1 細胞培養(Cell culture)
1.1 細胞培養液成分
人類肺腺癌細胞(Human Lung Adenocarcinoma；CL1 series cell lines)的完 整培養液成分為 RPMI1640，含有 10%的胎牛血清(Fetal Bovine Serum；
FBS)與 1% PS (Penicillin and Streptomycin)，冷凍保存液成分為 90%完整 培養液加上10% DMSO，含有 ALA 的培養液成份為無酚紅且無血清的 RPMI1640。
1.2 CL1 系列細胞取得後處理方式
人類肺腺癌細胞(Human Lung Adenocarcinoma；CL1 series cell lines)以培 養盒取得後將細胞以PBS 清洗一次，加入 0.5 ml 1X Trypsin 作用一分 鐘，於倒立式顯微鏡觀察細胞，待大部分細胞懸浮後，加入 4.5 ml 的完 整培養液混合均勻後以適當比例換置到新的培養盒中以800 rpm 離心五 分鐘後去除上清液，將細胞重新懸浮在 10 ml 的完整培養液中轉置於 75 cm2培養皿中做繼代培養，並以液態氮保存較年輕代數的細胞。
1.3 CL1 系列細胞解凍與冷凍方式
將細胞由液態氮中取出後在37℃水浴中迅速解凍，以 70%酒精擦拭管壁 與管口後在無菌操作台內以無菌吸管吸出細胞溶液，慢慢加入含有 40 ml 完整培養液的離心管中，以 800 rpm 離心 5 分鐘後去除上清液，加入 10 ml 完整培養液後使細胞懸浮後放置於 75 cm2的培養盒中，以37℃、
5% CO2 且濕潤的培養箱中做培養；細胞做冷凍保養時，先將細胞由培
養盒中以 1X Trypsin 打下後以 800 rpm 離心五分鐘後去除上清液，加入 冰冷的冷凍保存液並使細胞懸浮其中，取1 ml 分批置於滅菌過的抗凍管 中，先在-20℃置放 30 分鐘後，放在-80℃置放隔夜，再放在液態氮筒中 做長期保存。
1.4 CL1 系列細胞繼代培養方式
在 75 cm2的培養盒中種約5×105個細胞，加入10 ml 完整培養液，約三 天鄰近細胞邊緣貼近時以PBS 清洗一次，加入 0.5 ml 1X Trypsin，作用 約一分鐘後輕拍培養盒使細胞脫離培養盒後加入4.5 ml 的完整培養液，
計數細胞後在回種細胞至培養盒中，以 5% CO2、37℃濕潤的培養箱進 行繼代培養。
1.5 細胞計數
取細胞懸浮液10 μl 以等體積 Tryphan blue 加入混合均勻後取 10 μl 到細 胞計數器，計算如附圖(九)。
附圖(九) 細胞計數器與細胞計數方式
Counting chambers
Cover glass Properly loaded
A、B、C 與 D 四個角落的細胞數，細胞的濃度能藉由下列公式算出：
四個方塊全部的細胞數 每毫升細胞數量＝
2 ×104
2 藥品配置 (Drug Prepare)
2.1 ALA 的配置—將粉末狀的 ALA 以滅菌去離子水溶解，最終保存濃 度為1 M，實驗中以 RPMI1640 稀釋成實驗所需的濃度。
2.2 CP971P 的配置—將粉末狀的 CP971P 以滅菌去離子水溶解，最終保 存濃度為1%，實驗中以 RPMI1640 稀釋成實驗所需的濃度。
3 以流式細胞儀分析 CL1-0 與 CL1-2 細胞中 PpIX 的生成量(The PpIX intensity measurement in CL1-0 and CL1-2 cells by Flow Cytometry)
3.1 加入不同濃度五氨基酮戊酸與細胞共同培養
