2-1 實驗技術
2-1.1 單分子實驗技術
過去研究溶液中 DNA 分子二級結構時，常使用核磁共振光譜 (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy, NMR) 、 圓 二 色 性 光 譜 (Circular Dichroism Spectrum, CD)、西方墨點法 (Western blotting) 等方法。然而，上述實驗技術都是 巨觀的觀察方式，得到的結果是許多分子的平均結果。至於 DNA 分子的個體變 異性 (heterogeneity) 和動態改變性質會在平均過程中被消去。因此需要可觀察單 一分子的技術來取得這些資訊。
單分子實驗技術 (single-molecule experiment techniques) 透過觀察單一分子的 行為，得到每個分子的構型、動力學與動態學資訊，可避免平均後造成的影響。近 年來已經在物理學、化學、生物學中不同領域有許多的應用[28]。
單分子實驗技術可分為兩大類。一類是利用施力來操控分子，例如利用原子 間作用力使探針上下偏移的原子力顯微鏡 (atomic force microscopy, AFM)、使用雷 射控制聚合球的光鉗 (laser opotical tweezers, LOT)、用磁力控制磁珠的磁鉗 (magnetic tweezers, MT) 等 。 另 一 類 為 單 分 子 螢 光 光 譜 (single-molecule fluorescence, SMF)，會將螢光分子修飾於目標分子上，藉由顯微鏡觀察螢光分子 發出的訊號強弱變化，來分析每個分子的行為。顯微鏡方面常使用全內反射式螢 光 (total internal reflection fluorescence, TIRF)、共軛焦 (confocal) 與廣視場 (wide-field) 顯微鏡三種[28]，見圖十三。
圖 十三、常見單分子實驗技術示意圖。(A) 原子力顯微鏡、(B) 光鉗、(C) 磁鉗、(D) 單分子螢光光譜，摘錄自參考資料[28]。
2-1.2 螢光共振能量轉移
本實驗所使用之單分子實驗技術為螢光共振能量轉移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) ，是一種螢光分子將能量轉移到另一螢光分子的機制。其中 將能量轉移出去的螢光分子稱為供體 (donor)；另一接受能量的螢光分子稱為受體 (acceptor)。當供體被激發後，其電子會躍遷至激發態 (excited state)，經由振動鬆 弛下降至激發態最低能階後，會以釋放螢光的方式回到基態 (ground state)。若有 受體在同一系統中，則供體有機會透過偶極-偶極作用 (dipole-dipole interaction) 將能量傳遞給受體，使其電子躍遷後再以放螢光的方式回到基態[29,30]，見圖十 四。螢光能量共振轉移需要滿足下列三個條件才有機會發生:
1. 供體放射光譜需與受體的吸收光譜重疊 2. 供體與受體距離小於 10 nm
3. 供體與受體的偶極矩向量不能為垂直方向
圖 十四、螢光共振能量轉移機制示意圖。摘錄自參考資料[29]。
螢光共振能量轉移效率 (EFRET) 關係式定義如下 :
𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇 = 𝐼𝐴
𝐼𝐷+ 𝐼𝐴 = 1 1 + (𝑅
𝑅0)6
其中 EFRET 定義為螢光共振轉移效率，IA 為受體放光強度；ID 為供體放光強 度；R 為供體受體間的距離；R0 為兩者在螢光共振轉移效率為 50 % 時的距離，
其數值會因選用何種螢光分子作為供體或受體而異。
EFRET 值與供體與受體間的距離六次方呈反比。當兩者越靠近，其 EFRET 值 會越高，反之越遠則越低。因此將供體與受體標記在欲觀測分子之某特定位置上，
藉由 EFRET 值的變化，可以知道其結構改變。
本研究分別使用 Cyanine 3 (以下簡稱 Cy3) 與 Cyanine 5 (以下簡稱 Cy5) 兩 螢光分子作為供體和受體。兩者的吸收與放射光譜見圖十五。其 R0 值為 5.6 nm，
並在相距3-8 nm 時有最佳的靈敏度[30]，見圖十六。
圖 十六、Cy3、Cy5 螢光共振能量轉移示意圖。(A)、距離之影響，(B)、
偶極矩之影響。摘錄自參考資料[30]。
2-1.3 全內反射螢光顯微鏡
在單分子實驗中，由於單一供體或受體所發出的螢光強度較弱，易受到背景 雜訊干擾，因此需要透過降低實驗的背景雜訊來提高實驗中的訊噪比 (signal-to-noise ratio, S/N ratio)。
