1-1 前言
微衛星 (Microsatellites) 序列是一種由一到六個鹼基對為最小重複單位組 成的序列，又被稱為短串連重複 (short tandem repeats，STR) 序列或是簡單重複 序列 (simple sequence repeats，SSRs)。其普遍存在於原核生物與真核生物的基因 組中，且分布甚廣，不論在基因間區段 (intergenic regions) 還是開放閱讀框 (open reading frames，ORFs) 皆有微衛星序列的存在[1]。
三核苷酸重複序列 (trinucleotide repeats，TNRs) 是一種特殊的微衛星序列。
當某些在特定基因位置上的三核苷酸重複序列長度超過一定程度時，會使本身結 構不穩定，讓序列持續擴張，最後導致三核苷酸重複序列擴張疾病 (triplet repeat expansion diseases, TREDs)。此類疾病約莫有 20 多種。大部分屬於神經退化性 疾病 (Neurodegenerative Disease，ND) 或神經肌肉疾病 (Neuromuscular Disorders，
NMD)，見圖一。而這些疾病具有遺傳早現 (anticipation) 的現象: 當遺傳疾病傳 給下個世代時，發病年齡會越早且病症會更加嚴重[1–3]。
圖 一、三核苷酸重複序列與其會導致的遺傳疾病。摘錄自參考資料[3]。
其中有許多疾病由 CAG 重複序列不正常擴張所引起。如表一所示。包括亨 丁頓舞蹈症 (Huntington’s Disease)、脊髓性小腦萎縮症 (Spinocerebellar ataxia, SCAs) 第一、二、三、六、七、十七型 (SCA1,2,3,6,7,17)、齒狀紅核蒼白球肌萎 縮 症(Dentato-rubro-pallido-luysian atrophy, DRPLA) 、 脊 髓 延 髓性 肌肉 萎 縮症 ((Spinal and Bulbar Muscular Atrophy, SBMA) 又 稱 為 甘 迺 迪 氏 症 (Kennedy Disease)。上述疾病的主要症狀有小腦共濟失調、感官退化、認知能力下降等。
脊髓性小腦萎縮症第二型 (SCA2) 被認為和漸凍症 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 與帕金森氏症 (Parkinson's disease) 有關[4,5]。
以亨丁頓舞蹈症 (Huntington’s Disease) 為例，正常情況下，CAG 重複序列 重複次數為9-36，若重複次數大於 37 就有可能會發病，且重複次數越多發病年 齡就越小，症狀也會更嚴重。
這些病症被通稱為多聚谷氨酰胺疾病 (Polyglutamine Disease, PolyQ Disease)。
這是因為 CAG 重複序列擴張，使轉譯出的蛋白質含有聚谷氨酰胺 (PolyQ)。此
表 一、由 CAG 重複序列擴張所引起的疾病。摘錄自參考資料[4]。
1-2 多聚谷氨酰胺疾病致病原因
當 CAG 重複序列經過轉錄與轉譯後，會生成多聚谷氨酰胺單體 (PolyQ monomer)。如圖二所示，含有多聚谷氨酰胺單體的蛋白質可能會形成 β 摺疊 (β sheet) 的結構。數個單體會藉由分子間氫鍵形成低聚體 (oligomer)，隨後會產生 聚集 (aggregation) 現象，最後生成包含體 (inclusion)。CAG 重複序列的重複次 數越多，轉譯出的多聚谷氨酰胺單體越長，形成分子間氫鍵的機率越高，也就越 容易有聚集現象。此外，不論是單體、低聚體或包含體都可能具有細胞毒性。這 些結構的主要毒性作用包括轉錄失調、泛素-蛋白酶體系統損壞、粒線體功能障 礙，細胞內鈣離子濃度失調，軸突運輸受損，進入細胞核中會產生基因毒性作用 等[6,7]。
圖 二、PolyQ 低聚體、包含體的生成與其細胞毒性。摘錄自參考資料 [6]。
1-3 非典型 DNA 二級結構
造成序列擴張的原因是序列本身會形成非典型 DNA 二級結構，使得重複序 列整體不穩定，會有滑動 (slippage) 的情形，因而造成重複序列擴張[8]。圖二列 舉出幾種非典型 DNA 二級結構。其中 (CNG)n 重複序列 ( N 可為 A, T, C, G ) 可以藉由錯誤鹼基配對 (mismatch base pairs) 形成髮夾 (hairpin) 結構。以 CAG 重複序列為例，其本身可以藉由 C-G 鹼基對與 A-A 錯誤鹼基配對形成髮夾結 構。
圖 三、DNA 二級結構示意圖。(a)、髮夾 (hairpin) 結構。(b)、鳥嘌呤四 聚體 (G-quardplex) 結構。(c)、雙股 DNA 髮夾結構。(d)、H DNA 和 sticky DNA 結構。(d)、解旋 (unwinding) 結構。摘錄自參考資料[8]。
1-4 重複序列擴張
