第一章 文獻探討
第四節 肝纖維化在分子生物學上的研究
肝纖維化的形成是由於長期的慢性肝損傷，造成庫氏細胞(kupffer cell)、血小板、血管內皮細胞等釋放細胞激素，細胞激素作用於星狀細 胞，使星狀細胞活化成纖維母細胞，產生大量的細胞外基質，例如: 第 I、 III 型膠原蛋白而造成肝纖維化。活化的星狀細胞雖能釋放 matrix metalloproteinase (MMP，即 collagenase) 來降解纖維狀膠原蛋白，但也 會產生 tissue inhibition of metalloproteinase (TIMP)來抑制 MMP 降解纖 維蛋白的作用，造成肝纖維化更加嚴重。
一 、 星 狀 細 胞
肝 臟 星 狀 細 胞 是存在狄氏腔(space of Disse)，主要功能是儲存 vitamin A，星狀細胞佔肝臟非實質細胞(non-parenchymal cells) 的三分之 一，或肝臟細胞總數的 15 % 。星狀細胞在正常肝臟執行重要功能，包 括: (1) retinoids 的代謝，星狀細胞儲存了約全身 80% 的 vitamin A 的代 謝物 retinoids (Senoo et al., 1988) ; (2) 細胞激素的分泌，例如: 表皮生 長因子 (epidermal growth factor, EGF)、 肝細胞生長因子 (hepatocytes growth factors, HGF)等，這些因子可以維持肝細胞的量與質; (3) 調控血 流，由於星狀細胞接近神經(Ueno, 1997)，故星狀細胞可能受到神經刺激 而收縮(Friedman, 1996)。
隨著肝毒物造成的傷害，肝臟中環境的改變，例如: 庫氏細胞、內 皮細胞釋放細胞激素，或活性氧化物、氧化壓力的增加，星狀細胞會因 此活化，由富含 vitamin A 的休止狀態，轉變為活化態的星狀細胞。
二 、 TGF- beta
刺 激 肝 臟 星 狀 細 胞 合 成 細 胞 外 基 質 的 最 主 要 細 胞 激 素 是 Transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) (Czaja et al., 1989)。TGF- beta1 是由兩個相結構相同或相近的、分子量為 12.5 kDa 合併單位借二 硫鍵連接的雙體。TGF-beta 的生物學功能研究主要在炎症、組織修復和 胚胎發育等方面，近年來發現 TGF-beta 對細胞的生長、分化和免疫功能 都有重要的調節作用。TGF-beta 家族中，包括有三種 isoform ( beta1, beta 2, beta 3)。一般來說，TGF-beta1、beta2 和 beta3 功能相似，TGF-beta 對間質起源的細胞起刺激作用，而對上皮或神經外胚層來源的細胞抑制 作用。
當組織受損而產生發炎反應時，發炎細胞或血小板會釋放 TGF-beta1
，來調控白血球的補給與活性。接下來 TGF-beta1 釋放的量與活性的表 現，取決於星狀細胞內的結合蛋白的數目，也就是 TGF-beta1 接受器的 多寡(Gong et al., 1998)。當 TGF-beta1 與 TGF-beta1 receptor (type I、II) 結 合，則活化的星狀細胞 TGF-beta1 gene 會有增加的現象(Friedman et al., 1996; Kim et al., 1998)，使 TGF-beta1 生成增加，進而刺激星狀細胞生成 更多的膠原蛋白。
在肝纖維化的過程中，TGF-beta1 扮演著很重要的角色，肝臟的星 狀細胞受 TGF-beta1 刺激活化成肌纖維母細胞，造成肝纖維化。
三 、 TIMP 及 MMP
當持續肝受損時，肝臟星狀細胞就會增殖,而且在型態上會形成 smooth muscle
α
-actin positive myofibroblast (activated HSC)，並且產生多 樣化的膠原蛋白及非膠原蛋白蛋白(Friedman et al., 1989)。在一般慢性受 損的肝中，膠原蛋白型 I 和 IV、 undulin、 elastin 和 laminin 則 會增加 (Schuppan D, 1990)。細胞外基質的膠原蛋白中，膠原蛋白型 I 是增加 最多的，再來是膠原蛋白型 III 和 IV，隨著肝損傷的日趨嚴重，就會產 生一些無法由巨噬細胞分解的結構蛋白，壞死細胞形成結(nodules)，造 成肝硬化。肝纖維化的原因，亦是細胞外基質的合成失衡， 而肝纖維化本身 即是細胞外基質生成及其降解酵素不斷調控的過程。細胞外基質的降解 主 要 是 matrix metalloproteinase (MMP)酵素的催化， 其種類包括有 collagenase、stromelysins、gelatinase 及 membrane type (MT)-MMPs，
而這些酵素主要是受到 tissue inhibition of metalloproteinase (TIMP)抑 制。
TIMP 的家族至今已被證實包括有四種， TIMP-1、 TIMP-2、
