一 、 動 物
使用 Wistar 雄性大白鼠，體重約 180-220 公克。購自國家實驗動物 繁殖及研究中心。飼養環境維持溫度 22 ± 3
°
C，相對溼度 55 ± 5 % ，明、暗各十二小時的環境。餵食標準飼料(福壽公司)，飲水經過逆滲透處理。
二 、 四 氯 化 碳 誘 發 慢 性 肝 毒 性
實驗前將大鼠分四組，每組十隻，一為控制組不投予 CCl4，其餘 三組實驗組每週兩次口服投予 CCl4 (20 %，0.2 ml/rat )，為期八週。其 中兩組每日口服投予牛磺酸(購自 ACROS ORGANICS；400、800 mg/kg) 水溶液，另一組僅投予 RO 水(逆滲透水)。第八週時，犧牲大鼠，解剖 取出肝臟及脾臟稱重。肝最大葉分三部分，第一部分固定於 10 % 中性 福馬林溶液中供病理切片觀察，第二部分稱重後烘乾供膠原蛋白含量測 定，第三部分快速冷凍於液態氮供 mRNA 的抽取。其餘肝臟依解剖相 關位置分成四袋，儲存於 -80°C，供脂質過氧化、抗氧化酵素活性及西 方墨點法等實驗測定。
三 、 肝 功 能 之 測 定
將採取收集的血液靜置，於 4
°
C 離心十分鐘(3,000 rpm)。取上層 血清以自動生化儀(COBAS MIRA Plus; Roche)檢測麩氨酸草乙酸轉氨?(GOT)、麩氨酸草丙氨基轉氨? (GPT)、總蛋白(total protein)。
使用 Roche 公司的生化測定試劑(test kits) :
AST (GOT ; glutamate oxaloacetate transaminase ): Art. 0736414 ALT (GPT ; glutamate pyruvate transaminase ): Art. 0736384
四 、 羥 脯 氨 酸 (hydroxyproline)含 量 測 定
Hydroxyproline 的含量測定是依照 Neuman and Logan (1950)的方 法。將肝組織秤取約 600 mg 切成細長條狀於 100
°
C 烘箱中隔夜乾 燥。秤取乾燥肝臟組織約 200 mg 放於試管中，加入 5 ml 的 6 N HCl，於 100
°
C 烘箱中放置 16 小時水解之。 冷卻後取 1 ml 水解物以 10,000 rpm 離心 30 分鐘。取 0.2 ml 標準品 hydroxyproline 或上清液加 至 0.2 ml 的 6 N NaOH 中和水解物，之後加入 0.6 ml 水。加 1 ml 新 鮮配置 0.01 M 的 CuSO4 至試管內，取 1 ml 2.5 N NaOH、1 ml 6%H2O2 先後加入試管內，震盪混合 5 分鐘後，加熱和振搖可破壞過多的 過氧化物。取出以冰水冷卻，加入 2 ml 之 5 % p-dimethyl amino- benzaldehyde 及 4 ml 之 3 N H2SO4 振盪均勻，於 70°C 水浴 16 分 鐘，以冰水冷卻至室溫，以分光光度計(HITACHI U-2001; Japan) 於 540 nm 測定吸光值。利用純品 hydroxyproline 當作標準，以多重校正曲線 計算 hydroxyproline 的含量。 hydroxyproline 的含量以 µg/g wet liver 表示。
五 、 肝 臟 脂 質 過 氧 化 (lipid peroxidation) 之 測 定
依據 Ohkawa et al. (1979)的方法測定脂質過氧化。取肝組織 1 g 加 10 ml KCl (1.15 %)溶液，以均質機均質化。取 0.2 ml 均漿順序加入 0.2 ml sodium dodecyl sulfate (8.1 %)、1.5 ml acetic acid (20 %)，並以 NaOH 調整酸鹼度(pH 3.5)。加入 1.5 ml 2-thiobarbituric acid (0.8 %)，再以去離 子水調整容積為 4 ml，99
°
C 熱水中加熱一小時。取出，以冰水冷卻，加入 1 ml 去離子水及 5 ml 的 n-butanol/pyridine 混合溶液(15:1,v/v)，劇 烈震盪均勻後，在 25°C 離心 10 分鐘(4,000 rpm)，取有機層以分光光 度計(HITACHI U-2001; Japan)於 532 nm 測定吸光值，以多重校正曲線
計算濃度。肝組織的脂質過氧化量以 nmol malondialdehyde (MDA)/mg protein 表示。同時依照 Lowry 等人(1951)所述的方法，測定肝組織蛋 白含量，以牛血漿蛋白(Bovine serum albumine, BSA)為標準品。
六 、 肝 臟 Glutathione (GSH)含 量 測 定
