑塊的萃取物中發現，MMP-2 以及 MMP-9 的活性會增加(100)。而 動脈血管本身會產生MMPs 的拮抗劑，間質金屬蛋白酶的抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs)。但在原位性膠原蛋白溶解的研究 發現，在人體動脈粥狀硬化斑塊中，活化型的間質性膠原蛋白酶的表達 會大於TIMPs(Sukhova et al., 1999)。在體外研究也發現，動脈粥狀硬化斑 塊中的發炎相關介質，如 IL-1β、TNF-α，CD40 的配體(CD154)，可以 促進MMP 在單核吞噬細胞、血管內皮細胞及平滑肌細胞中的表現。肥 大細胞(Mast cells)也可能會釋放 MMP 誘導物 TNF-α 和絲胺酸蛋白酶 (serine proteinases)，從而促進 MMP 酶原活化( Saren et al., 1996；Kovanen et al., 1995；圖十二)。
(Libby, 2002) 圖十二 免疫細胞會釋放 TNF-α 等促使 MMP 的活化
在動脈硬化的斑塊中，LPS會活化TNF-α、IL-1β等一些細胞素，來 刺激免疫細胞釋放出更多的發炎前驅物質以及細胞素。有研究報告指 出，在老鼠大腦的星狀細胞和腎膈細胞 (renal mesangial cell)中IL-1β能 夠藉由增加基因的轉錄作用而誘發MMP-9的表現(Eberhardt et al., 2000)，此 外 ，LPS 也 能 夠 刺 激 巨 大 細 胞 (mast cell) 、 巨 噬 細 胞 和 嗜 中 性 球 (neutrophil)產生MMP-9 (Pugin et al., 1999；Tanaka et al., 2001)。nitric oxide (NO) 和cyclic GMP在老鼠的血管平滑肌細胞中，也能使MMP-9表現量增加 (Eberhardt et al., 2002； Marcet-Palacios et al., 2003)。近幾年有學者相繼提出一 些和發炎有關的細胞素，例如：IL-1β和TNF-α等會藉由活化MAPKs的路 徑來促使MMP-9基因大量表現 (Yokoo and Kitamura, 1996)。另一方面，也 有學者指出人類的單核球和巨噬細胞，在受到LPS和Con A等物質刺激之 後，會透過PGE2-cAMP-dependent pathway而產生MMPs (Pentland et al., 1995；Shankavaram et al., 1997)。
表一 MMPs 的種類
(Creemers et al., 2001)
第十節 纖維蛋白溶解系統和動脈硬化的相關性
纖維蛋白溶解系統中含有胞漿素原(又稱為血纖維蛋白溶酶原；
plasminogen)，胞漿素原(plasminogen)可以被存在於組織間液的一種絲胺 酸蛋白酶(serine proteinase)―胞漿素原活化劑(plasminogen activator；簡 稱PA) 轉化成胞漿素(又稱為血纖維蛋白溶酶；plasmin)，以執行裂解纖 維蛋白的任務(Collen & Lijnen 1991)。plasminogen 是由 791 個氨基酸所構 成，分子量約92 KDa 的蛋白質，經由酵素作用切斷 Arg561-VaI562 的 鏈結而形成plasmin (Collen 1999)。Plasmin 由兩段蛋白組成：一段具有五 個相似的kringle domain，這些結構中具有 lysine-binding sites，可藉由這 些位置和纖維蛋白及 2-antiplasmin 作用；另一段則含有 active sites：
His-602、Asp-645 和 Ser-740 (Wimman 1977)，而胞漿素原活化劑 ( PA ) 可 以和這些位置作用，將plasminogen 轉變成 Plasmin；胞漿素原活化劑( PA ) 刺激plasminogen 變成 Plasmin 是引起纖維蛋白溶解作用的重要步驟。
胞漿素原活化劑( PA )，在正常生理功能的維持和病理的發展上都扮 演著相當重要的因素，PA 可將 plasminogen 活化為 Plasmin，plasminogen 在血漿和細胞間液的濃度約1-2 μM，Plasmin 可與纖維蛋白(fibrin)結合 而使血漿凝塊溶解，使血管不致阻塞而造成血栓疾病(Vassalli et al. 1991)。 但是 PA 不僅造成纖維蛋白分解，產生的 Plasmin 會活化膠原水解酶原 (procollagenases)與金屬蛋白酶(MMP)，在發炎的血管發現有許多的 Plasmin，導致組織間的結構改變。由於纖維蛋白溶解系統可調控細胞間 的 蛋 白 質 分 解 ， 進 而 導 致 結 締 組 織 列 解 至 病 灶 區 擴 大 ，PA 刺 激 plasminogen 變成 Plasmin 是引起纖維蛋白溶解作用的重要步驟，大量 PA 和 Plasmin 會參與發炎病灶組織的破壞，因此 PA 在發炎反應中是造成 組織破壞的關鍵角色 (Vassalli 1994)。
