香椿( TSL-1 )及其主要成份防止對內毒素誘發大鼠主動脈平滑肌細胞( A7r5 )造成發炎反應及機制之探討; Protective Role of Toona sinesis Roemor Leaf Extract (TSL-1) Against Lipopolysaccharide Effection on Smooth Muscle Cells (A7r5)
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(2) 目錄 誌謝 縮寫表 中文摘要 Abstract 第一章. 緒論 ………………………………………………………1.. 第一節動脈硬化的成因…………………………………………2. 第二節 Lipopolysaccharide 與動脈硬化的關係………………4. 第三節香椿之介紹………………………………………………7. 第四節平滑肌細胞在動脈硬化中扮演之角色……………… 10. 第五節氧化壓力與動脈硬化之相關性 ………………………12. 第六節. Mitogen-Activated protein Kinase( MAPK )與動脈 硬化的相關性 …………………………………………14.. 第七節環氧化酶與動脈硬化的相關性 ………………………15. 第八節. 細胞表面黏附分子與動脈硬化之相關性 ……………17.. 第九節基質金屬蛋白酶和動脈硬化的相關性 ………………19. 第十節. 纖維蛋白溶解系統和動脈硬化的相關性 ……………26.. 第十一節研究動機 ……………………………………………28. 第二章. 實驗設計架構圖…………………………………………30.. 第三章. 實驗器材…………………………………………………32.. 第四章 實驗方法…………………………………………………37. 一、香椿萃取液(TSL-1）之製備 ……………………… 38. . 二、香椿萃取液主要成分 Gallic Acid 之製備 …………38.. 三、細胞培養………………………………………………38.. I.
(3) 四、. 細胞存活率分析 ………………………………………40.. 五、細胞型態之觀察(Morphology) ………………………41. 六、. 細胞增生分析 …………………………………………41.. 七、. 細胞內亞硝酸產量測定法 ……………………………42.. 八、. 細胞內活性氧物質產量測定法 ………………………43.. 九、. MMPs 活性分析 ………………………………………44.. 十、. tPA 活性分析 …………………………………………45.. 十一、. 細胞酵素連結免疫分析法（PGE2）…………………47.. 十二、. 西方墨點分析法 ………………………………………48.. 十三、. 細胞移行試驗 …………………………………………54.. 十四、. 實驗統計 ………………………………………………55.. 第四章 實驗結果與圖表……………………………………………56. 第一節香椿葉萃取液(TSL-1)對 LPS 誘導的平滑肌細胞發炎 反應之影響 ………………………………………………57. 第二節香椿葉萃取液(TSL-1)對 LPS 誘導的平滑肌細胞增生 反應(Proliferation)之影響 ………………………………75. 第三節. MAPKs 和 COX-2 抑制劑對 LPS 誘導平滑肌細胞 之影響 ……………………………………………………95.. 第五章 討論…………………………………………………………116. 第六章. 總結…………………………………………………………122.. 第七章. 參考文獻……………………………………………………126.. II.
(4) 誌謝 首先要謝謝 楊新玲教授、 許游章副教授的細心教導與鼓勵，不論 是研究態度、為人處事等，都令我受益良多，在此致上最誠摯的謝意與 敬意。也要感謝口試委員 呂鋒洲教授、 廖俊旺副教授與 王升陽副教 授提供的寶貴意見，使本研究論文更加完整，在此衷心的致謝。 在實驗的過程中，感謝有美存學姊與雅婷學姊耐心的指導，使我減 少許多實驗中可能錯誤的嘗試，並陪伴我度過許多在實驗室的日子；而 研究所的學弟妹：康妮、依婷與彬鈞，除了給我實驗上的幫助，也使我 發現研究樂趣所在，真的很謝謝你們；另外我也要感謝我的好朋友小 豬、小璞、暴龍和欣欣，你們的關心與問候總是適時的出現幫助我渡過 心情的低潮。同時我還要感謝許許多多曾幫助以及鼓勵過我的人，你們 的支持使我有動力繼續前進。最後我要感謝我的父母、妹妹以及可愛的 兔子小葉，因為你們的關愛與包容，讓我能夠心無旁騖的完成學業。 兩年的研究生活即將劃上句點，感謝一路上有許多師長、朋友、學 長姊、學弟妹、同學以及親友的扶持與鼓勵，讓我能夠順利的完成學業。 謹以本文獻給所有關懷我的師長、親友們，並致上萬分誠摯的謝意。. . 劉依儒謹致 . 中國醫藥大學 營養系碩士班. . III. 中華民國九十七年七月.
(5) 縮寫表 AP-1：activator protein-1 COX-1 : cyclooxygenase-1 COX-2 : cyclooxygenase-2 C. pneumoniae：Chlamydia pneumoniae DCFH2-DA : 2’,7’-dihydrodichlorofluorescein DMSO : dimethylsulfoxide EDTA : ethylenediaminetetraacetic acid ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay ERK1/2 : extracellular signal-regulated kinase FBS : fetal bovine serum GA : gallic acid H2O2 : hydrogen Peroxide HRP : horseradish peroxidase ICAM-1 : intercellular adhesion molecule-1 iNOS : induce nutric oxide synthase IL-1β: interleukin-1β JNK /SAPK : c-Jun NH2-terminal protein kinase / stress activated protein kinase LDL : low density lipoprotein LPS : lipopolysaccharide L-selectin：leukocytes-selectin MAPKs : mitogen-activated protein kinases MMPs : matrix metalloproteinases NF-κB : nuclear factor kappa B NO : nitric oxide. IV.
(6) O2.- : superoxide anion ox LDL : oxidized low density lipoprotein PBS : phosphate buffered saline PBS-T : phosphate buffered saline containing-Tween-20 PDGF : platelet derived growth factor PGE2 : prostaglandin E2 PGH2 : prostaglandin H2 PGI2 : prostacyclin P-selectin：platelets-selectin PECAM-1：platelet-endothelial-cell adhesion molecule-1 ROS : reactive oxygen species SDS : sodium dodecyl sulfate TNF-α: tumor necrosis factor-alpha t-PA : tissue-type Plasminogen activator TSL-1 : Toona sinensis leave-1 TXA2 : thromboxane A2 u-PA : urokinase-type plasminogen activator VCAM-1 : vascular adhesion molecule-1 VEGF : vascular endothelial growth factor VLDL : very low density lipoprotein. V.
(7) 中文摘要 根據文獻資料可知，楝科(Meliaceae)落葉喬木-香椿(Toona sinensis, TS)為具有保健或治療功效之中草藥。動脈硬化被視為一種發炎性疾 病，在動脈硬化發展過程中，氧化物和抗氧化劑扮演重要的角色。血管 平滑肌細胞的移行、增生，對於動脈硬化早期的發生與後期動脈硬化斑 塊的形成非常重要。在本篇論文中，選用香椿萃取出的水溶性抗氧化劑 -香椿葉萃取液(TSL-1)及其主要成分 GA (gallic acid)，作為預先處理的保 護劑，以探討香椿葉萃取液(TSL-1)對免疫系統活化劑－LPS (100 ng/mL) 誘導平滑肌細胞(A7r5)的發炎與增生之表現是否有抑制作用。因此，本 研究的目有二：第一探討香椿葉萃取液(TSL-1)對 LPS (100 ng/mL)誘導 的平滑肌細胞發炎反應是否有抑制作用。研究顯示：單獨加入不同濃度 的 TSL-1 (25、50、75、100 μg /mL) 及其主要成分 Gallic acid (GA) (5 μg/mL)，不會對平滑肌細胞造成毒性，但會抑制 LPS (100 ng/mL)導致的 平滑肌細胞發炎反應；包括，減少 COX-2、VCAM-1、iNOS 蛋白質的 表現以及 PGE2 的合成。 由於平滑肌細胞增生與基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases； MMPs)的大量表現，參與動脈硬化、血管再狹窄的致病過程，而 MMP-2 和 MMP-9 在血管受損傷後，會造成血管內膜增厚，並且參與動脈硬化 疾病的形成。因此，第二探討香椿葉萃取液(TSL-1)對 LPS (100 ng/mL) 誘導的平滑肌細胞增生反應(Proliferation)是否有抑制作用，研究顯示： 以 100 ng/mL LPS 處理平滑肌細胞後，會促使細胞增生、MMPs 和 tPA 活性上升。預先處理的保護劑 TSL-1，會降低 LPS 所誘發平滑肌細胞的 增生率、MMP-2、MMP-9 及 tPA 分泌量，以及 PDGF、VEGF、MMP2、 MMP9 蛋白質的表現，並且抑制平滑肌細胞遷移(Migration)及侵入. VI.
(8) (Invasion)的現象。 LPS 的處理也會增加 Mitogen-activated protein kinases pathways (ERK1/2，JNK and p38)的磷酸化。以 75 μg /mL TSL-1 預先處理平滑肌 細胞 2 小時，則能減少 LPS (100 ng/mL) 誘導的 ERK1/2 與 JNK 的磷酸 化。從以上結果得知，TSL-1 可抑制動脈硬化形成的發炎和增生反應， 顯示有潛力運用於預防動脈硬化的發生。 關鍵字：香椿(Toona sinensis, TS)、動脈硬化(Atherosclerosis)、內毒素 (LPS)、遷移(Migration)、增生(Proliferation)、發炎(Inflammation). VII.
(9) Abstract Atherosclerosis is defined as a process including inflammation and vascular remodeling. Vascular smooth muscle cell proliferation and migration are important process in development of atherosclerotic plaque. In the present study, the effects of a water-soluble antioxidant Toona sinesis Roemor leaf extract (TSL-1), derived from a traditional Chinese herb, on scavenge free radicals and inhibit LDL oxidation. Bacterial endotoxin lipopolysaccharide (LPS) has been associated with pathogenesis of atherosclerosis, the effect of LPS on atherosclerosis is not know with certainty. The aim of this study was to investigate the suppressive effect of Toona sinesis Roemor leaf extract (TSL-1) on LPS (100 ng/mL) -induced inflammation, proliferation, and cell migration in smooth muscle cell (A7r5). In this study LPS activation of smooth muscle cell results in phosphorylation of extracellular-signal-regulated kinase 1/2 (ERK 1/2), TSL-1 treatment suppressed ERK 1/2 and attenuated the increase in prostaglandin E2 (PGE2) production in LPS-treated smooth muscle cell. We sought to determine that LPS upregulates inflammation (nutric oxide, NO; induce nutric oxide synthase, iNOS; cyclooxygenase-2, COX-2; PGE2), proliferation , and cell migration (MMP2; MMP9; Tissue-type Plasminogen activator, tPA) in smooth muscle cell. The results revealed that TSL-1 (25-100 μg/mL) pretreatment inhibits subsequent LPS (100 ng/mL) stimulated smooth muscle cell inflammation, proliferation, and cell migration. TSL-1 significantly attenuated activation of ERK1/2, iNOS, COX-2, VCAM-1, and MMPs.. TSL-1. may. have. anti-inflammation,. anti-poliferation,. and. anti-migration properties on smooth muscle cell. The result may appears to associated with TSL-1 anti-atherosclerotic properties.. VIII.