TIMP-3、TIMP-4，而 TIMP-1 及 TIMP-2 已被證實可以抑制所有已知的 MMP 活 性 。 一般認為， 在肝臟病理狀態， TIMP-1 的重要性大於 TIMP-2 。TIMP-1 是一種 29-kD glycoprotein，主要功能是抑制膠原蛋白 水解? MMP 的活性。在人類及動物模式中，TIMP-1 及 TIMP-2 都增加。
TIMP 的主要來源是被活化的肝臟星狀細胞，而在肝纖維化的初期，
TIMP 會被表現出來，相對於 TIMP，interstitial collagenase (MMP-1 在 人類，MMP-13 在大鼠)活性未改變(Benyon et al., 1996)。因此當 TIMP : MMP 動態的比值增加時，就會增加胞外基質的沈積。
四 、 肝 細 胞 生 長 因 子
肝細胞生長因子(HGF)最早在 1984 年從肝切除後的剩餘組織中被 發現，因最初被發現可刺激肝細胞合成 DNA 而命名之(Nakamura et al., 1984)。在正常的情況下 HGF 在組織中以非活性的形式存在。非活性的 HGF 必? 經蛋白水解後才能發揮其生物活性。非活性的 HGF 是由 728 個氨基酸構成的單鍵分子，活化態時是一條重鏈(
α
chain)和一條輕鏈(β
chain)由雙硫鍵連接而成的二聚體。HGF 是很強的促肝細胞增生因子，不僅能刺激肝細胞再生，也能 促進肝功能回復。肝毒素 CCl4 和氨基半乳糖(D-galactosamine)造成大鼠 急性肝損傷中， HGF mRNA 顯著增加(Asam et al., 1991)，但 HGF 在慢 性肝損傷表現情況尚不明。
五 、 S-腺 ? 甲 硫 氨 酸 (S-adenosylmethionine, SAM)
Kinsell 氏等人(1947)首次發現在肝硬化病人的 methionine途徑有損 害。methionine 的第 3、4 兩個碳原子經酵素作用與 ATP 結合形成活化 狀態的 SAM(見下圖)。Methionine adenosyltransferase (MAT)是 methionine 形成 SAM 的重要催化酵素(Cantoni, 1953)。
http://www.indstate.edu/thcme/mwking/sam.gif
SAM 是許多甲基化反應的甲基提供者，對 polyamine 及 glutathion 的合成相當重要，在 folate cycling 也有其重要性(見下圖)。除此之外，
MAT 在肝細胞功能的調控，如肝再生、分化及肝損傷也扮演相當重要 的角色(Paneda et al., 2002)。
http://www.humboldt.edu/~rap1/BiochSupp/note_pics/aaMetab/CholineSyn.gif
http://lpi.oregonstate.edu/infocenter/othernuts/choline/cholinter.html
在哺乳動物中 MAT 有三種形式，MAT I、MAT II 及 MAT III 由兩 種基因 mat1a 及 mat2a 所調控。mat1a 僅在肝臟中表現，產生 MAT III (dimmer) 及 MAT I (tetramer) 。mat2a 則是產生 MAT II，其廣泛分佈於 肝臟外的組織，雖存在於新生兒的肝臟中，但長大後即被 mat1a 所取代。
在肝硬化病人(Cabrero et al., 1988)，大鼠肝損傷實驗如酒精(Lieber et al., 1990)、四氯化碳(Corrales et al., 1992)、paracetamol (Stramentinoli et al., 1979)、buthionine 及 sulfoximine (Corrales et al., 1991)等，MAT I/III 的 活性明顯下降。另一方面，當發生肝癌 (Cai et al., 1996)、肝臟切除手術 (Huang et al., 1998)及 thioacetamide 誘導肝纖維化時 (Huang et al., 1999)，mat2a 表現會明顯上升，mat1a 開始下降。mat1a 及 mat2a 之間 的轉換機轉尚不明確。
六 、 麩 胱 甘 ? (GSH)
麩胱甘? (GSH)在細胞內抗氧化系統中扮演有重要的角色，GSH 是由 三個胺基酸所構成的。GSH 的生理功能很多，主要有：(1)可預防過氧化
物的毒性，本身當作受質(substrate)利用 glutathione peroxidase (GSH- Px) 來 移 除 過 氧 化 氫 (hydrogen peroxide) 或 其 他 有 機 過 氧 化 物 (organic hydro-peroxides)；(2)參與解毒代謝，可與多種外來毒物(xenobiotics)或內 生性反應物透過 glutathione S-transferase 催化進行結合，增加外來毒物的 水溶解能力，達到解毒的目的(Ishige et al., 2001)。