實驗依照 Sedlak and Lindsay (1968)的方法。取肝組織 0.4 g 加 16 ml EDTA (0.02 M)溶液，以均質機質化。取 5 ml 肝均漿順序加入 4 ml 蒸餾水、1 ml trichloroacetic acid (50 %)，震盪混合均勻，離心 15 分鐘 (3,000 xg)。取上清液 2 ml 加入 4 ml Tris buffer 與 0.1 ml 5,5’- dithio - bis (2-nitro benzoic acid) (0.36 % in methanol)，混合均勻後以分光光度計 於 412 nm 測 定 吸 光 值 ， 以 多 重 校 正 曲 線 計 算 濃 度。 肝 組 織 的 glutathione 以 µmol/g wet liver 表示。
七 、肝 臟 超 氧 化 物 歧 化 ? (superoxide dismutase ; SOD)活 性 測 定 實驗參照 Marklund (1974)等人所描述之方法進行，取肝組織 0.5 g，加入 5 ml buffer (0.32 M sucrose、1 mM EDTA、10 nM Tris-HCl，pH 7.4)，以均質機均質化，高速離心 30 分鐘(13,600
×
g、4°
C)。取上清液 稀釋，稀釋液取 50 µl，再加上 100 µl Tris buffer (pH 8.2，50 mM)、去 離子水 830 µl，最後加入 20 µl pyrogallol (10 mM)，混合均勻後，於 420 nm 測量吸光值。每隔 40 秒測量一次，共測量 5 分鐘，計算每分鐘吸 光值變化速率。以多重校正曲線計算濃度。SOD 活性以單位時間內抑 制 pyrogallol 自動氧化速率達 50 % 時的量，為一單位(U)。組織內 SOD 活性以 U/mg protein 表示。八 、 肝 臟 過 氧 化 氫 ? (catalase)活 性 之 測 定
實驗參照 Aebi (1984)所描述之方法進行。取肝組織 0.5 g 加入 5 ml 磷酸鹽緩衝液(Na2HPO4 0.01 M，NaH2PO4 0.01 M，NaCl 2 M，pH 7.4)，以均質機均質化，離心 10 分鐘(700
×
g，4°
C)，取上清液 0.9 ml 加 入 0.1 ml Triton X-100 (10 %)，混合均勻。取混合液以磷酸鹽緩衝液(50 mM，pH 7.0)稀釋，將 4 ml 稀釋液加入 2 ml H2O2 (30 mM)，混合均勻 後於溫控 25°C、波長 240 nm 條件下測吸光值，每隔 5 秒測量一次，時間總共 1 分鐘。計算求得反應速率常數 K (1/min)。組織 catalase 活 性以 K/mg protein 表示。
K = (2.3/Δt) logA1/A2 Δt :時間間隔(分鐘)。
A1 : T1時間，檢品之吸光值。
A2 : T2時間，檢品之吸光值。
九、肝臟麩胱? 過氧化? (Glutathione peroxidase ; GSH-Px)活性之測定 實驗參照 Hafeman 等人(1974)所描述之方法進行，取肝組織 0.5 g 加 5 ml buffer (0.32 mol/L sucrose、 1 m mol/L EDTA 、 10 nmol/L Tris-HCl，pH 7.4)，以均質機均質化，高速離心 30 分鐘 (13,600
×
g、4°
C)。取上清液稀釋。稀釋液取 0.4 ml 加入 0.4 ml glutathione (1 mM )，置於 37°C 水浴加熱 3 分鐘。之後再加入 H2O2 0.2 ml，置於 37
°
C 水 浴加熱 5 分鐘。然後迅速置於冰中冷卻。冷卻後加入 4 ml 偏磷酸鈉溶 液(偏磷酸鈉 0.635 %，NaCl 30 %，EDTA 0.2 % )，混合後以 3,000 rpm 離心 10 分鐘。取上清液 2 ml，加入 2 ml Na2HPO4 溶液(0.4 M)與 1 ml 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) (0.04 %，sodium citrate 1 %)溶液，混 合均勻後於 412 nm 測量吸光值，以多重校正曲線計算濃度。另外測量 非酵素所造成 GSH 的氧化，其步驟與測量酵素反應步驟相同，兩者差別只是將組織稀釋液以蒸餾水取代。GSH-Px 以 Hafeman 單位 (U)表 示，Hafeman 單位定義為單位時間內檢品消耗之 glutathione (GSH)濃度 對數值(log[GSH]E)，減去非酵素反應消耗之 glutathione (GSH)濃度對數 值(log[GSH]NE)，所得值之千分之一為 GSH-Px 活性單位(U) :
U = (log[GSH]E - log[GSH]NE)/1000