(10) keywords:. Toona. sinesis. Roemor. leaf. extract. (TSL-1),. atherosclerosis, inflammation, proliferation, migration. IX. LPS,.
(11) 第一章 緒論. 1.
(12) 第一節動脈硬化的成因 由於動脈硬化是許多已開發國家主要的致死因素之ㄧ，也是全球重 要的健康問題(Murray et al., 1997)。近年來動脈硬化的發生有提早與增加的 趨勢，和現代人的生活型態、遺傳、危險因子(例如:壓力大、抽煙、缺 乏運動、糖尿病、肥胖、高血壓、高膽固醇、高脂血症、高半胱胺酸血 症等)皆息息相關(Raines et al.,1996)。動脈硬化的致病過程中，動脈斑塊 (plaque)生成牽涉到許多細胞的參與，而造成血管管壁增厚的現象。其病 理特徵可分為下列幾個階段：(1)、血管內膜增厚(intimal thickening)；(2)、 脂肪條塊(fatty streak)；(3)、中間病灶(intermediatelesions)；(4)、纖維性 斑塊(fibrous plaque)；(5)、複雜性病灶(complicated lesions) (Hegele et al.,1996；圖一)。. 高血脂症會加速膽固醇進入血管中，並且因高血壓影響而惡化；蔬 果攝取不足以及營養不良會使抗氧化能力下降；缺乏運動也會刺激游離 脂肪酸由脂肪組織釋出並進入肝臟，增加極低密度脂蛋白（very low 圖一 動脈硬化的病理 階段. Image from wikipedia 2.
(13) density lipoprotein, VLDL）的合成；抽煙、酗酒會減弱血管內皮細胞的 功能，使自由基增加而促進低密度脂蛋白（low density lipoprotein, LDL） 的氧化。過去的研究認為，高膽固醇血症為動脈粥狀硬化斑塊形成的主 因( Ross et al., 1976)。在近年來的研究發現，動脈粥狀硬化及其併發症， 不是單純由脂質沉積所導致，細菌、病毒的感染與免疫反應，也被認為 是引起動脈硬化的重要危險因子之一(Kuvin et al., 1999)。這些因素會促使 單核球黏附在血管壁上進行一連串的發炎反應。因此，動脈粥狀硬化與 發炎反應之間有著密不可分的相關性(Hansson et al.,2005；Ross et al., 1999； Libby et al., 2002； Libby, 2002；圖二)，所以在心臟血管疾病的領域中，動脈. 硬化被視為是一種慢性發炎的疾病。. (Libby, 2002). 圖二 動脈硬化不單純是脂質堆積的過程. 3.
(14) 第二節. Lipopolysaccharide 與動脈硬化的關係. 脂多醣體 (lipopolysaccharide；LPS)又稱內毒素 (endotoxin) ，1892 年LPS首先由霍亂弧菌中分離出來，其結構含有脂質 (lipid) 與多聚醣 (polysaccharide)，因此稱為lipopolysaccharide。LPS的分子(圖三)包含三個 部分, 分別為lipid A、inner core region、O-specific side chain，脂質與多 聚醣的構造、組成，都會影響LPS在生理上活性(Henderson et al., 1996)。. 圖三 LPS的分子結構. lipid A 在LPS 中是最主要的活化部位，LPS 之所以會造成免疫反 應與毒性作用，皆是由lipid A 所引發的。LPS 主要存在於格蘭氏陰性 菌的細胞壁中，它可以協助細菌避免被宿主的免疫系統發現(Rietschel et al., 1992；Wick et al., 1995)。當格蘭氏陰性菌被宿主的免疫系統分解破壞後，. LPS會從細胞壁中被釋放出來，引起人體的發炎反應和敗血性休克等， 所以LPS 為強力的免疫系統活化者。 動脈硬化為一種慢性發炎的疾病，是一連串單核球的吸附、活化、 浸潤與更多發炎性細胞激素、趨化因子（chemokine）的分泌以及平滑肌 細胞增生(Ross, 1993)的過程。血管壁受到細菌和病毒感染與動脈硬化的發 展息息相關(Kuvin et al., 1999)，早期的研究發現人類動脈硬化的病灶中含. 4.
(15) 有革蘭氏陰性菌的 Chlamydia pneumoniae 與 Helicobacter pylori，因此被 認為是動脈硬化的主要致病原(Mayr et al., 2000；Muhlestein et al., 1998)，在 1999 年有研究指出 C. pneumoniae 的感染會促進 apolipoprotein E 基因 缺陷小鼠動脈硬化的過程(Moazed et al., 1999)，而且 C. pneumoniae 能活化 單核球和血管的組成細胞，其中也包括血管平滑肌細胞(Kalayoglu et al., 1998)。而 LPS 能夠活化轉錄因子 nuclear factor kappa B（NF-κB）造成一. 些抗微生物肽、發炎性細胞激素、趨化因子（chemokine）的合成與釋放 (Kopp et al., 1999; Akira et al., 2001)，而這些物質會參與動脈硬化進展的過. 程，例如增加細胞黏附因子的表現，平滑肌細胞的增生，活化免疫細胞 及 加 速 急 性 發 炎 反 應 的 發 生 。 LPS 能 使 巨 噬 細 胞 產 生 活 性 氧 族 群 （reactive oxygenspecies ；ROS)和一氧化氮（nitric oxide NO)而造成內 毒素性休克(endotoxic shock)（Kim et al., 2004）。此外，LPS 也能活化動 脈硬化斑塊病灶促使腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、介白素-1（IL-1β）的 產生，這些 proinflammatory cytokines 會刺激平滑肌細胞的增生並增加 黏附因子的表現（Beg et al., 1993)。 當血管內皮下空間的低密度脂蛋白（LDL）過量時，LDL 會受到化 學修飾成為氧化低密度脂蛋白（oxLDL）。此外，LPS 也會藉由增加巨 噬細胞 scavenger receptors 的表現，來促使 oxLDL 的攝入形成泡沫細胞 (foam cell) (Huh et al., 1996)。大量的 foam cell 堆積會使細胞激素、生長因 子、前列腺素（prostaglandins；PGs）等的分泌增加。LPS 會和內皮細 胞上的 TLR4 區域結合，而活化 NF- kB 路徑。細菌感染、oxLDL、高 血 脂 症 都 會 增 加 TLR4 mRNA 的 表 現 加 速 脂 質 斑 塊 的 形 成 (Xu et al.,2001)。. LPS 、 TNF-α 、 IL-1β 等 都 會 活 化 巨 噬 細 胞 並 使 環 加 氧 酶 -2. 5.
(16) （(Cyclooxygenase；COX-2）的表現增加，進而產生 proinflammatory eicosanoids，例如：前列腺素 E2（PGE2）。而 PGE2 會促使 IL-16 分泌、 基質金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases；MMPs )的活化，MMPs 的釋 放及活化與細胞的移行有關，所以 COX-2 和 PGE2 的表現會加速 MMPs 的釋放及活化，進而影響細胞的移行。 在動脈硬化的斑塊中，LPS 會活化 TNF-α、IL-1β 等一些細胞素， 來刺激免疫細胞釋放出更多的發炎前驅物質以及細胞激素，免疫細胞活 化的發炎反應會有許多的 ROS、NO、細胞激素以及發炎前驅物質來加 速惡化動脈硬化的形成(Lusis, 2000；圖四)。因此 LPS 所誘導的發炎反應可 能會導致或加速動脈硬化的發展過程。. (Lusis A. J., 2000). 圖四 發炎反應產生的物質會加速動脈硬化斑塊形成. 6.
(17) 第三節香椿之介紹 香 椿 (Toona sinensis Roem. ； Cedrela sinensis A. Juss.) 為 楝 科 (Meliaceae)多年生落葉性喬本植物，英文名為 Chinese mahogany，在形 態上，葉為偶數羽狀複葉，互生，具長柄；對生，卵狀披針形，疏鋸 齒緣，上表面深綠色，下表面淺綠色。花序為聚繖花序，圓錐狀排列， 白色；花萼 5 裂：花瓣 5 裂，長橢圓形，花期 5-6 月(Jennifer et al., 1998)。 果實為蒴果，卵形，熟時褐色。種子橢圓形，有翅，全株具濃烈氣味。 原生於中國東南，西南至華北地區，別名椿、紅椿、椿甜樹等，在 1915 年首次引進台灣。產地為臺灣中低海拔山區及一般庭園栽培。 全植株各部分(種子、根皮、樹皮、葉軸、樹葉)均有保健或治療之 功能。根據文獻記載樹皮、根皮及種子藥效為治神經痛，亦可止血、 散寒、止痛、治胃、十二指腸潰瘍、淋病、月經不調、蛔蟲、抑制傷 寒桿菌、抗阿米巴原蟲、風濕關節痛及抗癌的療效(楊, 1992；程等, 1998)。 香椿的嫩葉呈小鉅齒狀可食，經分析：含有蛋白質、脂肪、胡蘿蔔素 (Carotene)及維生素 B 和 C 等，營養價值高。有文獻指出香椿的主要 成分類黃酮及酚類化合物，具有抗氧化、抗癌的功效(Chin et al., 1995； Edmonds et al., 1998)。. 針對香椿之可食的葉部與可供藥用的皮部進行有效活性成分分 析，發現富含 gallic acid、methyl gallate、ethyl gallate、kaempferol、 quercetin、quercitrin、rutin、catechin 等化合物(Hsieh et al., 1999； Park et al., 1996；Tsai et al., 2001；賈, 2003)。而這些活性成分中的 gallic acid. (3,4,5-trihydroxybenoic acid)及其衍生物已指出具有抗氧化以及抗癌的 功效(Chang et al.,1998；Chang et al., 2002；Cho et al., 2003)。從香椿萃取物分 離出來的 gallic acid 約為產量的 6%，所以本篇論文以 gallic acid ( GA ). 7.