本 實 驗 室 使 用 全 內 反 射 螢 光 顯 微 鏡 (total internal reflection fluorescence microscopy, TIRF-M) 進行單分子實驗。當光欲從高折射率介質進入低折射率介質，
且入射角 (𝜃) 大於臨界角 (critical angle, 𝜃𝑐 ) 時，會產生全內反射現象。此時會 有部分光穿透到低折射率介質產生漸逝場 (Evanescent field)，其光強度會隨著穿 透距離呈指數衰減，約能穿透 100 nm 的距離，因此只有靠近介面處的螢光分子 會被激發。此方法可以有效降低實驗背景雜訊來提升訊噪比[31]。
全內反射螢光顯微鏡可分為稜鏡型 (prism-type) 與物鏡型 (objective-type) 兩種。稜鏡型中入射光會經過稜鏡產生折射，使其在介面處發生全內反射；物鏡 型則是透過物鏡折射，形成一較大的入射角度來產生全內反射[31]，見圖十七。本 研究中所用的為稜鏡型的全內反射螢光顯微鏡。
圖 十七、全內反射螢光顯微鏡裝置示意圖。(A)、稜鏡型，(B)、物鏡型。
2-1.4 實驗儀器架構
在本研究中，會以波長為 532 nm 雷射作為光源，藉由稜鏡產生全內反射，
在介面處產生漸逝場，激發 Cy3 分子，使其自身釋放螢光或將能量透過螢光能 量共振轉移傳遞給 Cy5 分子而令其釋放螢光。螢光再經過物鏡與濾鏡後，通過 一長條狀狹縫，使成像變為長方形，接著使用兩消色差透鏡 (achromat) 放大成 像。由於 Cy3 與 Cy5 所釋放的螢光波長不同，因此利用雙色鏡 (dichroic mirror) 反射 Cy3 釋放的螢光並讓 Cy5 釋放的螢光通過，來達到分離兩者的目的。Cy5 釋放的螢光再用一反射鏡將其反射。最後經由分離、反射的 Cy3 與 Cy5 螢光 訊號會投至電子放大式電荷耦合器 (Electron Multiplied Charged Coupled Device, EMCCD) 進行處理，最後將影像傳至電腦進行實驗觀測。
圖 十八、實驗儀器架構示意圖。摘錄自參考資料[21]。
2-2 實驗樣品製備
14. 將 100 mL 甲醇、5 mL 醋酸與 1mL 三甲氧矽丙基乙二胺 (N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylwnwdiamine, aminosilane) 加入至錐形瓶中 並搖晃均勻，倒入含有玻片的染色壺中，需將玻片淹沒
2-2.2
樣品槽組裝在進行實驗前，需將經化學修飾的載玻片與蓋玻片組裝成樣品槽。首先至 -20℃ 冰箱取出待其回溫後，從真空包裝取出一組載玻片與蓋玻片。載玻片以修 飾面朝上的方式，在每組平形孔洞之間黏上雙面膠做為間隔，每組平形孔洞可供 樣品注入與排出。再將蓋玻片以修飾面朝下的方式對齊載玻片並與其黏合。最後 使用環氧樹酯 (epoxy) 將所有空隙密封，並等待其凝固及完成樣品槽的組裝。見 圖二十。
圖 二十、樣品槽組裝流程示意圖。摘錄自參考資料[21]。
2-2.3 實驗 DNA 序列設計
(CTG)27 NH2-C6 linker (CTG)27 GCCTCGCTGCCGTCGCCA (CTG)37 NH2-C6 linker (CTG)37 GCCTCGCTGCCGTCGCCA 副序列 biotin TGGCGACGGCA /iCy5/ GCGAGGC
表 二、本研究所使用之 DNA 序列列表。
2-2.4 Cy3 螢光分子標記
圖 二十二、Cy3 分子與以 NH2-C6 連接鏈修飾的主序列 DNA 進行交聯 反應示意圖。摘錄自參考資料[21]。
2-2.5 DNA 黏合反應與分子間二聚體去除
2-2.6 固定樣品於樣品槽
為使樣品固定於樣品槽，本研究利用抗生物素醣蛋白 (NeutrAvidin) 和 生物素良好的結合性，且每一抗生物素醣蛋白至多可與四個生物素的特性，
讓其同時與玻片表面上和副序列上的生物素結合，以達到固定樣品的效果。
再注入樣品前，需先將 0.2 μg/μL NeutrAvidin 由孔洞注入樣品槽，靜置 5 分鐘，使其能與玻片表面上生物素充分結合。再以 Tris buffer 沖洗未結合 之 NeutrAvidin。再注入實驗樣品，使 NeutrAvidin 可與樣品中副序列的生 物素結合，靜置時間視結合情況而定，最後再以 Tris buffer 沖洗未結合之實 驗樣品。即完成固定樣品於樣品槽，見圖二十三。
圖 二十三、樣品固定於樣品槽之示意圖。摘錄自參考資料[32]。
2-2.7 閃爍與光漂白現象