×
Δt組織內 GSH-Px 活性以 U/mg protein 表示。
十 、 反 轉 錄 聚 合 ? 鍊 鎖 反 應 (reverse transcriptase polymerase chain reaction ; RT-PCR)
(一 ) 全 量 RNA 之 萃 取 :
全量 RNA 之萃取是參考 Chomczynski 等人(1987)所描述之方法進 行，取 0.2 g 肝組織於均質器內，加入 2 ml TRI Reagent® 於低溫下均 質。取適量的均質液於 eppendorf 內，在 4
°
C 下靜置 5 分鐘。再使用 1 ml 滅菌針筒和 20 G 注射針頭重覆均質之。加入 0.2 ml chloroform (SHOWA)，上下強烈振搖約 20 秒，再於 4°
C 離心(14,600×
g) 15 分 鐘，取 80 % 上清液至已滅菌的 eppendorf，加入等體積的 isopropanol (WAKO)震盪混合均勻，於 -20°
C 下靜置。隔日，以於 4°
C 離心(12,000×
g)10 分鐘。移除上清液，加入 75 % 酒精清洗 RNA pellet ;於 4°
C 離 心(7,500×
g) 5 分鐘去酒精，於室溫下風乾(約兩分半鐘)。加 70 µl DEPC 處理過的去離子水溶解之， 最後再以分光光度計(HITACHI U-2001;Japan) 於 260 nm 及 280 nm 下測量吸光值，估算 RNA 的純度及濃度。
檢測後將 RNA 調整為適當濃度，置於 -80°C 冷凍備用。
(二 ) Primer (引 子 ) 的 設 計 與 合 成 :
進行反轉錄聚合? 反應時所需的引子，是參考有關文獻(Shanthi et al , 1988)及使用電腦軟體設計(Table 1)。引子的合成，則是委託生工有限 公司合成。
(三 ) RT-PCR:
1.取 0.2ml 的微量離心管，將 One-Step RT-PCR 試劑加入如下:
2.PCR 反應的條件
將上述反應物混合均勻，置入 GeneAmp PCR system 2400 (PERKIN ELMER)並輸入反應條件後，進行 RT-PCR。
(四 )洋 菜 凝 膠 電 泳 (Gel electrophoresis):
以 0.5
×
TBE buffer 配製 2 % agarose gel，以微波爐加熱直到完全溶 解。微溫時進行造膠，待膠硬化加入 running buffer (0.5× TBE buffer)。NO. Components Volume 1 2
×
Reaction Mix 12.5 µl2 RT/PLATINUM Taq Mix 0.5 µl
3 Sense Primer (10µM) 0.5 µl 4 Anti-sense Primer (10µM) 0.5 µl 5 Template RNA (1µg/µl) 10.0 µl
mRNA Annealing temp (°C ) No.of cycles
HGF 52.0 35
TGF-ß1 45.0 35 TIMP-1 57.6 30 Mat Ia 47.0 40 Mat IIa 52.0 40 Procollagen I 59.0 30 GAPDH 52.0 35
將 DNA 及 marker loading 在 well 中以 100 伏特電壓下進行電泳。
完成後，DNA 以 ethidium bromide 染色，再以 UV 激起螢光呈色後以 拍立得相機紀錄之。將相片掃描後以 Kodak Digital Science™ 1D 影像分 析電腦軟體定量其光密度。本實驗是以 GAPDH 當作對照，如欲求特 定 mRNA 表現量，將特定 mRNA 光密度除以 GAPDH 光密度值，其 相對量即為所求。
試 劑 :
1.TRI Reagent® (MRC,Molecular Research Center)
2.Super Script™ One-Step RT-PCR with PLATINUM® Taq (Invitrogen) 3.Agarose (J.T Baker)
4.100 bp DNA Laddr (Gene Marker) 5.TBE Buffer (Sigma)
6.Ethidium bromide (Sigma)
十 一 、 西 方 點 墨 法 ( western blot )
(一) 蛋 白 質 萃 取
取 0.1 g 肝臟組織加入 1 ml 的 lysis buffer，在冰上加以剁碎並且 均質。將均質液放入離心管，進行高速離心(50,000
×
g)，15 分鐘。(二) 蛋 白 質 定 量
從離心過的均質液取上清液，加入 coomassie blue G-250 反應，