(18) 作為香椿之主要成分。. 圖五、gallic acid的化學結構圖. 近年來香椿之相關研究有 （1）抗發炎反應：以香椿葉 50％ETOH 萃取物，經過一連串的層析管 柱分離純化之步驟，得到九個多酚類成分，包括 ethyl gallate、methyl gallate 、 gallic acid 、 1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D- glucopyranose 、 2,3,4,6-tetra-O- galloyl-D-glucopyranose、gallic acid 4-O-β-D-（6 ’-Ogalloyl ） -glucopyranoside 、 gallic acid 3-O-β-D- （ 6 ’-O- galloyl ） -glucopyranoside 、rutin 及 quercetin，此九個多酚類成分並以 Griess reaction 檢測對 LPS 刺激 RAW 264.7 巨噬細胞釋放 NO 之變化及以 MTT assay 測定細胞毒性來追蹤成分之活性，發現 quercetin 及 2,3,4,6-tetra-Ogalloyl-D-glucopyranose 有不錯的抑制 NO 活性，且造成的細胞毒性很 小，所以香椿能有效抑制 LPS 刺激巨噬細胞釋放 NO，可作為香椿之抗 發炎活性成分的指標(楊, 2003)。 （2）抗氧化功效：香椿萃取液具有良好的抗氧化能力，包括提供還原 力、氫原子的能力、清除超氧陰離子以及螯合亞鐵離子。並具有抑制LDL 氧化修飾的效用、降低MDA生成量、抑制apo B裂解及LDL電位的改變， 同時也保護LDL避免膽固醇氧化裂解(黃, 2005)。. 8.
(19) （3）降血糖功效：以Alloxan 所誘發糖尿病鼠投予椿葉粗萃取粉劑後， 實驗結果顯示不但能降低糖尿病鼠的血糖值、增加葡萄糖的耐受性，亦 無急性及慢性的毒性，而且也不會影響正常老鼠的血糖值(王, 2000)。 （4）促進脂肪細胞代謝：香椿萃取物可以增加脂肪細胞對脂肪代謝(Hsu, 2003)以及葡萄糖的汲取速度(Yang, 2003)。. （5）保肝功效：在四氯化碳誘發大白鼠之急性肝炎時，發現香椿的攝 取能明顯地降低血清中 GOT 及 GPT 值(林, 2004)。 （6）香椿萃取液具有增進人類精液機能活性之效用。高濃度的香椿葉 萃取液，可有效改善氧化壓力所誘導的男性精子功能障礙，對於健康男 性或不孕男性患者都具有提升精子品質的作用(Yang, 2003)。 （7）止痛功效：香椿葉萃取液對化學治療引起周邊神經痛有明顯的止 痛效果，當與止痛藥物嗎啡（morphine）合併使用時具有加成的作用(林, 2004)。. （8）香椿安全性評估：以三月齡雄性 SAMP8 小鼠進行動物實驗顯示每 天固定給予香椿葉萃取物(2g/kg/BW)，連續 12 週並未產生任何毒性(鍾, 2004)。 （9）抗癌功效：目前發現香椿葉具有抑制卵巢癌、肺癌細胞生長的效果，. 而對人類包皮纖維母細胞與人類肺纖維母細胞（MRC-5）方面則不具任 何細胞毒性。但是，對卵巢癌細胞株（SKOV3 及 PA-1）具有毒殺性， 在動物實驗中也顯示，香椿葉萃取成分經腹腔內給予裸鼠，能有效抑制 腫瘤的生長(Hengartner et al., 2000)。在人類肺癌細胞（A549）也有明顯抑 制細胞生長且藉由抑制 A549 細胞 cyclin D1 和 cyclin E 的表現而有效阻 斷 cell cycle 的進行，並活化 caspase-3 且引發 PARP 的崩解而導致而促 進癌細胞凋亡（Apoptosis）之效用(Leonhard et al., 200)。. 9.
(20) 第四節平滑肌細胞在動脈硬化中扮演之角色 平滑肌細胞為構成血管最主要的細胞。許多心血管疾病在初期會有 血管內膜增厚的現象(Aqel et al., 1985)，而平滑肌細胞的增生並且往血管內 膜移行，是造成血管內膜增厚的主要原因(Ross, 1973)。 在動脈粥狀硬化早期會有：發炎相關細胞的聚集和脂質累積(Huh et al., 1996；圖六)，來形成脂肪核心，脂肪條形成後，血管平滑肌細胞會在. 斑痕處增生聚集，並且改變細胞外基質。此時，脂肪條會轉變為動脈粥 狀硬化斑塊，形成複雜性的病灶。當發炎反應及其它危險因子(如：血脂 異常、高血壓等)持續存在，脂肪條會增大、血管受損，並且活化的白血 球會分泌蛋白酶分解細胞外基質，這些改變會使血管基底組成再朔、纖 維帽變薄變脆弱而容易破裂。. (Huh et al ., 1996). 圖六 平滑肌細胞會參與動脈硬化的斑塊形成. 10.
(21) 當損傷產生時，凝血過程中所產生的凝血酶(Thrombin)會刺激平滑肌 細胞增生，而血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF) 會促進平滑肌細胞遷移。巨噬細胞釋放的生長因子可以刺激平滑肌細胞 在動脈內層增生，因而促進病變的發生。 經由一系列的損傷、凝血、再朔等循環，平滑肌細胞的遷移、增生 及細胞外基質的改變，會使纖維帽增厚、變脆弱，向血管內進一步擴張， 因而造成管腔狹窄(圖七)。隨著時間增加(Peter et al., 2002 )，而加速動脈硬 化的發展。. (Hillebrands, 2001). 圖七 平滑肌的增生與遷移會造成管腔狹窄. 11.
(22) 第五節動脈硬化與氧化壓力之相關性 O2.-與H2O2 為細胞內最常見的活性氧族群，其來源主要有：粒線體 透過電子傳遞鏈會產生能量的同時會有產生O2.-；粒線體也會固定的釋 放一些電子至粒線體基質而導致O2.- 的產生(Roth et al., 1997)。而細胞會藉 由調控ROS的產生，來調節細胞分化及增生(Masters et al., 1996)。 H2O2 其屬於非自由基類，但在自由基產生的過程中卻常常伴隨了 H2O2的產生。而H2O2亦會造成細胞的氧化壓力增加，大量表現時會導致 細胞的功能受損，由於H2O2可以自由的通過細胞膜直接和細胞內的蛋白 質及酵素作用而造成細胞的受損(Halliwell et al., 1990)。 ROS 會攻擊細胞膜內的多元不飽和脂肪酸及脂蛋白，使細胞膜功 能受損；破壞蛋白質使離子通道、細胞接受器及氧化磷酸化反應受影 響。因為H2O2能通過細胞膜和體內運轉中的鐵或銅發生Fenton反應，產 生對細胞破壞性極大的氫氧自由基，造成更大的傷害(Mugge et al., 1998)， 因此H2O2 是導致細胞氧化壓力增加的主因之ㄧ。 許多研究均有提到動脈硬化血管中有大量活性氧族群（ROS），及 其衍生出的活性氧化代謝物的表現(Ross et al., 1993)。而這些 ROS 的來源 包括內皮細胞、巨噬細胞、血管平滑肌細胞等，皆為 ROS 的主要來源 (Segal et al.,1993 ;Griendling et al., 1994)，這些內生性的活性氧族群和外在氧. 化壓力（Oxidative Stress） ，逐漸累積就會造成血管細胞及某些組織的受 損，並且調控細胞的發炎、分化與血管的重塑(圖八)。參與催化 ROS 產 生 的 包 括 cyclooxygenase (COX) 、 lipoxygenase 、 NADPH oxidase 、 mitochondria respiration （Babior et al., 1999）。 動脈硬化、高脂血症、高血壓、糖尿病以及心臟衰竭，這些都會經 由氧化壓力影響心血管功能並導致心血管疾病。不論是動脈硬化或是血. 12.
(23) 管再狹窄的過程中，ROS 在血管平滑肌細胞的移行與增生上都扮演著 重要的角色(Ross et al., 1993 ;Sundaresan et al., 1995)。. (Bahorun et al., 2006). 圖八 ROS 在心血管疾病的影響. 13.
(24) 第六節動脈硬化與 Mitogen-Activated protein Kinases (MAPKs) 的 相關性 MAPKs 扮演著重要的角色，在細胞受到刺激或損傷時，它會藉由 訊息傳遞的調控，使細胞存活、增生、分化或是走向死亡(Oleinick et al., 2002) 。 近 年 來 常 被 探 討 的 MAPK family 為 ： (1) extracellular. signal-regulated kinase (ERK1/2) 、 (2) c-Jun N-terminal kinase/stress activated protein kinase (JNK/SAPK)、(3) p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAP kinase)，它們藉由調控訊息傳以及調節轉錄因子與基因 的表現(Kyriakis et al., 2001)，使細胞的存活、生長、分化、增生、移行及 凋亡等。 (1) extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) ERK1/2 目前已知有二種異構體：ERK1 (分子量約為 44 kDa)及 ERK2 (分子量約為 42 kDa)。當細胞受到生長因子、細胞激素或神經傳 導物質等的刺激時都會活化 ERK1/2。有學者認為 ERK1/2 在推動細胞周 期前進、細胞生長和分化上扮演著極重要的角色 (Kumar et al., 1998)。 (2) c-Jun N-terminal kinase/stress activated protein kinase (JNK/SAPK) JNK 是一種 stress activated protein kinase，當細胞受到生長因子、細 胞激素或紫外線照射處理時，會被大量的活化 (Kyriakis & Avruch, 1996)。 JNK 具有三種異構體：JNK1 (分子量約為 46 kDa)、JNK2 (分子量約為 55 kDa)及 JNK3 (分子量約為 57 kDa)，JNK1/2 廣泛地表現在細胞和組織 中，而 JNK3 主要表現在心臟、腦與睪丸。JNK 可被上游的訊息傳遞分 子 Cdc42/Rac 活化，經由一連串分子磷酸化的傳遞，最後 JNK 上的 Tyr 與 Thr 二個胺基磷酸化 (Griendling et al., 2000)。活化後的 JNK 可活化轉錄 因子：AP-1 (activator protein-1)、ATF-2 和 ElK-1，並調節 AP-1 的功能 (Ip. 14.
