鹽類濃度對神經退化性疾病相關的 CAG 與 CTG 重複序列之DNA髮夾結構動態轉換的影響

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(1)國立臺灣師範大學理學院化學系碩士論文 Department of Chemistry College of Science. National Taiwan Normal University Master’s Thesis. 鹽類濃度對神經退化性疾病相關的 CAG 與 CTG 重複序列之 DNA 髮夾結構動態轉換的影響 Salt concentration dependence on DNA hairpin conformational dynamics of CAG and CTG repeats associated with neurodegenerative diseases 王鴻仁 Hong-Ren Wang 指導教授：李以仁博士 Advisor: I-Ren Lee, Ph.D. 中華民國 109 年 8 月 August 2020.

(2) 謝誌我很慶幸自己能完成師大化學所的碩士學位。首先感謝我的指導教授李以仁老師在這兩年間不厭其煩的教導我，讓我在資料整理、邏輯思維、解決問題的能力都有明顯的進步。並且在我實驗進行的不順利時，鼓勵我不要灰心氣餒或害怕犯錯而導致實驗失敗，還支持我做多方嘗試，在錯誤中學習，並且不吝於分享自己過去經驗與建議。由於他持續的引導，使我面對實驗的心態從消極、猶豫不決慢慢變為積極、勇於嘗試、並能從中修正錯誤再重新來過。. 接著感謝在研究所兩年間曾經給我在實驗上指導與建議的李弘文老師、溫進德老師、范秀芳老師、江偉宏老師與杜玲嫻老師，指引我實驗的方向。還有孫英傑老師、洪偉修老師在書報討論課中提出一些物化相關的問題，加強我的物化觀念。. 另外還要感謝丞緯、語潔、洋逸、陳謙、堃愷與文昊教導我如何做單分子實驗與實驗儀器的架設及數據的處理。還有冠豪、凱駿陪我度過兩年的時光，和我共同修課、討論實驗的進行與分享在實驗與寫論文過程的甘苦心得。以及彥霖、軒晧、思妤、芝綺幫我分擔實驗進度上的壓力，使我能夠撐過碩二一整學年。還有在師大、台大與台科大實驗室曾經幫助過我或是聽我傾訴壓力、分享趣事的同學，因為有你們使我的實驗室生活不會感到枯燥。. 最後感謝我的家人與朋友，當初支持我念研究所，並在我遭遇打擊時給我加油打氣，使我能夠堅持到最後完成研究所學業。這一路上走來雖然道路崎嶇，但是有你們與我同行，使我在這條路上並不感到孤單，反而造就許多難得的經歷與回憶。讓我再次謝謝大家。. i.

(3) 摘要三核苷酸重複序列 (Trinucleotide repeats; TNR) 的不正常擴張會引發多種神經退化性遺傳疾病，其中有許多疾病是由 CAG/CTG 重複序列不正常擴張引起的，例如亨丁頓舞蹈症 (Huntington’s Disease)。由於 TNR 會形成髮夾結構且具有構型間滑動重組的特性，使 DNA 在複製、修復和重組過程中發生錯誤而造成序列擴張。本研究利用單分子螢光共振能量轉移光譜，以氯化鈉濃度為操縱變因，探討奇數重複次數 (CAG)n 與 (CTG)n 序列之動態結構轉換。在低氯化鈉濃度下，可觀察到 (CAG)n 序列傾向形成尾端單組 CAG 序列突出、由四個核苷酸組成環的懸垂髮夾結構，且可能因髮夾結構尾端不穩定而造成其部分打開，但並未觀察到兩端對齊、由三個核苷酸組成環的鈍端髮夾結構。而在較高氯化鈉濃度下，除了使 (CAG)n 序列髮夾結構局部打開之速率常數明顯下降，還出現類似於 (CTG)n 序列之懸垂與鈍端髮夾結構動態結構轉換。我們認為鈉離子可以中和 DNA 磷酸根的負電荷，使鹼基配對作用力更穩定，因此氯化鈉濃度越高，(CAG)n 序列髮夾結構越不容易打開。另外由於 A-A 錯誤配對較 T-T 錯誤配對不穩定，在低氯化鈉濃度下 CAG-CAG 配對無法支撐由三核苷酸組成且較不穩定的環狀結構，因此較不傾向形成鈍端結構，而隨著氯化鈉濃度越高，CAG-CAG 配對穩定性越高，使其有機會生成鈍端結構，因此可觀察到類似於 (CTG)n 序列的動態結構轉換，且在 (CTG)n 序列中亦觀察到當氯化鈉濃度增高，構型間的平衡偏向鈍端結構的現象。因此我們結論 TNR 髮夾結構的莖 (stem) 穩定性可由氯化鈉濃度調控，而影響其動態髮夾構型重組。. 關鍵字：單分子螢光共振能量轉移、CAG 重複序列、DNA 髮夾結構、三核苷酸重複序列擴張疾病. ii.

(4) Abstract Trinucleotide repeat (TNR) is responsible for several neurodegenerative diseases. Among them, CAG and CTG causes the most diseases, such as Huntington’s Disease. The general pathogenesis of these diseases is that TNR repeats form the hairpin structures with the capability of slippage hairpin configuration, result in errors that lead to abnormal expansions in DNA replication, repair, and recombination processes. In this work, we used single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) to study sodium chloride (NaCl) concentration dependence on the dynamic conformational changes of odd-numbered CAG and CTG repeats. The result reveals that at low NaCl concentration, CAG repeats tend to fold into an overhang hairpin structure with a tetranucleotide loop and a single CAG repeat protruding unit. Occasionally, the termini of hairpin transiently and partially open due to the instability of the stem of the hairpin. Unlike CTG repeats, the blunt-end hairpin configuration of CAG repeats was not observed. However, at high NaCl concentration, the rate constant of partial opening of hairpin decrease dramatically, and the dynamic conformational changes between the overhang and blunt-end configuration was observed. We proposed that sodium ion neutralizes the phosphate groups in the DNA backbone, resulting in lowering the repulsions between the backbones of two antiparallel pairing strands (CAG:CAG) and stabilizing this pairing interaction in the stem of the TNR hairpins. Since the A-A mismatch is less stable than the T-T mismatch, at low NaCl concentration, the CAG:CAG pairs are unable to hold the relatively unstable trinucleotide loop and make the blunt-end structure unfavored. In contrast, at higher NaCl concentration, the stem consisting of CAG:CAG pairs is stabilized, making the blunt-end hairpin thermodynamically reachable, and therefore, transitions between blunt-end and overhang configuration were observed. Moreover, as the increase of sodium chloride iii.

(5) concentration, the equilibrium between two hairpin configurations in (CTG)n also leans to the blunt-end configuration due to the strengthening of the stem. In conclusion, stem stability can be modulated by sodium chloride concentration and change the TNR reconfiguration dynamics.. Keyword：Single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), CAG tandem repeats, DNA hairpin structures, trinucleotide repeat expansion diseases. iv.

(6) 目錄謝誌.................................................................................................................................i 摘要................................................................................................................................ii Abstract ....................................................................................................................... iii 目錄................................................................................................................................ v 圖目錄..........................................................................................................................vii 表目錄............................................................................................................................ x 緒論............................................................................................................ 1. 第一章. 1-1 前言 ..................................................................................................................... 1 1-2 多聚谷氨酰胺疾病致病原因 ............................................................................ 4 1-3 非典型 DNA 二級結構.................................................................................... 5 1-4 重複序列擴張 .................................................................................................... 6 1-5 CAG 重複序列髮夾結構 ................................................................................ 10 1-6 (CTG)n 序列結構與動力學模型 .................................................................. 12 1-7 研究動機.......................................................................................................... 14 第二章、. 實驗方法.............................................................................................. 15. 2-1 實驗技術.......................................................................................................... 15 2-1.1 單分子實驗技術.............................................................................. 15 2-1.2 螢光共振能量轉移.......................................................................... 17 2-1.3 全內反射螢光顯微鏡...................................................................... 20 2-1.4 實驗儀器架構.................................................................................. 21 2-2 實驗樣品製備.................................................................................................. 22 2-2.1 實驗玻片表面化學修飾.................................................................. 22 v.

(7) 2-2.2 樣品槽組裝...................................................................................... 24 2-2.3 實驗 DNA 序列設計 ..................................................................... 25 2-2.4 Cy3 螢光分子標記 ......................................................................... 27 2-2.5 DNA 黏合反應與分子間二聚體去除 ........................................... 29 2-2.6 固定樣品於樣品槽.......................................................................... 30 2-2.7 閃爍與光漂白現象.......................................................................... 31 2-2.8 影像緩衝溶液.................................................................................. 33 2-3 數據分析與處理.............................................................................................. 35 2-3.1 數據分析.......................................................................................... 35 2-3.2 擬合分析.......................................................................................... 38 第三章、. 實驗結果與討論.................................................................................. 40. 3-1 實驗設計.......................................................................................................... 40 3-2 (CAG)n 結構隨氯化鈉濃度變化分析 .......................................................... 41 3-2.1 EFRET 分布直方圖 ........................................................................... 41 3-2.2 時間解析 EFRET 軌跡圖................................................................. 45 3-2.3 轉換密度分析.................................................................................. 49 3-3 (CAG)n 結構與 (CTG)n 結構隨氯化鈉濃度變化分析及比較.................. 51 3-4 (CAG)n 與 (CTG)n 結構隨氯化鈉濃度變化之動力學 .............................. 58 3-5 氯化鈉濃度對 (CAG)n 與 (CTG)n 髮夾結構穩定性影響........................ 61 第四章、. 結論與未來展望.................................................................................. 66. 參考文獻...................................................................................................................... 67. vi.