以可見光 595 nm，測定吸光值。同時以蛋白質標準品(BSA)所測 得的標準曲線，來計算各個樣本的濃度。
(三) SDS-PAGE
調整各組樣本蛋白質濃度為一致， 以一定量的蛋白與四倍的
loading buffer 以四比一的比例混合均勻，於 100
°
C 下水浴加熱五 分鐘，使蛋白質四級結構瓦解成一級結構。將加熱完成的樣本 loading 在 SDS-PAGE (15 % running gel 及 4 % stacking gel)，以 50 volt 跑 stacking gel，最後再以 100 volt 跑 running gel。將跑完 的膠片取出，以染劑 Commassie blue R-250 染一小時，再以脫色 劑(5 % acetic acid, 50 % methanol)脫色，直到 band 清晰可見，比 較 band 的寬度及顏色。(四) 西 方 點 墨 法
結束電泳，將膠片小心取出，利用轉漬設備及 PVDF 轉漬膜，於 轉漬緩衝液中將膠內蛋白轉漬附著於 PVDF 膜上，轉漬過程於室 溫下以 100 volt 電泳 90 分鐘。將轉漬膜浸潤於 20 毫升含有百 分之五脫脂奶粉的 PBS-T (blocking solution)以牛奶蛋白覆蓋於轉 漬膜上尚未有蛋白接合的位置，於室溫下慢速搖晃 1 小時。倒掉 blocking solution 後，加入所期望的特定蛋白專一抗體溶液，於 4
°
C 下反應整夜。隔日，倒掉抗體溶液，加入 PBS-T 溶液於室溫下搖 晃五分鐘，倒掉 PBS-T 清洗液後再重覆加入 PBS-T 溶液清洗轉 漬膜，前後共四次，最後一次倒掉清洗液，加入過氧化氫酵素接 合的二次抗體(peroxidase-conjugated secondary antibody)溶液以結 合於轉漬膜上的初級抗體，在室溫下以中等速度搖晃一小時，反 應完後，倒掉二次抗體溶液，並加入 PBS-T 溶液清洗殘餘的二級 抗體溶液四次。於暗房中,將化學螢光試劑與轉漬膜於室溫下反應 一分半鐘。反應完後，將轉漬膜瀝乾，迅速放入壓片夾內使底片 感光，時間依螢光強弱決定。感光完的底片再進行顯色及固定。Tris-HCl 20 mM Glycerol 10 % Sodium chloride 137 mM Triton X-100 1 %
Protease inhibitor Cocktail 1 mM 轉漬方法
著 手 套 將 轉 漬 設 備 中 的 海 綿 (sponge)與 裁 成 適 當 大 小 的 濾 紙 (Whatman 3MM paper)浸泡於一倍的 Transfer buffer 中，再與 methonal 處理後的 PVDF 轉漬膜及電泳膠片於 Transfer buffer 蓋下依序排列，由陰極至陽極為海綿、濾紙、電泳膠、轉漬膜、
濾紙，及海綿。放置時確定各層無氣泡並確認所接電源極性方向 正確。此時即可進行轉漬。
Transfer buffer (pH 8.3)(10
×
)Tris base 25.0 mM Glycine 192.0 mM SDS 3.5 mM Methanol 20.0 %
Blocking solution
PBS (pH=7.4)
Tween-20 0.5 % Skin milk 5.0 %
專一抗體溶液
TGF-beta1 抗體(Santa Cruz)以百分之五脫脂牛奶的 PBS-T 稀釋
二次抗體溶液
抗體(Amersham Bioscience)以百分之五脫脂牛奶的 PBS-T 稀釋
十 二 、 病 理 檢 驗
肝組織在 10 % 的中性福馬林固定一週，再將此組織以脫水滲臘機 (LIPSHOW)先進行脫水，再進行石腊包埋。包埋後以旋轉式切片機切成 約 3-5 µm 的厚度。再進行肝臟膠原纖維特殊染色(Masson stain)，於光 學顯微鏡下觀察肝細胞之特異情況及組織病理變化，比較並拍照評估肝 纖維化程度。
十 三 、 cDNA 基 因 微 陣 列 試 驗
(一 ) 全 量 RNA 之 萃 取
詳見反轉錄聚合? 鍊鎖反應
(二 ) 晶 片 之 操 作
正常組、四氯化碳組、四氯化碳+牛磺酸水溶液高劑量組。每組抽 RNA 委託百恩諾生物科技公司進行兩對晶片操作，即正常組和四 氯化碳組一對、四氯化碳組和四氯化碳+牛磺酸水溶液高劑量組一 對。每對 RNA 分別先以 Cy 3 及 Cy 5 兩種螢光試劑加以標定再 與基因晶片上的 cDNA 進行雜合反應，反應完成後之晶片經過洗
正常組、四氯化碳組、四氯化碳+牛磺酸水溶液高劑量組。每組抽 RNA 委託百恩諾生物科技公司進行兩對晶片操作，即正常組和四 氯化碳組一對、四氯化碳組和四氯化碳+牛磺酸水溶液高劑量組一 對。每對 RNA 分別先以 Cy 3 及 Cy 5 兩種螢光試劑加以標定再 與基因晶片上的 cDNA 進行雜合反應，反應完成後之晶片經過洗