(25) & Davis, 1998)。. (3) p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAP kinase) p38-MAPK 的分子量約為 38 kDa，具有四種異構體：p38α、p38β、 p38γ 和 p38δ。當 p38 之 kinase subdomain VIII 上的 tyrosine 被磷酸化 時，p38 被活化，並進而活化下游的轉錄因子：ATF-2、ElK-1、Max、 CHOP/GADD153 和 CREB 等，其中 CHOP/GADD153 轉錄因子是 DNA 受損或是細胞生長停滯時所產生的蛋白質，因此 p38 被認為和調控細胞 的周期有關 (Wang & Ron, 1996)。 MAPKs 常作為細胞外訊息進入細胞時的基礎的調節蛋白，在一系 列蛋白質激酶的抑制或活化過程中，調控細胞對刺激的反應。例如：LPS 可藉由調控 MAPKs 的路徑來增加 TNF-α 的活性，進而影響動脈硬化的 過程 (Dobreva et al., 2003)。. 第七節動脈硬化與環氧化酶的相關性 Cyclooxygenase （ COX ） 又 稱 為 prostaglandin endoperoxide H synthase ， 是 參 與 prostanoid 合 成 的 酵 素 , 主 要 是 將 花 生 四 烯 酸 H2；PGH2）(Smith, （Arachidonic acid；AA）催化成前列腺H（prostaglandin 2 1989)。其又可分成二種異構酶: COX-1存在於一般的細胞組織中以穩定. 的量表現，並調節正常生理功能；然而，COX-2 則在受到發炎反應刺 激時，才會在細胞中大量表現, 例如人類內皮細胞、平滑肌細胞、單核 細胞與纖維母細胞在受到生長因子, 腫瘤促進劑, 荷爾蒙, 細菌內毒素 和細胞激素等，刺激後會大量表現COX-2 (Kujubu et al., 1991; Winn et al., 1993)。. LPS 是革籣氏陰性菌細胞壁的成份, 一但進入血液循環系統即可. 15.
(26) 能造成嚴重的發炎反應, 包括體溫上升、血壓下降、多重器官衰竭、敗 血性休克、甚至死亡等(Landry et al., 2001; Parrillo et al., 1993)。其中體溫上升 和局部發炎反應的發生，被認為和COX-2 衍生的prostanoids有密切關係 (Tilley et al., 2001; Smith et al., 2000)。由於動脈硬化是一連串內皮細胞受損、. 單核球浸潤與平滑肌細胞增生的發炎反應過程(Ross, 1993)，而且在臨床上 動脈硬化的進展過程中會有COX-2大量的表現。大量COX-2表現和 prostaglandin的生成有關( Kozak et al., 2002)，prostaglandin可使細胞產生： (1)血栓素A2（thromboxane A2；TXA2）來活化血小板、促使血管收縮， 刺激平滑肌細胞分裂等；而(2) prostacyclin (PGI2)的分泌，則會抑制血小 板活化與促進血管擴張功能。 Thromboxane (TXA2) 主 要 由 血 小 板 和 單 核 球 所 生 成 , 而 prostacyclin (PGI2)則從血管內皮細胞、血管平滑肌細胞產生(Smith et al., 1991)。這些產物在動脈硬化進程中皆會大量表現而影響疾病的. 發展及血栓的形成。 當內皮細胞接觸到細菌內毒素後會促進細胞激素以及次級調節劑 (例如：prostaglandins、NO)的合成(Mitchell et al., 1996; Salvemini et al., 1990)。 Prostaglandins 是COX-2 催化花生四烯酸的代謝物其與NO 對於發炎反 應和血管擴張皆扮演了重要角色,另外LPS 也能透過活化NFκB來增加 COX-2 mRNA 及其蛋白質的產量(Ghosh et al., 1998; Laflamme et al., 1999), 而在先前研究也提出LPS在平滑肌細胞中可透過MAPKs的路徑去刺激 COX-2表現( Luo et al., 2003)。. 16.
(27) 第八節 動脈硬化與細胞表面黏附分子之相關性 黏附分子是位於細胞膜上，調控細胞與細胞之間相互接觸和相互作 用的蛋白質。通常這些分子橫跨細胞膜而連接細胞骨架，使細胞得以利 用這些分子與其它細胞或是細胞外基質進行移動時的牽引。到目前為 止，黏附因子家族主要分為 3 大類： (1). Integrins 主要由醣蛋白組成的兩個次單元，包括α鏈β鏈，可媒介細胞間的黏 附及外圍物質的黏附(Hynes et al., 1992)。 (2). 似免疫球蛋白分子（Immunoglobulin-like molecules） 免疫球蛋白超級家族（Immunoglobulin superfamily）是細胞膜上的 醣蛋白接受器（Glycoprotein receptor） ，由於細胞外的Ig domain 不同， 而有不同的Isoform，其中ICAM-1和VCAM-1主要表現於內皮細胞、平 滑肌細胞和少量的巨噬細胞中。ICAM-1在正常情形下會有少量的表 現，當受到pro-inflammatory cytokines 刺激時，內皮細胞及單核球會大 量表現此黏附因子(Leeuwenberg et al., 1992)，藉由和單核球上之Integrins 結 合，使單核球緊密黏附（Firm adhesion）到內皮細胞。VCAM-1為110KD 穿膜糖蛋白，由6個Ig同源區組成，與ICAM-1有很高的相似性，參與血 球細胞的黏附。 而 血 小 板 內 皮 細 胞 黏 附 分 子 (platelet-endothelial-cell adhesion molecule-1; PECAM-1) 與 血 球 進 入 內 皮 下 空 間 有 關 (Blankenberg, 2003; Springer, 1990; Frenette, 1996; Price, 1999) 。該家族的主要功能是參與不同細. 胞間的識別與黏附，在免疫、發炎有關的細胞黏附中扮演著重要角色。 (3). Selectins 目前已發現的 Selectin 有三個︰L-selectin、P-selectin 和 E-selectin，. 17.
(28) L、P 和 E 分別表 Leukocyte ，Platelet 和 Endothelium , 負責白血球的滾 動與 tathering。 在動脈硬化與發炎反應的過程中，血液中的白血球會與內皮細胞沾 黏進而移行至內皮下空間，過程可分為: 附著與滾動、活化、靜止並加 強黏附、移行至內皮下空間，四個步驟(Springer et al., 1994；Petruzzelli et al., 1999；圖九)。. (Petruzzelli et al., 1999). 圖九 單核球與內皮細胞黏附並進入內皮下空間之過程. 細胞表面黏附因子表現增加在動脈硬化發展過程中是一個重要病 理特徵。除了內皮細胞外, 血管平滑肌細胞也會表現細胞表面黏附因 子，例如: VCAM-1。研究指出這些黏附因子的表現會引發白血球堆積與 單核球的活化，改變血管平滑肌細胞的細胞周期進而影響平滑肌細胞的 增生與分化(Braun et al., 1999) 。 LPS 與proinflammatory cytokines 例如TNF-α、IL-1β、IFN-γ可活化 轉 錄 因 子 nuclear factor-κB(NF- κB) ， 調 控 血 管 平 滑 肌 細 胞 表 現. 18.
(29) proinflammatory gene 如ICAM-1、VCAM-1 (Libby et al., 1993; Bella et al., 1995)。. 由於ICAM-1 可與白血球上的membrane-bound integrin 接受器例 如LFA-1(CD11a/CD18) 、Mac-1(CD11b/CD18)結合, 所以在白血球的移 行以及白血球與內皮細胞的交互作用中，皆扮演了重要角色(Springer et al .,1994)。. VCAM-1 會和淋巴球、單核球上的VLA4 結合,使白血球能黏附在 內皮細胞並進入組織中, 所以VCAM-1 和發炎反應進行時的白血球的 浸潤有關(Cybulsky et al .,1991)。 第九節 動脈硬化和基質金屬蛋白酶的相關性 Gross和Lapiere發現蝌蚪在轉成青蛙的過程中，會利用某種酵素的作 用，將蝌蚪的尾巴被溶解或再吸收。1960年，基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases；MMPs)首先被Gross和Lapiere從蝌蚪的尾巴中分離出 來(Gross & Lapiere, 1962)。 人體中目前有20種以上的基質金屬蛋白酶被發現 (Creemers et al., 2001；表一)，根據結構及受質 (substrate)的不同可區分為：. (1) 膠原蛋白酶 (collagenases) 這類酵素可分解膠原蛋白 type I、II、III、V等，包含collagenase-1 (MMP-1) 、 collagenase-2. (MMP-8) 、 collagenase-3. (MMP-13) 與. collagenase-4 (MMP-18)，具有許多生理功能和病理作用。 (2) 基質溶解素 (stromelysins) 可分解 fibronectin、collagen 和 elastin，包含stromelysin-1 (MMP-3)、 stromelysin-2 (MMP-10) 、 stromelysin-3 (MMP-11) 和 構 造 相 似 之. 19.
(30) matrilysin (MMP-7) 、metalloelastase (MMP-12)。 (3) 明膠分解酶 (gelatinases) 可分解gelatin、elastin和laminin等，包括MMP-2 (gelatinase A；72 kDa) 和 MMP-9 (gelatinase B；92 kDa)，因為細胞外基質中gelatin為主要的組成 物質，所以gelatinases對於改變基底膜結構的能力在腫瘤轉移及心血管疾 病中扮演著重要的角色，在探討心血管疾病與腫瘤轉移時此類基質金屬 蛋白酶最常被討論 (Galis & Khatri, 2002)。. (4) 細胞膜類基質金屬蛋白酶 (membrane-type MMPs) 這 一 類 型 的 基 質 金 屬 蛋 白 酶 會 鍵 結 在 細 胞 膜 上 ， 包 含 MT1-MMP (MMP-14)、MT2-MMP (MMP-15)、MT3-MMP (MMP-16)和MT4-MMP (MMP-17)等，能分解膠原蛋白，並且幫助某些MMP的活化，例如： MT1-MMP被發現可活化MMP-2和MMP-13 (Sato et al., 1994；Knauper et al., 1996)。. 這些基質金屬蛋白酶在有鈣和鋅等離子的生理情況下，可分解所有 細胞外的基質(Ellerbroek & Stack, 1999)，不論在正常生理或病理過程中，都 扮演著相當重要的角色。 胚胎發育和組織修復等過程，細胞外基質 (extracellular matrix；ECM) 分解是必要的。在人體中，需要適量的基質金屬蛋白酶來維持正常的生 理功能，但是，當細胞基質金屬蛋白酶的分泌過度時，就會導致疾病的 發生，例如發炎反應、血管新生 (angiogenesis)、心血管疾病、動脈粥狀 硬化的過程 (Galis & Khatri, 2002；圖十)、癌細胞的生長、轉移和入侵等 (Ellerbroek & Stack, 1999)，都和基質金屬蛋白酶 (MMPs) 過度表現有關。. 20.