(8) 圖目錄圖一、三核苷酸重複序列與其會導致的遺傳疾病。.............................................. 2 圖二、PolyQ 低聚體、包含體的生成與其細胞毒性。 ......................................... 4 圖三、DNA 二級結構示意圖。 ............................................................................... 5 圖四、DNA 複製過程中造成重複序列擴張和收縮示意圖。 ............................... 7 圖五、DNA 修復過程中造成重複序列擴張示意圖。 ........................................... 8 圖六、DNA 重組過程中造成重複序列擴張和收縮示意圖。 ............................... 9 圖七、(CAG)5、(CAG)6 序列結構示意圖。 ......................................................... 10 圖八、奇數與偶數重複次數 (CNG)n 序列所形成的髮夾結構示意圖。 ........... 11 圖九、奇數重複次數 CAG 重複序列形成四個核苷酸組成環狀部分，並在 3’ 端或 5’ 突出一組 CAG 序列的髮夾結構。 ............................................ 11 圖十、偶數與奇數重複次數的 (CTG)n 結構示意圖。........................................ 13 圖十一、懸垂結構轉換至鈍端結構轉換機制示意圖。........................................ 13 圖十二、鈍端結構轉換至懸垂結構轉換機制示意圖。........................................ 13 圖十三、常見單分子實驗技術示意圖。................................................................ 16 圖十四、螢光共振能量轉移機制示意圖。............................................................ 17 圖十五、Cy3、Cy5 吸收與放射光譜圖。 ............................................................ 18 圖十六、Cy3、Cy5 螢光共振能量轉移示意圖。 ................................................ 19 圖十七、全內反射螢光顯微鏡裝置示意圖。........................................................ 20 圖十八、實驗儀器架構示意圖。............................................................................ 21 圖十九、玻片表面化學修飾示意圖。.................................................................... 23 圖二十、樣品槽組裝流程示意圖。........................................................................ 24 圖二十一、實驗序列設計示意圖。........................................................................ 25 圖二十二、Cy3 分子與以 NH2-C6 連接鏈修飾的主序列 DNA 進行交聯反應示意圖。................................................................................................ 28 vii.

(9) 圖二十三、樣品固定於樣品槽之示意圖。............................................................ 30 圖二十四、螢光與磷光機制示意圖。.................................................................... 31 圖二十五、螢光分子放光路徑與光漂白發生機制示意圖。................................ 32 圖二十六、Trolox 形成 Trolox quinone 示意圖。 .............................................. 33 圖二十七、葡萄糖氧化酶-過氧化氫酶系統作用示意圖。 .................................. 33 圖二十八、IDL 所圈選之螢光分子對。 ............................................................... 36 圖二十九、由短時間紀錄所得的 EFRET 值分布長條圖。................................... 37 圖三十、時間解析 EFRET 軌跡圖。上方為 Cy3、Cy5 螢光訊號強度隨時間變化圖。........................................................................................................ 37 圖三十一、以 HaMMy 擬合程式分析時間解析 EFRET 軌跡圖。 ..................... 38 圖三十二、由 TDP 程式得出轉換密度圖與速率常數。 .................................... 39 圖三十三、單分子實驗設計。................................................................................ 40 圖三十四、(CAG)n 序列之 EFRET 分布隨氯化鈉濃度變化直方圖。 ................ 44 圖三十五、奇數 (CAG)n 序列之時間解析 EFRET 軌跡圖。 .............................. 47 圖三十六、偶數 (CAG)n 序列之時間解析 EFRET 軌跡圖。 .............................. 48 圖三十七、奇數 (CAG)n 序列在不同氯化鈉濃度下之 TDP 圖。 .................... 50 圖三十八、(CTG)n 序列之 EFRET 分布隨氯化鈉濃度變化直方圖。................. 53 圖三十九、奇數 (CTG)n 序列之時間解析 EFRET 軌跡圖。 ............................... 55 圖四十、奇數 (CTG)n 序列隨氯化鈉濃度變化之 TDP 圖。 ............................ 56 圖四十一、(CAG)n 序列在不同氯化鈉濃度下髮夾結構尾端局部開合狀態轉換之速率常數折線圖。............................................................................ 58 圖四十二、(CTG)n 序列在不同氯化鈉濃度下懸垂與鈍端髮夾結構轉換之速率常數折線圖。........................................................................................ 60 圖四十三、氯化鈉濃度與 (CAG)15 與 (CAG)21 髮夾結構尾端局部開合自由能變化量關係折線圖。............................................................................ 62 圖四十四、氯化鈉濃度與 (CTG)n 序列懸垂與鈍端髮夾結構轉換自由能變化量 viii.

(10) 關係折線圖。........................................................................................ 63 圖四十五、氯化鈉濃度對奇數重複次數 (CAG)n 序列動態結構轉換影響之示意圖。........................................................................................................ 65. ix.

(11) 表目錄表一、由 CAG 重複序列擴張所引起的疾病。 ..................................................... 3 表二、本研究所使用之 DNA 序列列表。 ........................................................... 26 表三、影像緩衝溶液所含的藥品與其最終濃度。................................................ 34 表四、(CAG)15、(CAG)21 在不同氯化鈉濃度下髮夾結構尾端局部開合狀態轉換之速率常數。............................................................................................ 58 表五、(CAG)15、(CAG)21 在氯化鈉濃度為 250 mM 與 500 mM 懸垂與鈍端髮夾結構轉換之速率常數。........................................................................ 59 表六、(CTG)n 序列在不同氯化鈉濃度下懸垂與鈍端髮夾結構轉換之速率常數。................................................................................................................ 60 表七、(CAG)15 與 (CAG)21 髮夾結構尾端局部開合之平衡常數與自由能變化化量。............................................................................................................ 62 表八、(CAG)15 與 (CAG)21 懸垂與鈍端髮夾結構轉換之平衡常數與自由能變化量。............................................................................................................ 62 表九、(CTG)n 序列懸垂與鈍端髮夾結構轉換之平衡常數與自由能變化量。.. 63. x.

(12) 第一章. 緒論. 1-1 前言微衛星 (Microsatellites) 序列是一種由一到六個鹼基對為最小重複單位組成的序列，又被稱為短串連重複 (short tandem repeats，STR) 序列或是簡單重複序列 (simple sequence repeats，SSRs)。其普遍存在於原核生物與真核生物的基因組中，且分布甚廣，不論在基因間區段 (intergenic regions) 還是開放閱讀框 (open reading frames，ORFs) 皆有微衛星序列的存在[1]。三核苷酸重複序列 (trinucleotide repeats，TNRs) 是一種特殊的微衛星序列。當某些在特定基因位置上的三核苷酸重複序列長度超過一定程度時，會使本身結構不穩定，讓序列持續擴張，最後導致三核苷酸重複序列擴張疾病 (triplet repeat expansion diseases, TREDs)。此類疾病約莫有 20 多種。大部分屬於神經退化性疾病 (Neurodegenerative Disease，ND) 或神經肌肉疾病 (Neuromuscular Disorders， NMD)，見圖一。而這些疾病具有遺傳早現 (anticipation) 的現象: 當遺傳疾病傳給下個世代時，發病年齡會越早且病症會更加嚴重[1–3]。. 1.

(13) 圖一、三核苷酸重複序列與其會導致的遺傳疾病。摘錄自參考資料[3]。. 其中有許多疾病由 CAG 重複序列不正常擴張所引起。如表一所示。包括亨丁頓舞蹈症 (Huntington’s Disease)、脊髓性小腦萎縮症 (Spinocerebellar ataxia, SCAs) 第一、二、三、六、七、十七型 (SCA1,2,3,6,7,17)、齒狀紅核蒼白球肌萎縮症 (Dentato-rubro-pallido-luysian atrophy, DRPLA) 、脊髓延髓性肌肉萎縮症 ((Spinal and Bulbar Muscular Atrophy, SBMA) 又稱為甘迺迪氏症 (Kennedy Disease)。上述疾病的主要症狀有小腦共濟失調、感官退化、認知能力下降等。脊髓性小腦萎縮症第二型 (SCA2) 被認為和漸凍症 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 與帕金森氏症 (Parkinson's disease) 有關[4,5]。以亨丁頓舞蹈症 (Huntington’s Disease) 為例，正常情況下，CAG 重複序列重複次數為 9-36，若重複次數大於 37 就有可能會發病，且重複次數越多發病年齡就越小，症狀也會更嚴重。這些病症被通稱為多聚谷氨酰胺疾病 (Polyglutamine Disease, PolyQ Disease)。這是因為 CAG 重複序列擴張，使轉譯出的蛋白質含有聚谷氨酰胺 (PolyQ)。此類蛋白質會形成聚集 (aggregation) 而具有細胞毒性，進而引發多聚谷氨酰胺疾病[4,5]。 2.

(14) 表一、由 CAG 重複序列擴張所引起的疾病。摘錄自參考資料[4]。. 3.

(15) 1-2 多聚谷氨酰胺疾病致病原因當 CAG 重複序列經過轉錄與轉譯後，會生成多聚谷氨酰胺單體 (PolyQ monomer)。如圖二所示，含有多聚谷氨酰胺單體的蛋白質可能會形成 β 摺疊 (β sheet) 的結構。數個單體會藉由分子間氫鍵形成低聚體 (oligomer)，隨後會產生聚集 (aggregation) 現象，最後生成包含體 (inclusion)。CAG 重複序列的重複次數越多，轉譯出的多聚谷氨酰胺單體越長，形成分子間氫鍵的機率越高，也就越容易有聚集現象。此外，不論是單體、低聚體或包含體都可能具有細胞毒性。這些結構的主要毒性作用包括轉錄失調、泛素-蛋白酶體系統損壞、粒線體功能障礙，細胞內鈣離子濃度失調，軸突運輸受損，進入細胞核中會產生基因毒性作用等[6,7]。. 圖二、PolyQ 低聚體、包含體的生成與其細胞毒性。摘錄自參考資料 [6]。. 4.