種 2×105個細胞在 6 well 的 plate 中，37℃、5% CO2培養 24 小時後以 PBS 清洗一次，加入 1 ml 含有 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mM ALA 的無血 清、無酚紅的 RPMI1640 培養 3 小時後，與對照組(不加 ALA，培養 3 小時)以 0.1 ml 1X Trypsin 將細胞切下來後加入 1 ml 含有 10% FBS 的 RPMI1640，混合均勻後以流式細胞儀(COULTER® EPICS® XL-MCLTM Flow Cytometer)計數一萬顆細胞內 PpⅨ螢光強度的平均值，儀器條件如 下 ： 激 發 光(Excitation Wavelength) 為 488 nm ， 放 射 光 (Emission Wavelength)為 FL3：620 band pass (605-635 nm)，相關文獻指出，藉由 流式細胞儀測量 PpIX 的螢光含量會隨著儀器不同而有所差別，其單位 為 a. u. (Arbitrary Units)，而得到的平均值為相對而非絕對值。
3.2 測量不同時間點的 PpIX 累積量
種 2×105細胞在6 well 的 plate 中，以 37℃、5% CO2培養24 小時後 PBS 清洗一次，加入 1 ml 含有 1 mM ALA 的無血清、無酚紅的 RPMI1640 陪養 1、2、3、4、8 小時後，與對照組(不加 ALA，培養 8 小時)後如 3.1 的操作步驟以流式細胞儀做分析。
4 光動力處理(Photodynamic treatment)
4.1 不同光照強度處理
第一天先將細胞種在96 well plate 中，細胞密度為 6000 cells/well，培養 隔夜後，將細胞以 PBS 清洗一次，將完整培養液換成含有 1 mM ALA 無血清、無酚紅的 RPMI1640，置於培養箱中避光培養固定時間後，以 635±5 nm，輸出功率為 60 mW 的 LED 光源照射不同焦耳數，光照 17 秒的能量約為 1 J/cm2，而2 J/cm2的光照時間約為34 秒，依此類推，在 本實驗中處理的光照強度分別為0、3、6、12 及 18 J/cm2。
4.2 細胞與不同濃度 ALA 培養後以 PDT 處理
實驗操作如4.1，將細胞以不同濃度 ALA 培養固定時間後，以相同光照 強度 6 J/cm2處理，以觀察不同濃度的ALA 對於細胞存活率的影響。
4.3 細胞培養不同時間後以 PDT 處理
實驗操作如4.1，將細胞以固定 ALA 濃度與光照劑量，培養時間分別為 3 與 8 小時，觀察細胞對不同時間點處理後的存活率。
5 粒 線 體 去 氫 酶 活 性 測 量 (The assay of Mitochondrial dehydrogenase activity；MTT assay)
本實驗方法為測量細胞中粒線體去氫酶(Mitochondrial dehydrogenase)的 活性，來估算出細胞存活率，其基本原理如附圖(十)，MTT 能與粒線體 去氫酶反應，產生紫色的 Formazen。當細胞粒線體經由外在因素遭受破 壞後，粒線體去氫酶受到影響，導致代謝 MTT 的能力降低，因此我們 可以藉由 Formazen 的生成量來推算出粒線體去氫酶的活性，Formazen 能溶於 DMSO 中，再由 570 nm 的 ELISA reader 測量得吸光值後，粒線 體去氫酶活性則以下列方式計算：
A570(Test)
Dehydrognease activity (%) =
A570(Control)
×100%
附圖(十) MTT assay 的作用原理
細胞粒線體中的去氫(Dehydrogenase)能與 MTT 反應，作用中會將 NADPH 氧化成 NADP+， 而 將 黃 色 的 MTT reagent 還原成紫色的 Formazan，再將 Formazan 以 DMSO 溶解後，於 ELISA reader 測定其於 570 nm 的吸收值。
6 統計方法 (Statistical analysis)
所有實驗數據皆以平均值±標準誤差(Mean ± Standard Error)所表示，並 且使用Student’s t-test 雙尾 t 檢定法與單因子變異數統計分析法(ANOVA) 比較組間是否有意義的差異性存在，當P＜0.05 時視為有意義的統計。