(31) (Galis and Khatri, 2002). 圖十 MMPs 與動脈硬化的關 所有基質金屬蛋白酶皆有signal peptide、propeptide、catalytic domain 和hemopexin-like domain 的類似結構 (Egeblad and Werb, 2002；圖十一)。當 基質金屬蛋白酶要分泌時，要先切除signal peptide domain才能離開細 胞。propeptide domain中含有一個半胱胺酸 (cystiene)，能與catalytic domain上的鋅結合，使分泌到體內的基質金屬蛋白酶維持在未活化的狀 態。catalytic domain上接的鋅離子是基質金屬蛋白酶功能執行時最重要 的決定因素，同時也是基質金屬蛋白酶作用的位置。MMP-2和MMP-9 的catalytic domain末端有三個fibronectin-type II domain，可協助MMP-2 和MMP-9與膠原蛋白、gelatin之間的作用 (Allan et al., 1995；Steffensen et al., 1995)。而C端的hemopexin-like domain在膠原蛋白酶中具有分解膠原蛋白. 特殊結構的功能 (Bode, 1995)，在MMP-2中，hemopexin-like domain 則與 pro-MMP-2 受活化的機制有關 (Strongin et al.,1995)。. 21.
(32) (Egeblad and Werb, 2002). 圖十一 MMPs的結構圖 MMP-2是一種在體內能夠持續性表現的基質金屬蛋白酶，它能夠 分解gelatin和血管基底膜 (vascular basement membrane)，因此它會影響 血管細胞外基質的再塑 (remodeling)，而且MMP-2能調控細胞的增生、 移行以及黏附作用。另外，MMP-2以及和它相關的tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-1、TIMP-2會去影響多種細胞的複製作用 (Bello. 22.
(33) et al., 2001)。更有研究指出在人類的主動脈血管中，MMP-2的活性會隨著. 年齡的老化而增加 (McNulty et al., 2005)。MMP-9 是一種誘發性的基質金 屬蛋白酶，它能分解laminin 和膠原蛋白type IV 等，MMP-9 的過量表 現，會促使血管的平滑肌細胞移行，進而導致動脈硬化的發生，另外， 在血管受傷之後，MMP-9 會使血管中層的平滑肌細胞移行至內層，並 產生動脈硬化的現象。更有研究指出，LPS 所誘發產生的發炎作用，會 去刺激COX-2 和MMP-9 等蛋白質的表現 (Marcet-Palacios et al., 2003)。因 此gelatinases 對於動脈硬化及心血管疾病的形成，扮演著一個極關鍵的 角色。 有研究已發現在動脈粥狀硬化斑塊中，有三種基質金屬蛋白酶 (Matrix MetalloProteinase, MMP )：MMP-1、MMP-8 以及 MMP-13 的大 量表現(Galis et al., 1994；Sukhova et al., 1999；Herman et al., 2001)。當間質性膠 原蛋白酶破壞膠原後，其他的 MMPs 會繼續降解膠原蛋白。從動脈粥狀 硬化斑塊的萃取物中發現，MMP-2 以及 MMP-9 的活性會增加(100)。而 動脈血管本身會產生 MMPs 的拮抗劑，間質金屬蛋白酶的抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs)。但在原位性膠原蛋白溶解的研究 發現，在人體動脈粥狀硬化斑塊中，活化型的間質性膠原蛋白酶的表達 會大於 TIMPs(Sukhova et al., 1999)。在體外研究也發現，動脈粥狀硬化斑 塊中的發炎相關介質，如 IL-1β、TNF-α，CD40 的配體(CD154)，可以 促進 MMP 在單核吞噬細胞、血管內皮細胞及平滑肌細胞中的表現。肥 大細胞(Mast cells)也可能會釋放 MMP 誘導物 TNF-α 和絲胺酸蛋白酶 (serine proteinases)，從而促進 MMP 酶原活化( Saren et al., 1996；Kovanen et al., 1995；圖十二)。. 23.
(34) (Libby, 2002). 圖十二 免疫細胞會釋放 TNF-α 等促使 MMP 的活化 在動脈硬化的斑塊中，LPS會活化TNF-α、IL-1β等一些細胞素，來 刺激免疫細胞釋放出更多的發炎前驅物質以及細胞素。有研究報告指 出，在老鼠大腦的星狀細胞和腎膈細胞 (renal mesangial cell)中IL-1β能 夠藉由增加基因的轉錄作用而誘發MMP-9的表現(Eberhardt et al., 2000)，此 外 ， LPS 也 能 夠 刺 激 巨 大 細 胞 (mast cell) 、 巨 噬 細 胞 和 嗜 中 性 球 (neutrophil)產生MMP-9 (Pugin et al., 1999；Tanaka et al., 2001)。nitric oxide (NO) 和cyclic GMP在老鼠的血管平滑肌細胞中，也能使MMP-9表現量增加 (Eberhardt et al., 2002； Marcet-Palacios et al., 2003)。近幾年有學者相繼提出一. 些和發炎有關的細胞素，例如：IL-1β和TNF-α等會藉由活化MAPKs的路 徑來促使MMP-9基因大量表現 (Yokoo and Kitamura, 1996)。另一方面，也 有學者指出人類的單核球和巨噬細胞，在受到LPS和Con A等物質刺激之 後，會透過PGE2-cAMP-dependent pathway而產生MMPs (Pentland et al., 1995；Shankavaram et al., 1997)。. 24.
(35) 表一 MMPs 的種類. (Creemers et al., 2001). 25.
(36) 第十節. 纖維蛋白溶解系統和動脈硬化的相關性. 纖維蛋白溶解系統中含有胞漿素原(又稱為血纖維蛋白溶酶原； plasminogen)，胞漿素原(plasminogen)可以被存在於組織間液的一種絲胺 酸蛋白酶(serine proteinase)―胞漿素原活化劑(plasminogen activator；簡 稱 PA) 轉化成胞漿素(又稱為血纖維蛋白溶酶；plasmin)，以執行裂解纖 維蛋白的任務(Collen & Lijnen 1991)。plasminogen 是由 791 個氨基酸所構 成，分子量約 92 KDa 的蛋白質，經由酵素作用切斷 Arg561-VaI562 的 鏈結而形成 plasmin (Collen 1999)。Plasmin 由兩段蛋白組成：一段具有五 個相似的 kringle domain，這些結構中具有 lysine-binding sites，可藉由這 些位置和纖維蛋白及 2-antiplasmin 作用；另一段則含有 active sites： His-602、Asp-645 和 Ser-740 (Wimman 1977)，而胞漿素原活化劑 ( PA ) 可 以和這些位置作用，將 plasminogen 轉變成 Plasmin；胞漿素原活化劑( PA ) 刺激 plasminogen 變成 Plasmin 是引起纖維蛋白溶解作用的重要步驟。 胞漿素原活化劑( PA )，在正常生理功能的維持和病理的發展上都扮 演著相當重要的因素，PA 可將 plasminogen 活化為 Plasmin，plasminogen 在血漿和細胞間液的濃度約 1-2 μM，Plasmin 可與纖維蛋白(fibrin)結合 而使血漿凝塊溶解，使血管不致阻塞而造成血栓疾病(Vassalli et al. 1991)。 但是 PA 不僅造成纖維蛋白分解，產生的 Plasmin 會活化膠原水解酶原 (procollagenases)與金屬蛋白酶(MMP)，在發炎的血管發現有許多的 Plasmin，導致組織間的結構改變。由於纖維蛋白溶解系統可調控細胞間 的 蛋 白 質 分 解 ， 進 而 導 致 結 締 組 織 列 解 至 病 灶 區 擴 大 ， PA 刺 激 plasminogen 變成 Plasmin 是引起纖維蛋白溶解作用的重要步驟，大量 PA 和 Plasmin 會參與發炎病灶組織的破壞，因此 PA 在發炎反應中是造成 組織破壞的關鍵角色 (Vassalli 1994)。. 26.
(37) 胞 漿 素 原 活 化 劑 (plasminogen activator ； PA) 主 要 含 有 ： 尿 型 (urokinase-type；uPA)及組織型(tissue-type plasminogen activator；tPA)二 種。 uPA 是由尿中所分離的，主要來自腎臟，是由某些分泌管腺(例如： 腎小管)內襯的表面細胞所分泌，可能與分解沉積在這些管線中蛋白有關 (Robert et al. 1998)。尿激酶原(prourokinase)是 plasminogen 的第二種活化劑. 的前驅物，尿激酶(urokinase)對纖維蛋白並沒有高度的專一性。 tPA 是生理情況下最重要也最主要的 PA。tPA 是一種絲胺酸蛋白 酶，分子量約為 68 KDa，由 530 個氨基酸組成，基因位在人類第八條 染色體上。幾乎所有組織均有 tPA，腺體含量較多，內皮細胞是主要生 產者。當受傷或承受壓力時會由血管內皮細胞釋放至循環系統中，只有 在和纖維蛋白結合 tPA 才具有活性。在與纖維蛋白結合時，tPA 在血漿 凝塊中將 plasminogen 分解行成 Plasmin，Plasmin 再將纖維蛋白分解為 可溶性分解產物而使血漿凝塊分解(Robert et al. 1998)。 tPA 目前用於治療冠狀動脈阻塞的心臟病患者，患者服用 t-PA 後造成血液中胞漿素濃度升高，血液中大量的胞漿素消化血液中 的纖維蛋白，避免血栓產生，以減少血管阻塞風險 (Eric 1998)。 胞漿素原活化抑制劑 (plasminogen activator inhibitor)抑制纖維蛋白 溶解作用的因子有胞漿素原活化抑制劑(plasminogen activator inhibitor； 簡稱 PAI)，主要是抑制 plasminogen activator 的作用。PA/plasmin 系統 中共有四種抑制劑(Andreasen et al. 1990)，而體內最重要的 PAI 是 PAI-1 和 PAI-2，前者由血管內皮細胞產生;後者由單核球產生。血漿中的 PAI 大 多為 PAI-1(Vassalli 1991)，PAI-1 是 t-PA 最主要的抑制劑，PAI-1 是一種 活化的抗蛋白酶(antiprotease)，但被分泌製造出後立即轉成非活化狀. 27.
(38) 態，直到遇到磷脂質(phospholipids) 等因子才又再被活化，在血漿和細胞間中 PAI-1 以活化型態穩定存在 (Seiffert et al. 1990)。. 許多可溶性的物質都會調控 tPA 和 PAI-1 的產生，例如:thrombin (Dichek & Quertermous,1989)、phorbol myristate actate (PMA)(Levin et al. 1989). 和 butyric acid (Kooistra1987)都會引起 tPA 的表現；而 thrombin 同時會引 起 PAI-l 表現 (Dichek & Quertennous 1989)。 生物體內的調控因子也會對 tPA 和 PAI-1 的表現有影響。在細 胞培養的系統上，IL-1 會引起 tPA 的 mRNA 及蛋白質的表現而抑 制 PAI-1 的表現，而 TGF-1β則有相反的作用(Wilson et al. 1997; Rox et al. 1996)。在人體內，TNF 會先引起 tPA 的產生而後再引起. PAI-1 量的上升;而在細胞培養時，卻引起內皮細胞 PAI-1 量的增加 而抑制的 tPA 生成 (Van Hinsbergh et al.1990)。. 十一節 研究動機 動脈硬化致病機轉以及病理過程複雜，目前醫學上的方法仍無法 預防及有效治療。動脈硬化的過程中，許多趨化蛋白、細胞激素、生長 因子、細胞表面黏附分子以及MMPs皆會參與平滑肌細胞增生、移行， 其中，環氧化酶(COX-2)、黏附分子的表現在動脈硬化早期扮演了關鍵 性的角色，而且會受到細胞發炎反應所影響，但是其真正的作用機轉仍 有待進一步探討；除此之外，氧化壓力與抗氧化劑的制衡一直是學術界 熱門的方向，根據文獻資料可知香椿各部位均有保健功效，本實驗室已 知具有抗氧化能力的香椿葉水萃物，第一區分（fraction） ，簡稱為TSL-1， 能減少自由基對內皮損傷之程度，並且具有降血糖、抗氧化以及抗發炎. 28.