(16) 1-3 非典型 DNA 二級結構造成序列擴張的原因是序列本身會形成非典型 DNA 二級結構，使得重複序列整體不穩定，會有滑動 (slippage) 的情形，因而造成重複序列擴張[8]。圖二列舉出幾種非典型 DNA 二級結構。其中 (CNG)n 重複序列 ( N 可為 A, T, C, G ) 可以藉由錯誤鹼基配對 (mismatch base pairs) 形成髮夾 (hairpin) 結構。以 CAG 重複序列為例，其本身可以藉由 C-G 鹼基對與 A-A 錯誤鹼基配對形成髮夾結構。. 圖三、DNA 二級結構示意圖。(a)、髮夾 (hairpin) 結構。(b)、鳥嘌呤四聚體 (G-quardplex) 結構。(c)、雙股 DNA 髮夾結構。(d)、H DNA 和 sticky DNA 結構。(d)、解旋 (unwinding) 結構。摘錄自參考資料[8]。. 5.

(17) 1-4 重複序列擴張重複序列擴張主要在 DNA 進行複製 (replication)、修復 (repair) 或重組 (recombination) 的過程中因為其本身滑動而形成二級結構所引起的。過去認為當某一股 DNA 形成時，部分序列並未在雙股結構上，反而在雙股結構外形成環狀結構，使 DNA 下次進行複製時，一併將這些序列複製，造成序列擴張。然而此推論並不能解釋為何只有一部分的重複序列會擴張以及重複序列超過某一數量才會擴張的現象。之後發現這些重複序列本身會形成前面所敘述的 DNA 二級結構，使序列整體變得不穩定，造成序列擴張[8]。 DNA 複製過成中，DNA 解旋酶 (helicases) 會將雙股螺旋結構解開，形成複製叉 (replication fork)。接著，DNA 聚合酶 (polymerase) 會將兩個單股作為模板，以半保留複製 (semiconservative replication) 方式進行複製。由於 DNA 聚合酶在複製時聚有方向性，在領先股 (leading strand) 可以連續複製，但在延遲股 (lagging strand) 會先形成岡崎片段 (Okazaki fragment) 再由 DNA 聚合酶將兩者接合，兩個新生股的生成速率會因此不同[9]。若二級結構位在延遲股上的岡崎啟動區域 (Okazaki initial zone) 上，DNA 聚合酶進行複製過程受阻，會略過一個或多個岡崎片段而留下間隙，再透過蛋白質來修復，使新生股的重複序列變短；若二級結構因為複製叉反轉的緣故出現在領先股的新生股上，使兩者序列無法配對，就會中斷複製過程。待重新開始複製時，就會生成多餘的序列，最後導致重複序列擴張[8]。. 6.

(18) 圖四、DNA 複製過程中造成重複序列擴張和收縮示意圖。圓圈為 DNA 聚合酶、紅線部分為重複序列、綠線部分為重複序列的互補股、粉紅線部分為岡崎片段的引子。摘錄自參考資料[8]。. 7.

(19) 若 DNA 因為氧化自由基的破壞，產生一個小缺口，正常情況下，皮瓣核酸內切酶 (flap endonuclease 1, FEN1) 會由 5’ 端移動至 3’ 端，將皮瓣給移除。然而若當中有包含重複序列，皮瓣核酸內切酶會將皮瓣摺疊成類似髮夾結構的形狀。接著由於 MSH2-MSH3 兩種錯誤配對修復蛋白所形成的異二聚體 (heterodimer) 會與 DNA 髮夾結構的錯誤鹼基配對產生穩定的交互作用力，可使髮夾結構在移除皮瓣的過程中保留下來，最後使 DNA 序列擴張[8]，見圖五。. 圖五、DNA 修復過程中造成重複序列擴張示意圖。(a)、DNA 受到氧化自由基破壞。(b)、FEN1 將皮瓣折疊成一類似髮夾結構的形狀。(c)、 MSH2-MSH3 與髮夾結構產生穩定的交互作用力。(d)、髮夾結構於修復過程中被保留下來。(e)、DNA 重複序列擴張。摘錄自參考資料[8]。. 8.

(20) 而 DNA 重組過程中也有機會造成序列擴張。其是由兩條雙股 DNA 以不平等交換重組 (unequal crossing over recombination) 的方式進行擴張，見圖六 (a)。此外，在 DNA 複製過程中亦會發生重組，如圖六 (b)。若在延遲股模板鏈的重複序列形成髮夾結構時，會阻礙複製叉，而造成雙股斷裂，使 DNA 序列重組。首先會將延遲股模板鏈上的重複序列切除，在 3’ 端處形成單股延長的 DNA，再侵入領先股並進形重組，進而使重複序列擴張或縮短[8]。. 圖六、DNA 重組過程中造成重複序列擴張和收縮示意圖。(a)、不平等交換過程造成重複序列擴張與收縮。藍線與灰線互為同源染色體，紅線為重複序列、綠線為其互補股。(b)、DNA 複製過程中，發生重組現象造成重複序列擴張。紅線為重複序列，綠線為其互補股。摘錄自參考資料[8]。. 9.

(21) 1-5 CAG 重複序列髮夾結構 1998 年，Goutam Gupta 研究團隊使用 NMR 光譜、膠體電泳方法得出 (CAG)5、(CAG)6 兩種序列的結構。發現兩者接形成兩端對齊的髮夾結構，不同的地方在於環狀部分。(CAG)5 環狀部分由三個核苷酸組成，而 (CAG)6 的環狀部分則是由四個核苷酸組成[10]。此結果與其先前解出的(CTG)5、(CTG)6 的結果相同[11]，見圖七。. 圖七、(CAG)5、(CAG)6 序列結構示意圖。摘錄自參考資料[10]。. 先前也有許多文獻探討在三核苷酸重複序列中，奇數或偶數的重複次數對結構的影響[12–18]。若重複次數為奇數，會形成兩端對齊、三個核苷酸組成環狀部分的髮夾結構；若重複次數為偶數，會形成兩端對齊，但環狀部分由四個環構成的髮夾結構，見圖八。. 10.

(22) 圖八、奇數與偶數重複次數 (CNG)n 序列所形成的髮夾結構示意圖。摘錄自參考資料[18]。 2012 年，Delaney 的研究團隊以化學探針分析 (chemical probe analysis)。奇數重複次數的 CAG 重複序列會形成四個核苷酸組成環狀部分，並在 3’ 端或 5’ 突出一組 CAG 序列的髮夾結構[19]，見圖九。. 圖九、奇數重複次數 CAG 重複序列形成四個核苷酸組成環狀部分，並在 3’ 端或 5’ 突出一組 CAG 序列的髮夾結構。摘錄自參考資料[19]。. 11.

(23) 1-6 (CTG)n 序列結構與動力學模型先前本實驗室利用單分子技術研究 (CTG)n 序列，並鑑定出其構形，且得知其動力學資訊[20,21]。據研究結果所示:若重複次數為偶數，會形成一個穩定的兩端對齊的髮夾結構，稱為鈍端 (blunt-end) 結構，環狀部分由四個核苷酸所構成；若重複次數為奇數，會形成一個兩端對齊髮夾結構，但環狀部分由三個核苷酸所構成，以及在 3’ 或 5’ 突出、環狀部分由四個核苷酸所構成的髮夾結構，稱為懸垂 (overhang) 結構，如圖十所示。這兩種結構都可能存在且在室溫下會自發性的相互轉換，轉換機制如圖十一與圖十二所示[20]。. 首先，鄰近環的鹼基對氫鍵被解開，使環狀部分擴大。之後在鄰近環的 CTG:CTG 配對鬆開，在一端形成氣泡狀 (budge) 結構，並且朝向尾端移動。移動時會解開下個 CTG:CTG 配對的氫鍵，而原本的鬆開的 CTG:CTG 配對重新合上，直到尾端結束。每一步驟的能量障礙為鬆開一組 CTG:CTG 配對的活化能，此活化能並不大，因此可以藉由氣泡結構移動完成結構轉換。. 在最初解開臨近環的鹼基對時，懸垂結構需要解開一個鹼基對的氫鍵；鈍端結構卻需要解開三對鹼基對的氫鍵。由於懸垂結構需要解開的氫鍵數目較少，使轉換速率較快，反之，鈍端結構需要解開的氫鍵數目較多，使轉換速率較慢。造成奇數的 (CTG)n 序列傾向於鈍端結構。. 12.

(24) 圖十、偶數與奇數重複次數的 (CTG)n 結構示意圖。修改自參考資料 [20]。. 圖十一、懸垂結構轉換至鈍端結構轉換機制示意圖。摘錄自參考資料 [21]。. 圖十二、鈍端結構轉換至懸垂結構轉換機制示意圖。摘錄自參考資料 [21]。. 13.

(25) 1-7 研究動機在三重複核苷酸序列中，由 CAG 重複序列不正常擴張所引起的遺傳疾病是這當中最多的。且這些遺傳疾病並沒有有效的治療方法。為了瞭解三重複核苷酸序列的擴張機制，本實驗室先前用單分子螢光共振能量轉移光譜，研究不同長度的 (CAG)n、(CTG)n、(CCG)n 和 (CGG)n 序列。發現奇數的 (CTG)n、(CCG)n 和 (CGG)n 序列都觀察到懸垂與鈍端兩種結構的轉換，並且得知其動力學資訊[20– 23]。. 然而奇數的 (CAG)n 序列並沒有發現鈍端髮夾結構。因此推測可能原因是 A-A 錯誤配對形成的自由能較高，使 CAG:CAG 配對的穩定作用力較小，無法維持由三核苷酸組成較不穩定的環狀結構。至於偶數的 (CAG)n 序列，較長的重複次數可以觀察到形成穩定的鈍端結構，與另外三種序列結果相同[20,24–27]。. 為了驗證我們的推測，我們利用調控氯化鈉濃度來調整 CXG:CXG 反平行配對的穩定性，利用單分子螢光共振能量轉移光譜，探討奇數重複次數的 (CAG)n 序列結構變化，並進行動力學與動態學分析。期望藉由改變鹽類濃度，三重複序列的結構與滑動現象對鹽類的依存性[20]。. 14.