胞 漿 素 原 活 化 劑 (plasminogen activator ； PA) 主 要 含 有 ： 尿 型 (urokinase-type；uPA)及組織型(tissue-type plasminogen activator；tPA)二 種。
uPA 是由尿中所分離的，主要來自腎臟，是由某些分泌管腺(例如：
腎小管)內襯的表面細胞所分泌，可能與分解沉積在這些管線中蛋白有關 (Robert et al. 1998)。尿激酶原(prourokinase)是 plasminogen 的第二種活化劑 的前驅物，尿激酶(urokinase)對纖維蛋白並沒有高度的專一性。 凝塊中將 plasminogen 分解行成 Plasmin，Plasmin 再將纖維蛋白分解為 可溶性分解產物而使血漿凝塊分解(Robert et al. 1998)。
簡稱PAI)，主要是抑制 plasminogen activator 的作用。PA/plasmin 系統 中共有四種抑制劑(Andreasen et al. 1990)，而體內最重要的PAI 是 PAI-1 和 PAI-2，前者由血管內皮細胞產生;後者由單核球產生。血漿中的 PAI 大 多為PAI-1(Vassalli 1991)，PAI-1 是 t-PA 最主要的抑制劑，PAI-1 是一種 活化的抗蛋白酶(antiprotease)，但被分泌製造出後立即轉成非活化狀
態，直到遇到磷脂質(phospholipids)
等因子才又再被活化，在血漿和細胞間中 PAI-1 以活化型態穩定存在 (Seiffert et al. 1990)。
許多可溶性的物質都會調控 tPA 和 PAI-1 的產生，例如:thrombin (Dichek & Quertermous,1989)、phorbol myristate actate (PMA)(Levin et al. 1989) 和butyric acid (Kooistra1987)都會引起tPA 的表現；而 thrombin 同時會引 起PAI-l 表現 (Dichek & Quertennous 1989)。
生物體內的調控因子也會對 tPA 和 PAI-1 的表現有影響。在細 胞培養的系統上，IL-1 會引起 tPA 的 mRNA 及蛋白質的表現而抑 制PAI-1 的表現，而 TGF-1β則有相反的作用(Wilson et al. 1997;
Rox et al. 1996)。在人體內，TNF 會先引起 tPA 的產生而後再引起
PAI-1 量的上升;而在細胞培養時，卻引起內皮細胞 PAI-1 量的增加 而抑制的tPA 生成 (Van Hinsbergh et al.1990)。
十一節 研究動機
動脈硬化致病機轉以及病理過程複雜，目前醫學上的方法仍無法 預防及有效治療。動脈硬化的過程中，許多趨化蛋白、細胞激素、生長 因子、細胞表面黏附分子以及MMPs皆會參與平滑肌細胞增生、移行，
其中，環氧化酶(COX-2)、黏附分子的表現在動脈硬化早期扮演了關鍵 性的角色，而且會受到細胞發炎反應所影響，但是其真正的作用機轉仍 有待進一步探討；除此之外，氧化壓力與抗氧化劑的制衡一直是學術界 熱門的方向，根據文獻資料可知香椿各部位均有保健功效，本實驗室已 知具有抗氧化能力的香椿葉水萃物，第一區分（fraction），簡稱為TSL-1，
能減少自由基對內皮損傷之程度，並且具有降血糖、抗氧化以及抗發炎
等，但對於動脈硬化過程中細胞表面黏附分子VCAM-1和參與平滑肌細 胞增生、移行等因子的表現是否也具有良好的抑制效果則未能確定。因 此，本研究以探討香椿葉萃取物(TSL-1) 在大鼠血管平滑肌細胞(A7r5) 受免疫促進劑（LPS）誘導後，是否能保護大鼠血管平滑肌細胞(A7r5) 細胞以及其保護之機制為何？是否能抑制COX-2的表現？是否具有抑 制氧化壓力如活性氧分子(ROS 含括H2O2、NO)之產量？是否透過 MAPKs和COX-2訊息調控COX-2以及細胞表面黏附分子VCAM-1之表 現？進而能用於治療及預防動脈硬化疾病。