(39) 等，但對於動脈硬化過程中細胞表面黏附分子VCAM-1和參與平滑肌細 胞增生、移行等因子的表現是否也具有良好的抑制效果則未能確定。因 此，本研究以探討香椿葉萃取物(TSL-1) 在大鼠血管平滑肌細胞(A7r5) 受免疫促進劑（LPS）誘導後，是否能保護大鼠血管平滑肌細胞(A7r5) 細胞以及其保護之機制為何？是否能抑制COX-2的表現？是否具有抑 制氧化壓力如活性氧分子(ROS 含括H2O2 、NO)之產量？是否透過 MAPKs和COX-2訊息調控COX-2以及細胞表面黏附分子VCAM-1之表 現？進而能用於治療及預防動脈硬化疾病。. 29.
(40) 第二章 實驗設計架構圖. 30.
(41) 實驗設計流程圖 大鼠平滑肌細胞(A7r5). 香椿萃取液(TSL-1)及其主要成分(GA). 活化物 免疫活化物(LPS). Oxidative stress. Proliferation. MAPK inhibtor. and. and. and. Inflammation. Migration. COX-2 inhibtor. ROS assay NO assay iNOS COX-1 COX-2 PGE2 VCAM-1. Cell proliferation MMP2 and MMP9 tPA PDGF VEGF Transwell assay. 31. MAPK COX-1 COX-2 VCAM MMPs Transwell assay.
(42) 第三章 實驗器材. 32.
(43) 一、. 實驗材料. 1.購自美國 Sigma Sodium chloride (NaCl )、Potassium Chloride (KCl)、Triton-X 100、Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 、 Sodium phosphate(NaHPO4) 、 Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)、Tris-base、Ethylenediamide-tetraacetic acid (EDTA)、sodium pyruvate、β-actin mouse monoclonal antibody、bovine serum albumin (BSA)、Trypan blue 2.購自德國 GIBCO Penicillin- Streptommycine (PS) 3.購自 HyClone DMEM high glucose Medium、Trypsin-EDTA 4.購自德國 BIO-RAD Protein assay dye reagent、30% Acrylamide、Ammonium persulfate、 N,N,N,N-Tetramethyl ethylenediamide (TEMED)、Glycine、Sodium dodecyl sulfate (SDS)、Tris-HCl、Recombinant protein molecular weight marker 5.購自 Santa Cruz COX-2 goat polyclonal antibody、VCAM-1 goat polyclonal antibody、iNOS rabbit polyclonal antibody、MMP-9 goat polyclonal antibody、MMP-2 goat polyclonal antibody、PDGF-A rabbit polyclonal antibody、VEGF mouse polyclonal antibody 、 ERK rabbit polyclonal antibody 、 p-ERK mouse polyclonal antibody、goat anti-mouse IgG、goat anti-rabbit IgG、rabbit antigoat IgG 6.購自 Cell Signaling, USA 公司 JNK rabbit polyclonal antibody、pJNK rabbit polyclonal antibody、p38. 33.
(44) rabbit polyclonal antibody、p-p38 rabbit polyclonal antibody 7.購自 Cayman chemical COX-1 rabbit polyclonal antibody 8.購自 Amersham Biosciences Hybond-P PVDF Membrane、Amersham. TM. Western Blotting Detection. Reagents (ECL) 9.購自 R&D System Prostaglandin E2 Immunoassay 10.購自 Corning 25,75 cm Flask、6,12,24 Well、10 mm Dish 11. 購自 Merck Methanol 12.購自安佳 Non-fat Milk 13.購自購自 BioChemike： 2,7- dichlorofluorescein diacetate(H2DCF-DA) 14.購自 BIOLOGICAL INDUSTRIES 胎牛血清 （Foetal bovine serum﹐FBS） 15.購自 BD BioCoat BD MatrigelTM Invasion Chamber 24-Well Plate 8.0 Micron 16. 購自 BioVision Quick Cell Proliferation Assay Kit. 34.
(45) 二、儀器 1.天秤：Scaltec SBC31 2.直立式電泳槽：Hoefer 3.電泳轉印槽：BIO-RAD 4.電源供應器：BIO-RAD computer power supply Model 3000 Xi 5.加熱攪拌器：Barustead thermolyne SP18425 6.離心機：Sigma 1K15 7.高速離心機：KUBOTA 2010 8.冷凍離心機：Eppendrof Certrifuge 5810R 9.pH meter：Denver Basic 10.細胞培養箱：NUAIRETM US AUTO flow 11.幫浦：HETO SUE 30Q 12.無菌操作台：NUAIRETM class II TYPE A/B3 13.倒立式顯微鏡：Nikon Diaphot 300 14.超音波震盪器：Bransonic PC 620 15.高壓殺菌釜：TOMIN TM32 16.水平式搖晃器：Oribital shaker OS 701 17.水浴槽：FIRSTERTM SIENTIFIC 18.感光夾：HypercassetteTM rpn111649 19.X 光感光底片：Kodak Scientfic Imaging Film 20.純水製造機：Millipore milli-Q Plus 21.震盪器：KS ORBITAL Shaker 22.分光光度計：Spectrophotometer U-2000 (Hitachi) 23.數位影像分析儀：Alphar Imager 2000. 35.
(46) 24. ELISA Reader：Dynatech MR7000&Dynex MRX 25.螢光/冷光分析儀：FLx800. 36.
(47) 第四章 實驗方法. 37.
(48) 一、香椿萃取液（TSL-1）之製備 本實驗採用香椿葉萃取液真空冷凍乾燥而得的粉末 TSL-1(保存於 -20 ℃) (Chang et al.,1998)，以二次水將 TSL-1 粉末充分溶解，配製成所需 濃度進行實驗。. 二、香椿萃取液主要成分 Gallic Acid（GA）之製備 本實驗採用之 Gallic Acid（GA）購買自美國 Sigma，以二次水將 GA 粉 末充分溶解，配製成所需濃度進行實驗。. 三、細胞培養 1. 試劑 1) .DMEM （1 升）：DMEM high glucose Medium (9.5 g)粉狀培養基， 溶於 900 mL 二次水中，另加入 3.75 g NaHCO3，一起混合攪拌均勻，調 整 pH 至 7.2~7.4，定量至 1 升，接著加入 1% 抗生素 PenicillinStreptommycine (PS)，以 0.22 μΜ 孔徑之濾膜杯(bottle top filter)過濾後， 成為細胞培養液。 2). 0.4% trypan blue：取 0.4 g trypan blue，溶於 100 mL PBS ，以 0.45 μΜ 孔徑之濾膜(filter)過濾後，室溫保存。 3). 1×PBS：8 g NaCl、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4 和 2.9 g Na2HPO4.12H2O 混 合攪拌均勻，調整 pH 至 7.2~7.4，定量至 1 升，經滅菌後使用。 2. 細胞培養的條件 1). 細胞株來源 本實驗使用的細胞來自於新竹食品工業發展研究所生物資源保存 暨應用中心，為大鼠胚胎主動脈的平滑肌細胞株 A7r5。. 38.
(49) 2). 培養條件 大鼠胚胎主動脈平滑肌細胞(A7r5)培養於含 10 ％胎牛血清( Foetal bovine serum；FBS)的 DMEM 培養液中，培養在 T 75 (flask)，置於 37 ℃、 5 ％ CO2 培養箱中培養。 3). 繼代培養(secondary culture) 細胞在 T75 (flask)中培養至全滿時，將培養液去除，用 1×PBS 清洗 兩次後加入 2 ml Trypasin-EDTA，並置於 37 ℃、5 ％ CO2 培養箱中反 應 3 分鐘，加入含 10 ％胎牛血清( Foetal bovine serum；FBS)的 DMEM 培養液，取適量細胞懸浮液繼續培養。 4). 細胞計數(Cell count) 取 100 μl 細胞懸浮液與等量之 0.4 % Trypan blue 溶液混合均勻(含有 細胞的培養液：trypan blue = 1：1)，以血球計數器( hemocytometer ) 在 倒立式光學顯微鏡下計數細胞數，依實驗需要將細胞均勻分至培養盤 (culture plates)中，細胞密度為：2 × 106 Cells /100 mm dish；2× 105 Cells /well in 12well。 5). 細胞實驗之條件 將細胞密度為 2 ×106 Cells /100 mm dish 或 2 ×105 Cells/well in 12well 均勻分至培養盤(culture plates)中，靜置於 37℃、5％ CO2 培養箱中 12 小時。把原本的培養液去除，用 1 × PBS 清洗兩次，加入不含胎牛血清 (FBS)的 DMEM 培養液置於 37℃、5％ CO2 培養箱中 12 小時。 去除原本的培養液，用 1 × PBS 清洗兩次，加入 1％胎牛血清( FBS) 的 DMEM 培養液，再加入不同濃度的 TSL-1 或 GA 反應 2 小時。以 1× PBS 清洗兩次，加入 LPS 100 ng/mL 反應，並觀察對細胞之影響。 6). 冷凍細胞. 39.