(26) 第二章、 2-1 2-1.1. 實驗方法. 實驗技術單分子實驗技術. 過去研究溶液中 DNA 分子二級結構時，常使用核磁共振光譜 (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy, NMR) 、圓二色性光譜 (Circular Dichroism Spectrum, CD)、西方墨點法 (Western blotting) 等方法。然而，上述實驗技術都是巨觀的觀察方式，得到的結果是許多分子的平均結果。至於 DNA 分子的個體變異性 (heterogeneity) 和動態改變性質會在平均過程中被消去。因此需要可觀察單一分子的技術來取得這些資訊。單分子實驗技術 (single-molecule experiment techniques) 透過觀察單一分子的行為，得到每個分子的構型、動力學與動態學資訊，可避免平均後造成的影響。近年來已經在物理學、化學、生物學中不同領域有許多的應用[28]。單分子實驗技術可分為兩大類。一類是利用施力來操控分子，例如利用原子間作用力使探針上下偏移的原子力顯微鏡 (atomic force microscopy, AFM)、使用雷射控制聚合球的光鉗 (laser opotical tweezers, LOT)、用磁力控制磁珠的磁鉗 (magnetic tweezers, MT) 等。另一類為單分子螢光光譜 (single-molecule fluorescence, SMF)，會將螢光分子修飾於目標分子上，藉由顯微鏡觀察螢光分子發出的訊號強弱變化，來分析每個分子的行為。顯微鏡方面常使用全內反射式螢光 (total internal reflection fluorescence, TIRF)、共軛焦 (confocal) 與廣視場 (widefield) 顯微鏡三種[28]，見圖十三。. 15.

(27) 圖十三、常見單分子實驗技術示意圖。(A) 原子力顯微鏡、(B) 光鉗、(C) 磁鉗、(D) 單分子螢光光譜，摘錄自參考資料[28]。. 16.

(28) 2-1.2. 螢光共振能量轉移. 本實驗所使用之單分子實驗技術為螢光共振能量轉移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) ，是一種螢光分子將能量轉移到另一螢光分子的機制。其中將能量轉移出去的螢光分子稱為供體 (donor)；另一接受能量的螢光分子稱為受體 (acceptor)。當供體被激發後，其電子會躍遷至激發態 (excited state)，經由振動鬆弛下降至激發態最低能階後，會以釋放螢光的方式回到基態 (ground state)。若有受體在同一系統中，則供體有機會透過偶極-偶極作用 (dipole-dipole interaction) 將能量傳遞給受體，使其電子躍遷後再以放螢光的方式回到基態[29,30]，見圖十四。螢光能量共振轉移需要滿足下列三個條件才有機會發生:. 1. 供體放射光譜需與受體的吸收光譜重疊 2. 供體與受體距離小於 10 nm 3. 供體與受體的偶極矩向量不能為垂直方向. 圖十四、螢光共振能量轉移機制示意圖。摘錄自參考資料[29]。. 17.

(29) 螢光共振能量轉移效率 (EFRET) 關係式定義如下 :. 𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇 =. 𝐼𝐴 = 𝐼𝐷 + 𝐼𝐴. 1 𝑅 6 1 + (𝑅 ) 0. 其中 EFRET 定義為螢光共振轉移效率，IA 為受體放光強度；ID 為供體放光強度；R 為供體受體間的距離；R0 為兩者在螢光共振轉移效率為 50 % 時的距離，其數值會因選用何種螢光分子作為供體或受體而異。 EFRET 值與供體與受體間的距離六次方呈反比。當兩者越靠近，其 EFRET 值會越高，反之越遠則越低。因此將供體與受體標記在欲觀測分子之某特定位置上，藉由 EFRET 值的變化，可以知道其結構改變。本研究分別使用 Cyanine 3 (以下簡稱 Cy3) 與 Cyanine 5 (以下簡稱 Cy5) 兩螢光分子作為供體和受體。兩者的吸收與放射光譜見圖十五。其 R0 值為 5.6 nm，並在相距 3-8 nm 時有最佳的靈敏度[30]，見圖十六。. 圖十五、Cy3、Cy5 吸收與放射光譜圖。摘錄自參考資料[30]。 18.

(30) 圖十六、Cy3、Cy5 螢光共振能量轉移示意圖。(A)、距離之影響，(B)、偶極矩之影響。摘錄自參考資料[30]。. 19.

(31) 2-1.3. 全內反射螢光顯微鏡. 在單分子實驗中，由於單一供體或受體所發出的螢光強度較弱，易受到背景雜訊干擾，因此需要透過降低實驗的背景雜訊來提高實驗中的訊噪比 (signal-tonoise ratio, S/N ratio)。本實驗室使用全內反射螢光顯微鏡 (total internal reflection fluorescence microscopy, TIRF-M) 進行單分子實驗。當光欲從高折射率介質進入低折射率介質，且入射角 (𝜃) 大於臨界角 (critical angle, 𝜃𝑐 ) 時，會產生全內反射現象。此時會有部分光穿透到低折射率介質產生漸逝場 (Evanescent field)，其光強度會隨著穿透距離呈指數衰減，約能穿透 100 nm 的距離，因此只有靠近介面處的螢光分子會被激發。此方法可以有效降低實驗背景雜訊來提升訊噪比[31]。全內反射螢光顯微鏡可分為稜鏡型 (prism-type) 與物鏡型 (objective-type) 兩種。稜鏡型中入射光會經過稜鏡產生折射，使其在介面處發生全內反射；物鏡型則是透過物鏡折射，形成一較大的入射角度來產生全內反射[31]，見圖十七。本研究中所用的為稜鏡型的全內反射螢光顯微鏡。. 圖十七、全內反射螢光顯微鏡裝置示意圖。(A)、稜鏡型，(B)、物鏡型。摘錄自參考資料[21]。. 20.

(32) 2-1.4. 實驗儀器架構. 在本研究中，會以波長為 532 nm 雷射作為光源，藉由稜鏡產生全內反射，在介面處產生漸逝場，激發 Cy3 分子，使其自身釋放螢光或將能量透過螢光能量共振轉移傳遞給 Cy5 分子而令其釋放螢光。螢光再經過物鏡與濾鏡後，通過一長條狀狹縫，使成像變為長方形，接著使用兩消色差透鏡 (achromat) 放大成像。由於 Cy3 與 Cy5 所釋放的螢光波長不同，因此利用雙色鏡 (dichroic mirror) 反射 Cy3 釋放的螢光並讓 Cy5 釋放的螢光通過，來達到分離兩者的目的。Cy5 釋放的螢光再用一反射鏡將其反射。最後經由分離、反射的 Cy3 與 Cy5 螢光訊號會投至電子放大式電荷耦合器 (Electron Multiplied Charged Coupled Device, EMCCD) 進行處理，最後將影像傳至電腦進行實驗觀測。. 圖十八、實驗儀器架構示意圖。摘錄自參考資料[21]。. 21.

(33) 實驗樣品製備. 2-2 2-2.1. 實驗玻片表面化學修飾. 由於本研究需觀察 DNA 分子的結構變化，因此所用的玻片需先進行化學修飾讓 DNA 分子可以固定在玻片表面上，修飾過的玻片其結構如圖十九所示。修飾步驟如下所示 :. 1.. 取 76mm × 25 mm 石英玻片作為載玻片，並在其兩側以兩兩平行的排列方式鑽出五組孔洞. 2.. 使用甲醇、丙酮與洗碗精洗去載玻片上的雜質. 3.. 將清洗完的載玻片浸泡於去離子水中，微波加熱 5 ~ 10 分鐘. 4.. 配製食人魚試劑 ( 濃硫酸體積 : 雙氧水體積 = 3:1). 5.. 將載玻片浸泡於食人魚試劑約 30 分鐘. 6.. 取出載玻片後以去離子水沖洗. 7.. 用本生燈將洗淨的載玻片反覆加熱，直至水分蒸乾. 8.. 將載玻片和相同數量的 40 mm × 24 mm 蓋玻片分別放入染色壺中. 9.. 倒入丙酮至染色壺中，以超音波震盪器震 30 分鐘. 10.. 以去離子水清洗玻片與染色壺，並另外準備 2 個染色壺與一個錐形瓶，將所有容器倒入 3M 氫氧化鉀以超音波震盪器震 20 分鐘. 11.. 以去離子水清洗玻片與所有容器再用甲醇潤洗，倒入甲醇以超音波震盪器震 30 分鐘. 12.. 將玻片取出，以去離子水清洗乾淨，並將所有容器以甲醇潤洗後再以氮氣吹乾. 13.. 用本生燈將洗淨的載玻片反覆加熱，直至水分蒸乾；用電漿清洗機 (Harrick Plasma, PDC32G1051059) 調至中等強度清洗蓋玻片 5 分鐘，兩者清洗完畢後分別放入不同的染色壺中 22.