板，以半保留複製 (semiconservative replication) 方式進行複製。由於 DNA 聚合 酶在複製時聚有方向性，在領先股 (leading strand) 可以連續複製，但在延遲股圖 四、DNA 複製過程中造成重複序列擴張和收縮示意圖。圓圈為 DNA 聚合酶、紅線部分為重複序列、綠線部分為重複序列的互補股、粉紅線部 分為岡崎片段的引子。摘錄自參考資料[8]。
若 DNA 因為氧化自由基的破壞，產生一個小缺口，正常情況下，皮瓣核酸 內切酶 (flap endonuclease 1, FEN1) 會由 5’ 端移動至 3’ 端，將皮瓣給移除。然 而若當中有包含重複序列，皮瓣核酸內切酶會將皮瓣摺疊成類似髮夾結構的形狀。
接著由於 MSH2-MSH3 兩種錯誤配對修復蛋白所形成的異二聚體 (heterodimer) 會與 DNA 髮夾結構的錯誤鹼基配對產生穩定的交互作用力，可使髮夾結構在移 除皮瓣的過程中保留下來，最後使 DNA 序列擴張[8]，見圖五。
圖 五、DNA 修復過程中造成重複序列擴張示意圖。(a)、DNA 受到氧化 自由基破壞。(b)、FEN1 將皮瓣折疊成一類似髮夾結構的形狀。(c)、
MSH2-MSH3 與髮夾結構產生穩定的交互作用力。(d)、髮夾結構於修復過 程中被保留下來。(e)、DNA 重複序列擴張。摘錄自參考資料[8]。
而 DNA 重組過程中也有機會造成序列擴張。其是由兩條雙股 DNA 以不 平等交換重組 (unequal crossing over recombination) 的方式進行擴張，見圖六 (a)。
此外，在 DNA 複製過程中亦會發生重組，如圖六 (b)。若在延遲股模板鏈的重 複序列形成髮夾結構時，會阻礙複製叉，而造成雙股斷裂，使 DNA 序列重組。
首先會將延遲股模板鏈上的重複序列切除，在 3’ 端處形成單股延長的 DNA，
再侵入領先股並進形重組，進而使重複序列擴張或縮短[8]。
圖 六、DNA 重組過程中造成重複序列擴張和收縮示意圖。(a)、不平等交 換過程造成重複序列擴張與收縮。藍線與灰線互為同源染色體，紅線為重 複序列、綠線為其互補股。(b)、DNA 複製過程中，發生重組現象造成重 複序列擴張。紅線為重複序列，綠線為其互補股。摘錄自參考資料[8]。
1-5 CAG 重複序列髮夾結構
1998 年，Goutam Gupta 研究團隊使用 NMR 光譜、膠體電泳方法得出 (CAG)5、(CAG)6 兩種序列的結構。發現兩者接形成兩端對齊的髮夾結構，不同 的地方在於環狀部分。(CAG)5 環狀部分由三個核苷酸組成，而 (CAG)6 的環狀 部分則是由四個核苷酸組成[10]。此結果與其先前解出的(CTG)5、(CTG)6 的結果 相同[11]，見圖七。
圖 七、(CAG)5、(CAG)6 序列結構示意圖。摘錄自參考資料[10]。
先前也有許多文獻探討在三核苷酸重複序列中，奇數或偶數的重複次數對結 構的影響[12–18]。若重複次數為奇數，會形成兩端對齊、三個核苷酸組成環狀部 分的髮夾結構；若重複次數為偶數，會形成兩端對齊，但環狀部分由四個環構成 的髮夾結構，見圖八。
圖 八、奇數與偶數重複次數 (CNG)n 序列所形成的髮夾結構示意圖。摘錄 自參考資料[18]。
2012 年，Delaney 的研究團隊以化學探針分析 (chemical probe analysis)。
奇數重複次數的 CAG 重複序列會形成四個核苷酸組成環狀部分，並在 3’ 端 或 5’ 突出一組 CAG 序列的髮夾結構[19]，見圖九。
圖 九、奇數重複次數 CAG 重複序列形成四個核苷酸組成環狀部分，並在 3’ 端或 5’ 突出一組 CAG 序列的髮夾結構。摘錄自參考資料[19]。
1-6 (CTG)
n序列結構與 動力學模型
圖 十、偶數與奇數重複次數的 (CTG)n 結構示意圖。修改自參考資料 [20]。
圖 十一、懸垂結構轉換至鈍端結構轉換機制示意圖。摘錄自參考資料 [21]。
圖 十二、鈍端結構轉換至懸垂結構轉換機制示意圖。摘錄自參考資料 [21]。
1-7 研究動機
在三重複核苷酸序列中，由 CAG 重複序列不正常擴張所引起的遺傳疾病是 這當中最多的。且這些遺傳疾病並沒有有效的治療方法。為了瞭解三重複核苷酸 序列的擴張機制，本實驗室先前用單分子螢光共振能量轉移光譜，研究不同長度 的 (CAG)n、(CTG)n、(CCG)n 和 (CGG)n 序列。發現奇數的 (CTG)n、(CCG)n 和 (CGG)n 序列都觀察到懸垂與鈍端兩種結構的轉換，並且得知其動力學資訊[20–
23]。
然而奇數的 (CAG)n 序列並沒有發現鈍端髮夾結構。因此推測可能原因是 A-A 錯誤配對形成的自由能較高，使 CAG:CAG 配對的穩定作用力較小，無法 維持由三核苷酸組成較不穩定的環狀結構。至於偶數的 (CAG)n 序列，較長的重 複次數可以觀察到形成穩定的鈍端結構，與另外三種序列結果相同[20,24–27]。
為了驗證我們的推測，我們利用調控氯化鈉濃度來調整 CXG:CXG 反平行 配對的穩定性，利用單分子螢光共振能量轉移光譜，探討奇數重複次數的 (CAG)n
序列結構變化，並進行動力學與動態學分析。期望藉由改變鹽類濃度，三重複序 列的結構與滑動現象對鹽類的依存性[20]。