(50) 將T75 (flask)中狀態良好的細胞，以Trypasin-EDTA使其懸浮，移至 50 mL離心管，離心5 分鐘、1200 rpm，再加入含7% DMSO (冷凍保護 劑)、10% FBS的DMEM混合均勻，並使細胞密度在2×106 cells/mL，置1 mL於冷凍小管內。冷凍小管依：4℃ 15 分鐘；- 20℃ 15 分鐘；- 80℃ overnight，的過程冷凍後，放入液態氮中保存。 7). 解凍細胞 從液態氮桶中取出大鼠胚胎主動脈平滑肌細胞(A7r5)後，立刻置於 37 ℃水浴槽中，待其完全溶解，將冷凍小管的液體吸出，加到含有 DMEM (10% FBS )的 T75 ( flask）內混合均勻，置於 37℃、5% CO2 的 培養箱中培養，隔天更換培養液，當細胞在 T75 (flask)中生長到全滿時 做繼代培養(secondary culture)。. 四、細胞存活率(viability)之測定 1.原理 測試細胞存活率的方法很多，其中 trypan blue staining 是一種比較 簡單的方式 (Heneka et al., 1998)，依據細胞膜完整性的原理來測定。活的 細胞，因細胞膜完整時Trypan blue染劑無法進入細胞內，所以在顯微鏡 下細胞呈現亮黃色。而受損或死亡的細胞，因細胞膜通透性改變，細胞 膜會破裂而不完整，trypan blue 此種藍色染劑會滲入細胞中，而在顯微 鏡下細胞則呈現藍色。 以經過Trypan blue染色後：細胞呈藍色為死細胞，而呈現亮黃色的 細胞為活細胞。因此可以在光學顯微鏡下，直接觀察去計算測量細胞的 數目。 2. 方法. 40.
(51) 將大鼠胚胎主動脈平滑肌細胞(A7r5)（2×105 cells/well）種於 12 well 中，待隔天細胞貼壁後，加入不含胎牛血清(FBS)的 DMEM 培養液置於 37℃、5％ CO2 培養箱中 12 小時。加入不同濃度的 TSL-1 及其主要成 分 Gallic acid（GA），含 1% FBS 的 DMEM 培養液，培養 12 小時後， 以 PBS 沖洗 2 次，加入 0.2 mL 的 Trypsin-EDTA，在 37℃下作用 3 分鐘， 使細胞呈現懸浮的狀況，加入 0.8 mL 含 10% FBS 的 DMEM 混和均勻， 取 0.1 mL 細胞液和 0.1 mL 0.4% Trypan blue，用血球計數器來計數細胞 數。. 五、以倒立式顯微鏡觀察細胞型態(Morphology) 方法 培養細胞2×105 cells/well種於12 well中，隔天細胞貼壁後，加入不 含胎牛血清(FBS)的DMEM培養液置於37℃、5％ CO2培養箱中12小時， 再加入不同濃度的香椿萃取液TSL-1 ( 0、25、50、75、100 μg/mL ) 及其 主要成分Gallic acid（5、10 μg/mL），含1% FBS的DMEM培養液，放置 於37℃培養箱培養12小時後，以倒立式顯微鏡觀察細胞型態。. 六、細胞增生(Proliferation)之測定 1.原理 MTT assay 可用來測量細胞的生長率 (Plumb et al., 1989; Huang et al., 2002)，是利用活細胞將黃色的 tetrazolium salt (MTT) 還原為非水溶性紫. 色結晶的 formazan，再以有機溶劑溶解後， 以 ELISA 分析儀測量吸光 值。 本 實 驗 測 試 細 胞 生 長 率 (Proliferation) 所 使 用 的 方 法 為 WST-1. 41.
(52) (4-[3-(4-lodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate) test，其原理同 MTT assay，但最大的差異在於 MTT assay 最後形成的是非水溶性 formazan；然而 WST-1 test形成的則是水溶性 formazan (Iwaki et al., 1995)，分析會較便利。 2.方法 培養細胞（5×103 cells/well）種於 96 well，隔天細胞貼壁後，加入不含 胎牛血清(FBS)的 DMEM 培養液置於 37℃、5％ CO2 培養箱中 12 小時， 再加入 LPS 100 ng/mL 含 1% FBS 的 DMEM 培養液反應，放置於 37℃ 培養箱分別培養 2、4、6、8、10、12 小時，加入 20 μl WST (WST-1/ECS) 混勻後，置於 37°C，5% CO2 培養 2 小時。隔 2 小時後加入 1% SDS 終止反應，利用 ELISA 分析測量 O.D. 450 nm、reference wavelength 650 nm 的吸光值。. 七、細胞內亞硝酸產量測定法 1.原理 細胞產生的 Nitric oxide（NO）會經由代謝形成 Nitrite（NO2-）及 nitrate （NO3-），Griess reagent（含 0.75% sulfanilamide 及 0.075% naphthylene diamine dihydrochloride）可以和 Nitrite 反應，可測 540 nm 吸光值得知 細胞產生 Nitrite（NO2-）的量，作為細胞產生 Nitric oxide（NO）量的評 估。 2. 試劑 1).Griess reagent 配置： A. 0.75% sulfanilamide：取 0.9 g sulfanilamide 用 0.5 N HCl 定量到 30 ml。. 42.
(53) B. 0.075% naphthylene diamine dihydrochloride：取 0.09 g naphthylene diamine dihydrochloride，用二次水定量至 30 ml。 C. 0.75% sulfanilamide 與 0.075% naphthylene diamine dihydrochloride 1:1 混和(需避光)。 2). Nitrite(NO2-)標準品配置： 以 sodium nitrite（NaNO2）為標準品，等比稀釋做出標準曲線。 3. 方法 使用不含 phenol red 的 medium，將細胞依實驗條件反應後，在避光的 情況下以 100 μl Griess reagent 和 100 μl 細胞上清液混和均勻，室溫反應 10 分鐘，加到 96 孔盤中，以不含 phenol red 的 medium 作為 Blank，測 波長 540 nm 的吸光值。. 八、細胞內活性氧物質(Reactive oxygen species)產量測定法 1.原理 2,7- dichlorofluorescein diacetate(H2DCF-DA)是一種脂溶性染劑，可 以通過細胞膜，進入細胞後會被細胞內的乙醯脂酶(esterases)去乙醯化形 成 非 螢 光 性 還 原 型 的 2’,7’-dichlorofluorescin （ DCFH2 ） ， 接 著 2’,7’-dichlorofluorescin （ DCFH ） 會 被 H2O2 氧 化 成 具 螢 光 性 的 2’,7’-dichlorofluorescein（DCF），當DCF 受到485 nm 波長的光激發後， 會 散 發 出 530 nm 波 長 的 螢 光 ， 可 利 用 螢 光 光 譜 儀 （ fluorescence spectrophotometer）偵測到。利用H2DCF-DA的螢光特性對細胞進行染 色，可評估細胞內H2O2的濃度變化，作為ROS產量的測定。 2.方法 將平滑肌細胞(A7r5)（2×105 cells/well）種於 12well 中，隔天細胞貼. 43.
(54) 壁後，加入不含胎牛血清(FBS)的 DMEM 培養液置於 37℃、5％ CO2 培養箱中 12 小時。加入不同濃度的 TSL-1 及其主要成分 Gallic acid （GA），含 1% FBS 的 DMEM 培養液，培養 2 小時後，以 PBS 清洗， 加入 LPS 100 ng/mL 作用，用 PBS 清洗後，再加入含有 10 μM DCFH2-DA 的培養液，於 37℃下培養 30 分鐘，以 PBS 洗 3 次去除多 餘染劑後，最後以 0.25％ Tritox-100 打破細胞。激發波長設定為 485 ±20 nm，散射波長設定為 530 ± 25 nm，利用螢光光譜分析儀測定吸光值。. 九、MMPs 活性分析 1.原理 MMP-2 和 MMP-9 都 是 屬 於 gelatinases ， 所 以 可 以 利 用 Gelatin zymography來分析MMP-2和MMP-9的酵素活性，當細胞上清液中含有 MMP-2 和 MMP-9 時 ， 會 將 膠 體 中 的 gelatin 分 解 ， 而 在 分 子 量 72kD (MMP-2)和92kD (MMP-9)位置呈現透明的條紋。 2.試劑 1). 6× protein dye：1.5M Tris HCl (Ph 6.8)、 30％ SDS、60％ glycerol、 0.3％ bromophenol blue 2). 10× Running buffer：取2.9 g Tris base、144 g Glycine、10 g SDS、以 二次水定量到1000mL 3). 10×Renaturing buffer：25％ TritonX-100 (以二次水配製) 4). 10× Developing buffer：取12.1 g Tris base、60 g HCl、117 g NaCl、7.4 g CaCl2、Brij 0.2％，以二次水定量到1000mL 5). 0.5％Coomassie Blue：0.5％ Coomassie Blue R-250、50％ methanol、 10％ acetic acid. 44.
(55) 3.方法 1).將平滑肌細胞(A7r5)（3×105 cells/well）種於 12well，隔天細胞貼壁後， 加入不含胎牛血清(FBS)的 DMEM 培養液置於 37℃、5％ CO2 培養箱中 12 小時。加入不同濃度的 TSL-1 及其主要成分 Gallic acid（GA） ，含 1% FBS 的 DMEM 培養液，培養 2 小時後，以 PBS 清洗，加入 LPS 100 ng/mL 作用 24 小時，將 cell culture medium 抽起來放進微量離心管中，離心 1500 rpm，10 min，取上清液並保存在-80℃。 2). 取上清液，加入 6× protein dye，充分混合，靜置 10 分鐘。將電泳膠 片置於電泳槽上，並加入 Running buffer，以 8％ SDS-PAGE (含 gelatin 1mg/mL)、50 V 進行電泳，將檢體及 5 μL 的蛋白質標記 (protein marker) 注入到各個電泳膠片槽溝中。直到蛋白質標記 (protein marker)：50 kD 移至膠底介面後，停止電泳。以 Renaturing buffer ( 2.5% Triton X-100 ) 和 gel 室溫反應 30 分鐘，以去除 SDS，然後到掉 Renaturing buffer 並 且 加 入 Developing buffer 室 溫 下 先 反 應 30 分 鐘 後 ， 再 加 入 新 的 Developing buffer，在 37℃下作用 20 小時以上。以 0.5％ Coomassie Blue 在室溫下，置於 shaker 上染色約半小時，將 gel 以二次水浸泡至隔天， 然後再用玻璃紙進行封膠並掃描。. 十、tPA 活性分析 1.原理 組織型纖維酶原活化因子( Tissue Plasminogen Activator, tPA )是屬於 Plasminogenases，所以可以利用Plasminogen zymography來分析tPA的酵 素活性，當細胞上清液中含有tPA時，會將膠體中的Plasminogen分解， 在分子量68kD位置呈現透明的條紋。. 45.