(34) 14.. 將 100 mL 甲醇、5 mL 醋酸與 1mL 三甲氧矽丙基乙二胺 (N-[3(Trimethoxysilyl)propyl]ethylwnwdiamine, aminosilane) 加入至錐形瓶中並搖晃均勻，倒入含有玻片的染色壺中，需將玻片淹沒. 15.. 靜至 10 分鐘，使溶液與玻片反應，再以超音波震盪器震盪 1 分鐘，再靜至 10 分鐘. 16.. 以去離子水洗淨載玻片與蓋玻片，並用氮氣吹乾. 17.. 秤取適量聚二乙醇 (mPEG-SVA, M.W. = 5000, Laysan Bio) (載玻片數量 + 0.5) × 16 mg 與生物素修飾之聚二乙醇 (biotin-PEG-SVA, M.W. = 5000, Laysan Bio) (載玻片數量 + 0.5) × 0.3 mg，並以(載玻片數量 + 0.5) × 64 μL 0.1 M 碳酸氫鈉溶解、混合均勻，最後再以冷凍離心機離心 2 分鐘. 18.. 吸取 PEG 溶液緩慢滴至載玻片兩邊孔洞中線上，再小心覆蓋上蓋玻片。每片玻片需 70 μL 的 PEG 溶液. 19.. 靜至反應 4 小時. 20.. 以去離子水清洗玻片，再以氮氣吹乾。一個載玻片與一個蓋玻片為一組分別放入至 50 mL 離心管中，並以真空包裝放入 -20℃ 冰箱保存. 圖十九、玻片表面化學修飾示意圖。摘錄自參考資料[32]。 23.

(35) 2-2.2. 樣品槽組裝. 在進行實驗前，需將經化學修飾的載玻片與蓋玻片組裝成樣品槽。首先至 -20℃ 冰箱取出待其回溫後，從真空包裝取出一組載玻片與蓋玻片。載玻片以修飾面朝上的方式，在每組平形孔洞之間黏上雙面膠做為間隔，每組平形孔洞可供樣品注入與排出。再將蓋玻片以修飾面朝下的方式對齊載玻片並與其黏合。最後使用環氧樹酯 (epoxy) 將所有空隙密封，並等待其凝固及完成樣品槽的組裝。見圖二十。. 圖二十、樣品槽組裝流程示意圖。摘錄自參考資料[21]。. 24.

(36) 2-2.3. 實驗 DNA 序列設計. 本研究 DNA 序列設計主要架構如圖二十一所示。主序列分為三部分: 5’ 端用來和 Cy3 分子反應後接合的 NH2-C6 連接鏈 (NH2-C6 linker)、目標序列與副序列互補股。副序列在其中間處標記作為受體的 Cy5 分子，在末端含有生物素 (biotin)。主要功能為將主序列固定於玻片表面上，可和主序列形成穩定的 18 個核苷酸雙股結構。本研究所使用的 DNA 序列如表二所示。. 圖二十一、實驗序列設計示意圖。. 序列名稱. 5’ 修飾. 序列. (CAG)15. NH2-C6 linker. (CAG)15 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CAG)21. NH2-C6 linker. (CAG)21 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CAG)22. NH2-C6 linker. (CAG)22 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CAG)26. NH2-C6 linker. (CAG)26 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CAG)27. NH2-C6 linker. (CAG)27 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CAG)37. NH2-C6 linker. (CAG)37 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)15. NH2-C6 linker. (CTG)15 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)21. NH2-C6 linker. (CTG)21 GCCTCGCTGCCGTCGCCA 25.

(37) (CTG)27. NH2-C6 linker. (CTG)27 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)37. NH2-C6 linker. (CTG)37 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. 副序列. biotin. TGGCGACGGCA /iCy5/ GCGAGGC. 表二、本研究所使用之 DNA 序列列表。. 26.

(38) 2-2.4. Cy3 螢光分子標記. 本研究之主序列皆在 5’ 端以 NH2-C6 連接鏈修飾。其中氨基會與 Cy3 分子上的 NHS ester 進行交聯反應 (cross-linking reaction)，使 Cy3 分子標記到 DNA 分子上。另外由六個碳組成的碳鏈長度約 2 nm，可使 Cy3 分子遠離主序列的單雙股交接處，降低其對目標序列的影響。此外，由於此碳鏈中碳原子皆以單鍵連接，使 Cy3 分子可以自由轉動。因此可假設 Cy3 與 Cy5 之間的偶極矩相對方向是隨機分布的，EFRET 值只受距離影響。Cy3 螢光分子標記步驟如下:. 1.. 秤取 0.2 mg 的 Cy3 分子於離心管，加入 35 μL、0.1M、pH = 8.6 的四硼酸鈉水溶液將其溶解. 2.. 將 Cy3 溶液溶解含有 NH2-C6 連接鏈的主序列，混合均勻後在室溫下慢速震盪 12 小時. 3.. 先加入 3.5 μL、3M 氯化鈉水溶液，再加入 -20℃、87.5 μL、99.5% 乙醇，於 -20℃ 冰箱靜置 30 分鐘. 4.. 4℃、11200rpm 條件下離心 30 分鐘. 5.. 將上清液移除，再加入 -20℃、87.5 μL、99.5% 乙醇，並靜至於 -20℃ 冰箱 30 分鐘. 6.. 再次以 4℃、11200rpm 條件下離心 30 分鐘. 7.. 將上清液移除，用氮氣小心將剩餘液體吹乾. 8.. 以去離子水將沉澱物回溶使主序列濃度為 100 μM. 27.

(39) 圖二十二、Cy3 分子與以 NH2-C6 連接鏈修飾的主序列 DNA 進行交聯反應示意圖。摘錄自參考資料[21]。. 28.

(40) 2-2.5. DNA 黏合反應與分子間二聚體去除. 為將已標記 Cy3 分子的主序列與副序列形成互補股，需進行 DNA 黏合反應 (annealing)。步驟如下 : 1.. 吸取 3 μL、100 μM 主序列、1 μL、100 μM 副序列與 16 μL T0 buffer (不含任合鹽類之 Tris buffer)，混合均勻. 2.. 使用聚合酶連鎖反應器 (Polymerase chain reaction, PCR) 將溶液加熱至 95℃，並維持六分鐘，再以每分鐘下降 1℃ 的梯度直到降至 22℃。此時主副序列會形成雙股螺旋結構，為其熱力學最穩定之構形. 然而在進行 DNA 黏合反應時，若 DNA 濃度過高會使部分 DNA 分子形成分子間二聚體 (dimer)。其會影響分子的異質性，並不利於單分子實驗觀察。為解決此問題，會將實驗樣品稀釋至 10 nM 後，並吸取 0.8 μL 與 187.2 μL T0 buffer 與 10 μL、1 M 氯化鈉水溶液與 2 μL、20 μg/μL 牛血清蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 均勻混合，配製成在氯化鈉濃度為 50 mM 下，樣品濃度為 40 pM 的溶液。放入聚合酶連鎖反應器，將溶液加熱至 50℃，再以每 12 分鐘下降 1 ℃ 的梯度直到降至 22℃。可使分子間二聚體解開而不會將主序列與副序列形成的雙股螺旋解開。此外，由於實驗樣品濃度極低，分子在溶液中相當分散，也不利分子再次形成分子間二聚體。因此可以有效除去溶液中的分子間二聚體。. 29.

(41) 2-2.6. 固定樣品於樣品槽為使樣品固定於樣品槽，本研究利用抗生物素醣蛋白 (NeutrAvidin) 和. 生物素良好的結合性，且每一抗生物素醣蛋白至多可與四個生物素的特性，讓其同時與玻片表面上和副序列上的生物素結合，以達到固定樣品的效果。再注入樣品前，需先將 0.2 μg/μL NeutrAvidin 由孔洞注入樣品槽，靜置 5 分鐘，使其能與玻片表面上生物素充分結合。再以 Tris buffer 沖洗未結合之 NeutrAvidin。再注入實驗樣品，使 NeutrAvidin 可與樣品中副序列的生物素結合，靜置時間視結合情況而定，最後再以 Tris buffer 沖洗未結合之實驗樣品。即完成固定樣品於樣品槽，見圖二十三。. 圖二十三、樣品固定於樣品槽之示意圖。摘錄自參考資料[32]。. 30.

(42) 2-2.7. 閃爍與光漂白現象. 螢光分子中的電子躍遷至單重激發態 (excited singlet state) 後，可經由震動鬆弛 (vibrational relaxation) 降至第一激發單重態 (S1) 之最低能階。之後可以釋放螢光 (fluorescence) 的方式回到基態。由於整個過程僅 10-7~10-9 秒，視其為亮態。電子亦可經由系統間跨越 (intersystem crossing) 至不同自旋的激發三重態 (excited triplet state,T1)，若以釋放磷光 (phosphorescence) 的方式回到基態。由於釋放磷光的過程不遵守選擇律 (selection rule)，所以整個過程所需的時間比螢光更久，約 10-2~10-3 秒。單位時間內可被偵測的光子數量遠低於螢光，因此視其為暗態 (dark state)，見圖二十四。在進行單分子實驗時，若發生系統間跨越，螢光分子會有閃爍 (blinking) 現象發生，不利於實驗觀測。. 圖二十四、螢光與磷光機制示意圖。摘錄自參考資料[30]。. 31.

(43) 在單分子實驗中，若長時間在高強度雷射照射之下，樣品槽中的氧分子電子組態會改變，變為具活性氧的單重態 (singlet oxygen)，能與被激發的螢光分子反應，並使其無法釋放螢光，此現象稱為光漂白 (photobleaching)，亦會干擾實驗觀察[30]，見圖二十五。. 圖二十五、螢光分子放光路徑與光漂白發生機制示意圖。摘錄自參考資料 [30]。. 32.

(44) 2-2.8. 影像緩衝溶液. 為改善閃爍與光漂白現象，實驗時需使用三重態淬熄劑並引入除氧系統。本研究使用水溶性維生素 E (Trolox)，其在紫外光的照射下與氧氣反應後會生成 Trolox quinone，可作為良好的三重態淬熄劑，見圖二十六。. 圖二十六、Trolox 形成 Trolox quinone 示意圖。摘錄自參考資料[33]。. 本研究所使用的除氧系統為葡萄糖氧化酶-過氧化氫酶系統 (glucose oxidase and catalase, GOX and CAT)。在葡萄糖氧化酶的催化下，葡萄糖會與氧氣反應形成葡萄糖內酸酯 (glucono delta-lactone) 與過氧化氫 (hydrogen peroxide)。隨後在過氧化氫酶的催化下，一當量的過氧化氫會生成一當量的水分子與半當量的氧氣。在經過兩種酵素的作用下，可有效消耗反應溶液中的氧氣，以達到除氧的效果，見圖二十七。. 圖二十七、葡萄糖氧化酶-過氧化氫酶系統作用示意圖。摘錄自參考資料 [34]。. 33.