螢光分子中的電子躍遷至單重激發態 (excited singlet state) 後，可經由震動 鬆弛 (vibrational relaxation) 降至第一激發單重態 (S1) 之最低能階。之後可以釋 放螢光 (fluorescence) 的方式回到基態。由於整個過程僅 10-7~10-9 秒，視其為亮 態。電子亦可經由系統間跨越 (intersystem crossing) 至不同自旋的激發三重態 (excited triplet state,T1)，若以釋放磷光 (phosphorescence) 的方式回到基態。由於 釋放磷光的過程不遵守選擇律 (selection rule)，所以整個過程所需的時間比螢光 更久，約 10-2~10-3 秒。單位時間內可被偵測的光子數量遠低於螢光，因此視其 為暗態 (dark state)，見圖二十四。在進行單分子實驗時，若發生系統間跨越，螢 光分子會有閃爍 (blinking) 現象發生，不利於實驗觀測。
圖 二十四、螢光與磷光機制示意圖。摘錄自參考資料[30]。
在單分子實驗中，若長時間在高強度雷射照射之下，樣品槽中的氧分子電 子組態會改變，變為具活性氧的單重態 (singlet oxygen)，能與被激發的螢光分 子反應，並使其無法釋放螢光，此現象稱為光漂白 (photobleaching)，亦會干擾 實驗觀察[30]，見圖二十五。
圖 二十五、螢光分子放光路徑與光漂白發生機制示意圖。摘錄自參考資料 [30]。
2-2.8 影像緩衝溶液
為改善閃爍與光漂白現象，實驗時需使用三重態淬熄劑並引入除氧系統。
本研究使用水溶性維生素E (Trolox)，其在紫外光的照射下與氧氣反應後會 生成 Trolox quinone，可作為良好的三重態淬熄劑，見圖二十六。
圖 二十六、Trolox 形成 Trolox quinone 示意圖。摘錄自參考資料[33]。
本研究所使用的除氧系統為葡萄糖氧化酶-過氧化氫酶系統 (glucose oxidase and catalase, GOX and CAT)。在葡萄糖氧化酶的催化下，葡萄糖會與氧氣反應 形成葡萄糖內酸酯 (glucono delta-lactone) 與過氧化氫 (hydrogen peroxide)。隨 後在過氧化氫酶的催化下，一當量的過氧化氫會生成一當量的水分子與半當量 的氧氣。在經過兩種酵素的作用下，可有效消耗反應溶液中的氧氣，以達到除 氧的效果，見圖二十七。
圖 二十七、葡萄糖氧化酶-過氧化氫酶系統作用示意圖。摘錄自參考資料 [34]。
由於本研究主要探討氯化鈉濃度對 (CAG)n 序列之影響。實驗中所使用的 影像緩衝溶液，不僅需含有三重態淬熄劑與除氧系統，還需要加入氯化鈉水溶 液並稀釋至所要的濃度，見表三。
藥品名 緩衝溶液中的濃度
Trolox 1.55 mM
Glucose oxidase 2170 unit/mL
Catalase 165 unit/mL
Glucose 0.5 (w/w)
NaCl 50 mM、100 mM、250 mM、500 mM
表 三、影像緩衝溶液所含的藥品與其最終濃度。
2-3 數據分析與處理
圖 二十八、IDL 所圈選之螢光分子對。左半邊為供體 (Cy3) 影像；右半 邊為受體 (Cy5) 影像。
接著用 MATLAB (Matrix Laboratory, The MathWorks, Inc) 程式進行分析。為 避免啟動快門與切換成紅光雷射所造成的誤差，短時間紀錄擷取第 3 幀至第 12 幀之影像，將每幀測得之 Cy3 訊號強度 (ID) 與 Cy5 訊號強度 (IA) 取平均，計 算每個分子的 EFRET 值。由於 Cy3 的螢光訊號在經過雙色鏡時會有部分逸漏 (leakage)，因此所測得的 IA 一部分是由 ID 所貢獻，此現象稱為供體逸漏 (donor leakage)。因此需將計算 EFRET 值公式修正為：
𝐸FRET= 𝐼𝑎− 𝛼𝐼𝑑 𝐼a + γ𝐼d
其中，𝛼 為逸漏之修正項，約為 0.2。γ 為量子產率 (quantum yield) 的修 正項[35]。本研究之 γ 值約為 1。實驗中會錄製 30 組短時間紀錄，將所計算
圖 二十九、由短時間紀錄所得的 EFRET 值分布長條圖。
至於長時間紀錄會將隨時間之變化之 Cy3 與 Cy5 螢光訊號記算得出每個 分子隨時間之變化之 EFRET 值。最後可得到 Cy3、Cy5 螢光訊號與 EFRET 值 之時間解析 EFRET 軌跡圖。若 Cy5 螢光強度與 EFRET 值驟降至 0，為發生光 漂白現象，此時需將發生光漂白之後的部分剪除，以免造成偏差，見圖三十。
至於長時間紀錄會將隨時間之變化之 Cy3 與 Cy5 螢光訊號記算得出每個 分子隨時間之變化之 EFRET 值。最後可得到 Cy3、Cy5 螢光訊號與 EFRET 值 之時間解析 EFRET 軌跡圖。若 Cy5 螢光強度與 EFRET 值驟降至 0，為發生光 漂白現象，此時需將發生光漂白之後的部分剪除，以免造成偏差，見圖三十。