(56) 2.試劑 1). 6× protein dye：1.5M Tris HCl (Ph 6.8)、 30％ SDS、60％ glycerol、 0.3％ bromophenol blue 2). 10× Running buffer：取2.9 g Tris base、144 g Glycine、10 g SDS、以 二次水定量到1000mL 3). 10×Renaturing buffer：25％ TritonX-100 (以二次水配製) 4). 10× Developing buffer：取12.1 g Tris base、60 g HCl、117 g NaCl、7.4 g CaCl2、Brij 0.2％，以二次水定量到1000mL 5). 0.5％Coomassie Blue：0.5％ Coomassie Blue R-250、50％ methanol、 10％ acetic acid 3.方法 1).將平滑肌細胞(A7r5)（3×105 cells/well）種於 12well，隔天細胞貼壁後， 加入不含胎牛血清(FBS)的 DMEM 培養液置於 37℃、5％ CO2 培養箱中 12 小時。加入不同濃度的 TSL-1 及其主要成分 Gallic acid（GA） ，含 1% FBS 的 DMEM 培養液，培養 2 小時後，以 PBS 清洗，加入 LPS 100 ng/mL 作用 24 小時，將 cell culture medium 抽起來放進微量離心管中，離心 1500 rpm，10 min，取上清液並保存在-80℃。 2). 取上清液，加入 6× protein dye，充分混合，靜置 10 分鐘。將電泳膠 片 置 於 電 泳 槽 上 ， 並 加 入 Running buffer， 以 8％ SDS-PAGE ( 含 Plasminogen 25~50 μg/mL)、50 V 進行電泳，將檢體及 5 μl 的蛋白質 標記 (protein marker)注入到各個電泳膠片槽溝中。直到蛋白質標記 (protein marker)：37 kD 移至膠底介面後，停止電泳。以 Renaturing buffer ( 2.5% Triton X-100 )和 gel 室溫反應 30 分鐘，以去除 SDS，然後到掉 Renaturing buffer 並且加入 Developing buffer 室溫下先反應 30 分鐘後，. 46.
(57) 再加入新的 Developing buffer，在 37℃下作用 20 小時以上。以 0.5％ Coomassie Blue 在室溫下，置於 shaker 上染色約半小時，將 gel 以二次 水浸泡至隔天，然後再用玻璃紙進行封膠並掃描。. 十一、細胞酵素連結免疫分析法（PGE2） 1. 原理 此市售試劑套組是以競爭性免疫分析方法進行 PGE2 分析。細胞培 養之上清中 PGE2 與 HRP 標示之 PGE2 競爭 mouse monoclonal antibody， 然後 PGE2. -antibody complex 結合到含有二級抗體（goat anti-mouse. polyclonal antibody）的 96 孔盤底，培養一段時間後，移除未結合的物 質後，加入 substrate solution 作用，再加入硫酸終止反應，產生深淺不 一的黃色產物，於 450 nm 下測吸光值，用來評估 PGE2 酵素的活性。吸 光值越高代表培養液中 PGE2 含量越少，並可以利用標準品序列稀釋得 到的標準曲線來換算，細胞培養液中 PGE2 的含量。 2. 試劑( 市售試劑 prostaglandin E2 Immunoassay kit; R&D System ) 1). Goat anti-mouse Microplate 2). PGE2. conjugate. 3). PGE2. Standard. 4). Primary Antibody Solution：用於稀釋標準品以及培養液 5). Calibrator Diluent RD5-39 6). Wash Buffer：取 25 ml 的 Wash buffer concentrate 加二次水到 500 ml 7). Color Reagent A and B：使用前以 1：1 方式混合，15 分鐘內用完，需 避光。 3. 方法 1). 加入 150 μl 的 Calibrator Diluent RD5-39 作為 NSB 組， 47.
(58) 2). 加入 100 μl 的 Calibrator Diluent RD5-39 作為 zero standard (B0) 3). 加入 100 μl 的 standard、以及 sample 4). 加入 50 μl 的 Primary Antibody Solution， NSB 組除外 5). 再加入 50 μl 的 PGE2. conjugate，室溫反應 2 小時，並置於 500 rpm. 的 shaker 上 6). 用 wash buffer 清洗 4 次，加入 200 μl substrate solution 避光反應 30 分鐘 7). 加入 50 μl stop solution 8). 測波長 450 nm 之吸光值 9). 以% B/B0 對標準品濃度建構標準曲線，並以 4-PL 求出樣品中 PGE2 濃度。. 十二、西方墨點分析法(Western blotting) 1.原理 細胞中含有許多種類的蛋白質，以 SDS-PAGE 將蛋白依分子量分開 後，想觀察特定蛋白質的含量時，可利用抗體和抗原專一性結合，將特 定的蛋白質找出，分析其含量的相對多寡。先加入能和特定蛋白質結合 的專一性抗體（一級抗體, Primary antibody） ，充分反應後，再加入能和 一級抗體結合的另一專一性抗體（二級抗體, Secondary antibody） ，兩抗 體結合後，二級抗體上結合的酵素，可以分解特定之基質（Substrate） 而產生冷光，經底片感光後，可用於評估特定蛋白質之表現。 2.試劑 1). Triton lysis Buffer：25 mM Tris-HCl (pH=8) 及 1% Triton X-100 (取. 48.
(59) 0.197 g Tris 到 30 ml 無菌水調整 pH 值至 pH=8.0)，再加入 500μl Trition X-100，用二次水定量至 50 ml。 2). 製備膠體(SDS-PAGE)： A. 1.5 M Tris (pH=8.8)：取 91g Tris base 溶在 300 ml 二次水，以 1N HCl 調至 pH=8.8，用二次水量定量至 500ml 以 0.45μm filter 過濾，4℃儲存 1 個月。 B. 30% Acrylamide/Bis solution (29:1) C. 10% SDS：取 10g SDS，最後用二次水定量到 100 ml。 D. Ammonium persulfate：取 0.1g (NH4)S2O8 溶於 1 ml 二次水。 E. 1 M Tris (pH=6.8)：取 12.1g Tris base 溶在 40 ml 二次水，以 1N HCl 調至 pH=6.8，最後用二次水定量到 100ml，用 0.45μm filter 過濾，4℃ 儲存 1 個月。 3). 3×Protein loading dye ：5 mM Tris-HCl (pH=6.8)、2% SDS 、10% glycerol、0.1% bromopherol blue、100 mM dithreitol。 4). 5×Electrode buffe (pH=8.4)：取 54.5 g Tris base、24.8 g Boric acid、4.7 g EDTA2Na、5g SDS，最後用二次水定量至 1000ml。 5). Transfer buffer (3 升)：取 18.2 g Tris base、86.5 g Glycine、1200 ml methanol 最後用二次水定量至 3 升。 6). 西方點墨法 (Western blotting)： A. 1×PBS：取水 800 ml 二次水，加入 8 g NaCl、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4、 2.9 g Na2HPO4.12H2O，調 pH 7.4，並定量至 1000 ml。 B. Washer buffer (PBST)：500 ml PBS 再加入 500μl Tween-20。 C. Coomassies Brilliant Blue R250 (染色液)：取 1 g Coomassie Brilliant Blue 加入 50 ml acetic acid 及 250 ml methanol 用水定量至 500 ml。. 49.
(60) D. Block buffer：取 5% 脫脂奶粉溶於 waster buffer。 7). 壓片 A. 顯影劑：取 103 ml developer 加入 370 ml 二次水，稀釋成 4.59 倍， 放入避光的瓶子。 B. 定影劑：取 103 ml fixter 加入 370 ml 二次水，稀釋成 4.59 倍，放入 避光的盒子。 C. SuperSignal substrate solution：將 SuperSignal I：SuperSignal II＝1：1 混 合。 3 方法 1). 細胞溶解萃取 (Cell lysis extraction)： 將平滑肌細胞(A7r5) 種 2×106 cells 於 100 mm dish，隔天細胞貼壁後， 加入不含胎牛血清(FBS)的 DMEM 培養液置於 37℃、5％ CO2 培養箱中 12 小時。加入不同濃度的 TSL-1 及其主要成分 Gallic acid（GA） ，含 1% FBS 的 DMEM 培養液，培養 2 小時後，以 PBS 清洗，加入 LPS 100 ng/mL 作用 8、12 小時，以冰的 PBS 清洗並用刮刀將細胞刮下收集於 50 mL 離心管，離心 1500 rpm, 10 分鐘，去上清液。 以 1 mL PBS 混合 pellet， 移入微量離心管(1.5 ml)。再以 1500 rpm 離心 10 分鐘，去除上清液。加 入 250-300 μl lysis buffer 充分混合。置於冰上，以超音波振盪後，離心 12,000 rpm、4℃、30 分鐘。收集上清液即為總蛋白萃取物，定量其蛋白 濃度，保存在-80℃。 2). 蛋白質濃度定量分析 (Protein concentration assay)： 蛋白質濃度定量是採用 Bio-rad 公司 Protein assay-micro assay 做 法。以二次水將牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin，BSA，0.1mg/mL) 分別配製成 0、2、4、6、8、10、20、30 μg /ml 之標準溶液。取 2 μl 待. 50.
(61) 測蛋白質的溶液加入 798 μl 二次水分別加入 200 μl Protein assay dye (BIO-RAD)，振盪均勻後，靜置 5 分鐘。 分別取 200 μl 到 96 well 中測波長 595 nm 的吸光值，標準線方程式 的 R2 需大於 0.998，再將待測蛋白質溶液 OD 值帶入方程式中以求得蛋 白質濃度。 3). 蛋 白 質 膠 體 電 泳 (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE) A. 鑄膠：下膠(Running gel)的配製依蛋白質分子量的大小而決定配製成 8~12 %的 SDS-PAGE，蛋白質分子量越大 SDS-PAGE 比例越小。 B. Running gel (總體積 20 ml)： a. 8 % SDS-PAGE：加 15 ml H2O，5 ml 1.5 M Tris (pH=8.8)，7 ml 30% Acrylamide Mix，0.2 ml 10% SDS，0.2 ml 10% ammonium persulfate 及 0.01 ml TEMED。 b. 10 % SDS-PAGE：加 8 ml H2O，5 ml 1.5M Tris (pH=8.8)，6.6 ml 30% Acrylamide Mix，0.2 ml 10% SDS，0.2 ml 10% ammonium persulfate 及 0.01 ml TEMED。 c. 12 % SDS-PAGE：加 6.6 ml H2O，5 ml 1.5M Tris (pH=8.8)，8.0 ml 之 30% Acrylamide Mix，0.2 ml 之 10% SDS，0.2 ml 之 10% ammonium persulfate 及 0.01 ml TEMED。 C. 集離膠體溶液 (5% Stacking gel；總體積 5 ml)：加入 3.5 ml H2O，0.625 ml 之 1.5 M Tris (pH=6.8)，0.825 ml 之 30% Acrylamide Mix，0.05 ml 之 10% SDS，0.05 ml 之 10% ammonium persulfate 及 0.05 ml 之 TEMED。 D. 樣品前處理：取 50 μg 之蛋白質量於離心管，以 PBS 補足體積，使 每管的體積皆為相同，同時加入 6 倍 Protein loading buffer (此為樣品 1/6. 51.
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