(45) 由於本研究主要探討氯化鈉濃度對 (CAG)n 序列之影響。實驗中所使用的影像緩衝溶液，不僅需含有三重態淬熄劑與除氧系統，還需要加入氯化鈉水溶液並稀釋至所要的濃度，見表三。. 藥品名. 緩衝溶液中的濃度. Trolox. 1.55 mM. Glucose oxidase. 2170 unit/mL. Catalase. 165 unit/mL. Glucose. 0.5 (w/w). NaCl. 50 mM、100 mM、250 mM、500 mM. 表三、影像緩衝溶液所含的藥品與其最終濃度。. 34.

(46) 2-3. 數據分析與處理. 2-3.1. 數據分析. 當實驗樣品中的 Cy3、Cy5 分子經雷射激發後，產生的螢光訊號會被電子放大式電荷耦合器所接收。此外，其裝有致冷器，可將感測晶片之溫度降至 -70℃，以抑制暗電流產生進而降低雜訊。本研究使用 smCamera 軟體 (Taekjip Ha 團隊提供) 來錄製影像。設定曝光時間為每幀 (frame) 30 毫秒；放大倍率 (gain) 為 200 倍。但每錄製一幀都需啟動快門，若將啟動快門之時間一併考慮，每幀實際時間為 31.75 毫秒。本研究依錄製時間長短分為短時間紀錄 (30 幀) 與長時間紀錄 (3000 幀)。短時間紀錄前 20 幀以波長 532 nm 雷射 (綠光) 激發實驗樣品中的 Cy3 分子，使其自身釋放螢光或進行螢光共振能量轉移使 Cy5 釋放螢光；後 10 幀切換為 638 nm 雷射 (紅光) 來激發 Cy5 分子，檢測其是否可以正常釋放螢光，確保前 20 幀接收到的 Cy5 螢光訊號為有效的。長時間紀錄則是全程以綠光雷射激發實驗樣品。所得到的影像會以 IDL (Exelis Visual Information Solutions) 程序將 Cy3 與 Cy5 的訊號影像重疊，扣除背景雜訊後圈選出螢光分子對。若有兩個或以上的螢光分子過於接近，則不會圈選，以確保所圈選的皆為單分子。見圖二十八。. 35.

(47) 圖二十八、IDL 所圈選之螢光分子對。左半邊為供體 (Cy3) 影像；右半邊為受體 (Cy5) 影像。接著用 MATLAB (Matrix Laboratory, The MathWorks, Inc) 程式進行分析。為避免啟動快門與切換成紅光雷射所造成的誤差，短時間紀錄擷取第 3 幀至第 12 幀之影像，將每幀測得之 Cy3 訊號強度 (ID) 與 Cy5 訊號強度 (IA) 取平均，計算每個分子的 EFRET 值。由於 Cy3 的螢光訊號在經過雙色鏡時會有部分逸漏 (leakage)，因此所測得的 IA 一部分是由 ID 所貢獻，此現象稱為供體逸漏 (donor leakage)。因此需將計算 EFRET 值公式修正為：. 𝐸FRET =. 𝐼𝑎 − 𝛼𝐼𝑑 𝐼a + γ𝐼d. 其中，𝛼 為逸漏之修正項，約為 0.2。γ 為量子產率 (quantum yield) 的修正項[35]。本研究之 γ 值約為 1。實驗中會錄製 30 組短時間紀錄，將所計算出每個分子的 EFRET 值以 Origin (OriginLab Corporation) 軟體繪製 EFRET 值分布長條圖，見圖二十九。 36.

(48) Frequency 0.0. 0.2. 0.4. 0.6. 0.8. 1.0. EFRET 圖二十九、由短時間紀錄所得的 EFRET 值分布長條圖。. 至於長時間紀錄會將隨時間之變化之 Cy3 與 Cy5 螢光訊號記算得出每個分子隨時間之變化之 EFRET 值。最後可得到 Cy3、Cy5 螢光訊號與 EFRET 值之時間解析 EFRET 軌跡圖。若 Cy5 螢光強度與 EFRET 值驟降至 0，為發生光漂白現象，此時需將發生光漂白之後的部分剪除，以免造成偏差，見圖三十。. 圖三十、時間解析 EFRET 軌跡圖。上方為 Cy3、Cy5 螢光訊號強度隨時間變化圖。下方為 EFRET 值隨時間變化圖。. 37.

(49) 2-3.2. 擬合分析. 為探討實驗分子有無狀態變化，本研究利用 HaMMy (Taekjip Ha 團隊提供) 擬合程式，以隱馬可夫統計模型 (Hidden Markov Model, HMM) 在含有雜訊之時間解析 EFRET 軌跡圖找出其狀態變化，另外以 Baum-Welch 演算法尋找在已知的時間序列中最有可能的狀態變化與變化機率。可計算出實驗分子在此時間內有無因結構改變造成的狀態變化，見圖三十一。. 圖三十一、以 HaMMy 擬合程式分析時間解析 EFRET 軌跡圖。藍線為 EFRET 值軌跡圖；綠線為經演算所得之最有可能狀態變化。. 將 HaMMy 擬合程式分析後的結果再以 TDP (Taekjip Ha 團隊提供) 程式得出轉換密度圖 (transition density plot, TDP)。可得出狀態變化之前後 EFRET 值。並對其轉換機率 (transition probability) 做加總，再使用高斯函數 (Gaussian function) 擬合，可求出狀態變化之速率常數 (rate constant, k)，見圖三十二。. 38.

(50) 圖三十二、由 TDP 程式得出轉換密度圖與速率常數。左上為轉換密度圖，縱軸為起始 EFRET 值、橫軸為發生狀態變化後之 EFRET 值。顏色越亮代表發生次數越多。左下為將轉換密度圖以高斯函數擬合的結果。. 39.

(51) 第三章、實驗結果與討論 3-1. 實驗設計. 本研究實驗設計如圖三十三所示。將 Cy3 分子修飾在 (CAG)n 的 5’ 端；Cy5 分子修飾在副序列中間。若 (CAG)n 序列摺疊成懸垂髮夾結構，兩個螢光分子較遠，預期會產生較低的螢光共振能量轉移效率 (EFRET)。當 (CAG)n 序列摺疊成鈍端髮夾結構，此時兩者的距離較近，而使其 EFRET 值較高。因此可以藉由兩者 EFRET 值的變化來推斷 (CAG)n 序列摺疊成何種構型與構型間的轉換。. 圖三十三、單分子實驗設計。左圖為單組突出懸垂髮夾結構；右圖為鈍端髮夾結構。藍線為欲觀測 DNA 分子；綠星為 Cy3；紅星為 Cy5。修改自參考資料[21]。. 40.

(52) 3-2. (CAG)n 結構隨氯化鈉濃度變化分析. 3-2.1. EFRET 分布直方圖. 本研究以重複次數為 15、21、22、26、27、37 的 (CAG)n 序列分別在氯化鈉濃度為 50 mM、100 mM、250 mM 和 500 mM，室溫約為 22℃ 下進行實驗。所得的 EFRET 直方圖如圖三十四所示。首先在氯化鈉濃度為 50 mM 下，(CAG)15 與 (CAG)21 兩序列的 EFRET 分布最大峰值在 0.72，且當氯化鈉濃度增加時，兩者分布也往較高的 EFRET 值移動。推測當氯化鈉濃度增加時，因為 partial duplex DNA 上的負電荷被鈉離子中合而使之更為緊密導至 EFRET 略為增加。另外還有一在 EFRET 值約 0.5 至 0.6 的分布，我們初步推斷是因為 DNA 髮夾結構的莖 (stem) 部可能存在不穩定性，在尾端會有數個鹼基對被解開，而產生一個局部打開的結構，使兩個螢光標記分子距離變長。本實驗室先前研究之 (CCG)n、(CGG)n 序列亦有觀察到類似現象 [22,23]。另外發現當氯化鈉濃度越高，此一分布會逐漸減少。見圖三十四 (a)、 (b)。 (CAG)27 與 (CAG)37 兩個較長的序列分布有再往更低的 EFRET 值延展的情形。可能是序列增長時，DNA 髮夾結構會因局部不穩定而形成其它 EFRET 值更低的構型所致。同樣地，當氯化鈉濃度越高，此一分布也會逐漸減少。見圖三十四 (c)、(d)。 (CAG)22 與 (CAG)26 兩個偶數重複次數序列在 EFRET 約為 0.6 的分布一樣會隨著氯化鈉濃度增加而減少。另外 EFRET 約在 0.8 的分布在不同氯化鈉濃度下的變化不大。表示此結構受氯化鈉濃度的影響較小。見圖三十四 (e)、(f)。. 41.

(53) 42.

(54) 43.

(55) 圖三十四、(CAG)n 序列之 EFRET 分布隨氯化鈉濃度變化直方圖。(a)、 (CAG)15。(b)、(CAG)21。(c)、(CAG)27。(d)、(CAG)37。(e)、(CAG)22。 (f)、(CAG)26。 44.

(56) 3-2.2. 時間解析 EFRET 軌跡圖. 由於在 EFRET 分布直方圖中，有觀察到分布較寬且向低 EFRET 擴展。此一現象可能為構型間的變化所造成，因此我們對每個不同長度的 (CAG)n 序列在不同氯化鈉濃度下錄製時間解析 EFRET 軌跡圖並對其進行 HMM 擬合分析。奇數重複次數的 (CAG)n 序列在低氯化鈉濃度 (50 mM、100 mM) 下，發現到絕大多數的分子會在 EFRET 約在 0.55 附近與約在 0.75 附近兩個狀態轉換。見圖三十五 (a)、(b)。而在中高氯化鈉濃度 (250 mM、500 mM) 下，此動態行為明顯變少，反而開始觀察到部分分子會在 EFRET 約在 0.67 附近與約在 0.78 至 0.8 之間的兩個狀態轉換的現象。這與 (CTG)n 序列在氯化鈉濃度為 100 mM 下所觀察到的動態行為類似[20,21]。見圖三十五 (c)、(d)。偶數重複次數的 (CAG)n 重複序列在中低氯化鈉濃度 (50、100、250 mM) 下，大多數分子多半時間停留在 EFRET 約在 0.8 附近的狀態，偶有發生 EFRET 下降至約在 0.6 的狀態之後又快速回到 0.8 的狀態之現象發生。至於在較高的氯化鈉度 (500 mM) 下則較少觀察到。表示不論在何種氯化鈉濃度，偶數的 (CAG)n 序列皆可以穩定形成 EFRET 約在 0.8 的結構，且在氯化鈉濃度為 500 mM 時，會更容易維持在此結構。見圖三十六 (a-d)。. 45.

(57) 46.

(58) 圖三十五、奇數 (CAG)n 序列之時間解析 EFRET 軌跡圖。上圖的綠色與紅色線分別代表 Cy3 與 Cy5 的強度。下圖灰線為對應之 EFRET 值。紅線則為 HMM 擬合的結果。氯化鈉濃度 (a)、50 mM。(b)、100 mM。(c)、 250 mM。(d)、500 mM。 47.

(59) 圖三十六、偶數 (CAG)n 序列之時間解析 EFRET 軌跡圖。氯化鈉濃度 (a)、50 mM。(b)、100 mM。(c)、250 mM。(d)、500 mM。 48.

(60) 3-2.3. 轉換密度分析. 由於在時間解析 EFRET 軌跡圖可以觀察到奇數重複次數的 (CAG)n 序列在不同氯化鈉濃度下有不同的動態行為，因此以 HMM 擬合分析的結果做出轉換密度圖 (TDP)，見圖三十七。在 (CAG)15 與 (CAG)21 的 TDP 圖中，可以發現到當氯化鈉濃度為 50 mM 時，有兩明顯峰值:一個為 EFRET 值約從 0.55 至 0.75，另一個則是從 0.75 至 0.55。而當氯化鈉濃度逐漸增加時，峰值會越往較高的 EFRET 值靠近。另外在中高氯化鈉濃度 (250 mM、500 mM) 時，除了原本的兩個峰值外，可發現到有另外兩個新的峰值產生，其 EFRET 值變化約從 0.7 升至 0.8 與 0.8 降至 0.7。但是部分 TDP 圖呈現出兩個 EFRET 值上升的峰值與兩個 EFRET 值下降的峰值都有重疊的情形發生。 (CAG)27 與 (CAG)37 兩個較長的序列其 TDP 圖較為混亂，可能是較長的序列其髮夾結構有較多的結構多樣性，而其相互轉換較為複雜。但是當氯化鈉濃度增加時，也有往較高的 EFRET 值集中的趨勢。. 49.

(61) 圖三十七、奇數 (CAG)n 序列在不同氯化鈉濃度下之 TDP 圖。. 50.

(62) 3-3. (CAG)n 結構與 (CTG)n 結構隨氯化鈉濃度變化分析及比較為探討氯化鈉濃度對和 (CAG)n 序列相近的重複序列有無類似的影響，我們. 對重複次數為 15、21、27、37 四個的 (CTG)n 序列分別在氯化鈉濃度為 50 mM、 100 mM、250 mM 與 500 mM 下進行實驗。首先從直方圖可以觀察到四個不同長度的 (CTG)n 序列在氯化鈉濃度為 50 mM 時在 EFRET 值為 0.7 與 0.8 附近各有一峰值。隨著氯化鈉濃度越高，其在 EFRET 值為 0.7 的分布逐漸減少，這現象也與 (CAG)n 序列所觀察到的現象類似。表示當氯化鈉濃度越高，(CTG)n 序列也越傾向形成 EFRET 值較高的結構。見圖三十八 (a-d)。接著探討 (CTG)n 序列在不同氯化鈉濃度下的時間解析 EFRET 軌跡圖，大部分分子都在 EFRET 值大約為 0.70 與約 0.84 兩個狀態之間做轉換，根據本實驗室先前研究奇數重複次數 (CTG)n 序列，若形成一端突出懸垂髮夾結構，其 EFRET 值約為 0.70；若形成兩端對齊的鈍端髮夾結構，其 EFRET 值約為 0.84，且在室溫、氯化鈉濃度為 100 mM 的條件下，可以觀察到這兩種結構相互轉換 [20,21]。也發現當氯化鈉濃度增加時，轉換頻率有減少的趨勢。另外在低氯化鈉濃度 (50 mM、100mM) 下，並無觀察到類似於 (CAG)n 序列在 EFRET 值大約為 0.55 與約 0.75 兩個狀態之間轉換的動態行為。見圖三十九 (a-d)。在 TDP 圖中，無論 (CTG)n 序列的長度與氯化鈉濃度如何，皆呈現出兩個清晰的峰值，其 EFRET 值變化約從 0.70 至 0.84 與 0.84 至 0.70。此外當氯化鈉濃度增加時，兩峰值皆向較高的 EFRET 值靠近，這與 (CAG)n 序列所觀察到的類似。見圖四十。. 51.

(63) 52.

(64) 圖三十八、(CTG)n 序列之 EFRET 分布隨氯化鈉濃度變化直方圖。(a)、 (CTG)15。(b)、(CTG)21。(c)、(CTG)27。(d)、(CTG)37。 53.

(65) 54.

(66) 圖三十九、奇數 (CTG)n 序列之時間解析 EFRET 軌跡圖。氯化鈉濃度 (a)、50 mM。(b)、100 mM。(c)、250 mM。(d)、500 mM。. 55.

(67) 圖四十、奇數 (CTG)n 序列隨氯化鈉濃度變化之 TDP 圖。. 56.

(68) 而本研究發現奇數重複次數 (CAG)n 序列在低氯化鈉濃度 (50 mM、 100 mM) 下，並未如奇數重複次數 (CTG)n 在 100 mM 下觀察到鈍端結構的存在，反而觀察到 (CAG)n 序列可能會因髮夾結構莖部不穩定形成局部打開的結構，而會驟降至更低的 EFRET 值(~ 0.55)。至於在中高氯化鈉濃度 (250 mM、500 mM) 下，EFRET 值驟降的情形明顯減少，此外還出現和 (CTG)n 序列兩種髮夾結構間轉換類似的動態行為。因此推斷較高的氯化鈉濃度不僅可以穩定 (CAG)n 重複序列的髮夾結構，還使其有機會形成 EFRET 值較高的鈍端髮夾結構。同時也發現當氯化鈉濃度上升時，奇數重複次數 (CTG)n 序列的 EFRET 值分布也會上升。表示當氯化鈉濃度升高時，奇數重複次數 (CTG)n 序列也傾向形成鈍端髮夾結構。. 57.

(69) (CAG)n 與 (CTG)n 結構隨氯化鈉濃度變化之動力學. 3-4. 為了解 (CAG)n 與 (CTG)n 序列在不同氯化鈉濃度下的動力學資訊，我們由 HMM 擬合分析的結果得到其速率常數。首先探討在不同氯化鈉濃度下 (CAG)15 和 (CAG)21 兩序列因髮夾結構尾端不穩定造成開合的動力學。我們將 (CAG)n 從合上到局部打開的轉變速率常數定義為 kopen；從尾端局部打開到合上的轉變速率常數定義為 kclose。發現到當氯化鈉濃度上升時，kopen 有下降的趨勢，kclose 則變化不大，如表四與圖四十一所示 :. (CAG)15 NaCl. (CAG)21. kopen (s-1). kclose (s-1). kopen (s-1). kclose (s-1). 50 mM. 0.28. 6.19. 0.29. 6.24. 100 mM. 0.22. 5.51. 0.19. 5.05. 250 mM. 0.10. 4.74. 0.10. 5.31. 500 mM. 0.08. 6.15. 0.08. 4.52. 表四、(CAG)15、(CAG)21 在不同氯化鈉濃度下髮夾結構尾端局部開合狀態轉換之速率常數。. 圖四十一、(CAG)n 序列在不同氯化鈉濃度下髮夾結構尾端局部開合狀態轉換之速率常數折線圖。左邊為 kopen；右邊為 kclose。 58.

(70) 而在中高氯化鈉濃度 (250 mM、500 mM) 時，(CAG)n 序列開始出現懸垂與鈍端兩種髮夾結構轉換的情形。將懸垂結構轉變為鈍端結構定義為正反應 (forward)；而鈍端結構轉變為懸垂定義為逆反應 (backward)。我們求得速率常數如表五所示:. (CAG)15 NaCl. (CAG)21. kfoward (s-1). kbackward (s-1). kfoward (s-1). kbackward (s-1). 250 mM. 2.40. 0.08. 2.58. 0.09. 500 mM. 2.28. 0.07. 3.09. 0.08. 表五、(CAG)15、(CAG)21 在氯化鈉濃度為 250 mM 與 500 mM 懸垂與鈍端髮夾結構轉換之速率常數。. 然而 (CAG)15 的反應速率在氯化鈉濃度為 250 mM 和 500 mM 下並無明顯差異。我們認為在其 TDP 圖中，髮夾結構的開合與滑動兩種不同動態行為的峰值可能發生部分重疊，且 TDP 程式無法將兩者有效區隔，因此所得的速率常數可能有所誤差。此外我們僅進行氯化鈉濃度在 250 mM 與 500 mM 下的實驗，樣本數較不足，因此無法得知正逆反應速率之趨勢變化。至於 (CAG)27 與 (CAG)37 兩個較長序列的 TDP 圖較為複雜，可能有較複雜的結構變化，本論文暫無法分析其動力學資訊。最後分析 (CTG)n 在不同氯化鈉濃度下的動力學資訊，如表六與圖四十二所示。定義懸垂結構轉變為鈍端結構為正反應，鈍端結構轉變為懸垂結構為逆反應。不論重複次數多寡，當氯化鈉濃度越高，正反應速率呈現增加的趨勢，而逆反應速率呈現下降的趨勢。. 59.

(71) (a) 、kforward (s-1): NaCl. (CTG)15. (CTG)21. (CTG)27. (CTG)37. 50 mM. 4.28. 2.90. 2.35. 1.54. 100 mM. 3.99. 3.19. 1.88. 2.05. 250 mM. 7.57. 4.05. 3.95. 2.86. 500 mM. 7.47. 4.84. 3.73. 3.92. (b) 、kbackward (s-1): NaCl. (CTG)15. (CTG)21. (CTG)27. (CTG)37. 50 mM. 3.91. 2.54. 1.92. 1.19. 100 mM. 2.72. 1.92. 1.18. 1.01. 250 mM. 2.43. 0.94. 1.20. 0.91. 500 mM. 0.49. 0.36. 0.70. 0.80. 表六、(CTG)n 序列在不同氯化鈉濃度下懸垂與鈍端髮夾結構轉換之速率常數。(a)、正反應速率。(b)、逆反應速率。. 圖四十二、(CTG)n 序列在不同氯化鈉濃度下懸垂與鈍端髮夾結構轉換之速率常數折線圖。左邊為正反應速率；右邊為逆反應速率。. 60.

(72) 3-5. 氯化鈉濃度對 (CAG)n 與 (CTG)n 髮夾結構穩定性影響為探討氯化鈉濃度對 (CAG)n 與 (CTG)n 兩序列之髮夾結構的影響，我們將. 正反應速率除以逆反應速率求出平衡常數後，帶入吉布斯自由能 (Gibbs free energy) 與平衡常數之關係式求其自由能變化量，如下式所示:. ∆G = −RTln(K). 由表七與圖四十三發現到，當氯化鈉濃度上升，(CAG)15 與 (CAG)21 髮夾結構尾端開合之平衡常數亦會上升，自由能變化量則會下降。由於鈉離子可以中和 DNA 中磷酸根離子的負電排斥力，因此當鈉離子濃度越高，DNA 分子鹼基的配對會更加穩定。在本研究中鈉離子可以穩定 (CAG)n 序列的髮夾結構，因此在較高的氯化鈉濃度下，較不易發生尾端局部打開的現象。先前亦有文獻指出當氯化鈉濃度升高時，越有利於穩定短鏈 DNA 分子的雙股結構[36–38]。而在氯化鈉濃度為 250 mM 與 500 mM 下，具有懸垂與鈍端髮夾結構轉換之動態行為，且在 500 mM 下其自由能較低，顯示在高氯化鈉濃度下其更傾向於鈍端髮夾結構，見表八。另外，隨著氯化鈉濃度上升，(CTG)n 序列構形轉換之平衡常數有增加的趨勢，而自由能變化量有降低的趨勢。也顯示氯化鈉濃度越高，越傾向於鈍端髮夾結構，這與 (CAG)n 序列所觀察到的現象相同，見表九與圖四十四。. 61.

(73) (CAG)15. (CAG)21. NaCl K. ΔG (kJ/mol). K. ΔG (kJ/mol). 50 mM. 22.44. -7.63. 21.72. -7.55. 100 mM. 25.46. -7.94. 26.16. -8.01. 250 mM. 48.43. -9.52. 53.54. -9.76. 500 mM. 84.83. -10.89. 59.59. -10.03. 表七、(CAG)15 與 (CAG)21 髮夾結構尾端局部開合之平衡常數與自由能變化量。 -6. (CAG)15. ∆G (kJ/mol). (CAG)21. -8. -10. -12 0. 100. 200. 300. 400. 500. [NaCl] (mM) 圖四十三、氯化鈉濃度與 (CAG)15 與 (CAG)21 髮夾結構尾端局部開合自由能變化量關係折線圖。 (CAG)15. (CAG)21. NaCl K. ΔG (kJ/mol). K. ΔG (kJ/mol). 250 mM. 29.40. -8.29. 27.30. -8.11. 500 mM. 31.14. -8.43. 40.87. -9.10. 表八、(CAG)15 與 (CAG)21 懸垂與鈍端髮夾結構轉換之平衡常數與自由能變化量。. 62.

(74) (CTG)15. (CTG)21. NaCl K. ΔG (kJ/mol). K. ΔG (kJ/mol). 50 mM. 1.09. -0.22. 1.14. -0.36. 100 mM. 1.47. -0.94. 1.66. -1.25. 250 mM. 3.16. -2.79. 4.24. -3.57. 500 mM. 15.31. -6.69. 13.44. -6.37. (CTG)27. (CTG)37. NaCl K. ΔG (kJ/mol). K. ΔG (kJ/mol). 50 mM. 1.23. -0.50. 1.29. -0.63. 100 mM. 1.59. -1.13. 2.03. -1.74. 250 mM. 3.29. -2.92. 3.15. -2.81. 500 mM. 5.32. -4.10. 4.88. -3.89. 表九、(CTG)n 序列懸垂與鈍端髮夾結構轉換之平衡常數與自由能變化量。 2. (CTG)15 (CTG)21 (CTG)27. ∆G (kJ/mol). 0. (CTG)37 -2. -4. -6. -8 0. 100. 200. 300. 400. 500. [NaCl] (mM) 圖四十四、氯化鈉濃度與 (CTG)n 序列懸垂與鈍端髮夾結構轉換自由能變化量關係折線圖。 63.

(75) 在相同重複次數的 (CAG)n 序列中，鈍端髮夾結構由三個核苷酸組成的環加上 (n-1) 個 C-G 鹼基對與. 𝑛−1 2. A-A 錯誤配對所構成。而懸垂髮夾結構包含四. 個核苷酸組成的環加上 (n-2) 個 C-G 鹼基對與. 𝑛−3 2. A-A 錯誤配對。由於鈍端. 結構比懸垂結構各多出一組 C-G 鹼基對與 A-A 錯誤配對，其氫鍵數目較多，莖狀部分較懸垂結構穩定。然而其環狀部分由三個核苷酸組成，因其張力較大，穩定性比懸垂結構中四個核苷酸組成的環低[27]。此外，懸垂結構由於多出一組突出的 CAG 序列，其對稱性較鈍端結構低，因此其熵值較高。以上因素皆會影響髮夾結構整體的自由能，進而影響其會傾向何種髮夾結構。由於 A-A 錯誤配對較 T-T 錯誤配對不穩定[39]，在低氯化鈉濃度時， CAG:CAG 配對無法維持三個核苷酸組成的環狀結構，因此 (CAG)n 序列傾向形成懸垂髮夾結構，且可能在尾端會發生短暫地局部打開現象。然而當氯化鈉濃度升高時，會使 CAG:CAG 反平行配對的穩定作用力增強，除了使其局部打開的現象減少之外，還能維持三個核苷酸組成的環狀結構而有機會形成鈍端構形，因此可以觀察到類似於 (CTG)n 序列的結構轉換行為，見圖四十五。此外，由於鈍端結構比懸垂結構多出一組 C-G 鹼基對與錯誤配對，且從鈍端結構轉換至懸垂結構所需解開的鹼基配對較多[20,21]，當氯化鈉濃度升高時，兩因素皆不利於鈍端結構轉換至懸垂結構，因此 (CAG)n 與 (CTG)n 序列會越傾向形成鈍端髮夾結構。. 64.

(76) 圖四十五、氯化鈉濃度對奇數重複次數 (CAG)n 序列動態結構轉換影響之示意圖。. 65.

(77) 第四章、結論與未來展望本研究以氯化鈉濃度為操縱變因，在其濃度為 50 mM 與 100 mM 下，發現到 (CAG)n 序列會形成懸垂髮夾結構，且髮夾結構莖部可能會因其鹼基配對作用力不穩定而使其尾端局部打開。而在氯化鈉濃度為 250 mM 與 500 mM 下，尾端局部打開之反應速率下降，乃是因為鈉離子可以使鹼基配對作用力更加穩定所致。除此之外也可觀察到奇數重複次數的 (CAG)n 序列在較高氯化鈉濃度時具有類似於 (CTG)n 序列的動態結構轉變。並且發現當氯化鈉濃度升高時，會使系統的自由能下降。表示氯化鈉濃度越高，(CAG)n 序列越傾向形成鈍端髮夾結構。另外我們也對奇數重複次數的 (CTG)n 序列在不同的氯化鈉濃度進行實驗。發現到當氯化鈉濃度增加時，正反應速率呈現增加的趨勢，而逆反應速率呈現減少的趨勢。所求得的 ΔG 亦下降，此結果與 (CAG)n 序列類似。我們認為因為鈍端結構含有較多的鹼基對，另外由懸垂結構變至鈍端結構需解開的鹼基配對較多，因此在較高的氯化鈉濃度下不利於逆反應的進行，使得兩者皆傾向形成鈍端結構。未來若更深入探討氯化鈉濃度對 (CAG)n 序列動態結構轉變之影響，需再增列本研究未設定的氯化鈉濃度條件，以得到更詳細的資訊。亦可進行變溫實驗並透過吉布斯自由能方程式 (Gibbs-Helmholtz equation) 求得焓變化量 (change in enthalpy, ΔH) 與熵變化量 (change in entropy, ΔS)，以得知更多熱力學資訊。. 66.

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