討論 - 活體外第二型豬的環狀病毒和豬瘟疫苗毒對單核球來源樹突細胞的影響

本研究係延續 Huang 等人(2011, 2014)的觀察，豬第二型環狀病毒(PCV2)的感染會降低兔化豬瘟減毒疫苗(LPCV)的效力，本研究進一步探討造成此現象的因素和相關機制。由於樹突細胞是連結先天性免疫和後天性免疫最重要的橋樑 (Steinman and Hemmi, 2006)，在刺激記憶反應和啟動 CD4⁺幫手型T 細胞及 CD8⁺ 毒殺型T 細胞也有專一性的功能(Zhou et al., 2007)，因此本試驗選用免疫系統具關鍵作用的樹突細胞作為本試驗的研究模式。身為免疫系統裡的哨兵，樹突細胞是許多病毒欲侵犯或逃避免疫系統監測的理想目標。而病毒感染樹突細胞後，無論是否在細胞內複製，都有可能會調節和改變樹突細胞原本的功能，例如人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus)會藉由樹突細胞將病毒傳播至淋巴球，登革熱病毒(Dengue virus) 會誘導樹突細胞的成熟，在鼠類的巨細胞病毒 (cytomegalovirus)也會改變樹突細胞細胞激素表現量，另外麻疹病毒(measles virus) 會使樹突細胞的抗原呈現功能受損(Vincent et al., 2003)，因此若能瞭解 PCV2 和 LPCV 對樹突細胞所造成的影響，對於釐清 PCV2 影響 LPC 疫苗效價的機制將會有進一步的幫助。

在 2003 年時，Vincent 等人(2003)的研究顯示 PCV2 能感染單核球來源之樹突細胞(MoDCs)和骨髓來源之樹突細胞(BMDCs)，在共厄焦(Confocal)顯微鏡下可清楚看到樹突細胞細胞質中有PCV2 的病毒抗原存在。相反地，在豬腎細胞(PK-15A) 的細胞核與細胞質皆能夠發現PCV2 的抗原顆粒，這種情形被懷疑和體外(in vitro) 培養樹突細胞的條件有關聯；但是，後來研究顯示PCV2 的病毒抗原在體內(in vivo) 條件下，也只在細胞質被檢測出而非細胞核(Krakowka et al., 2002; Rosell et al., 1999)。目前 PCV2 在單核球/巨噬細胞系列之細胞有高陽性率(Chang et al., 2006;

Gilpin et al., 2003)，而在本試驗中 PCV2 於 MoDCs 的感染率約 85%。Chen 等人(2012) 顯示豬瘟病毒(CSFV)於 MoDCs 的感染率約 92%，亦符合本試驗的研究結果，而 PCV2 和 LPCV 的感染在 MoDCs 型態學上也皆無細胞病變，上述病毒與細胞親和

性的觀察有助於後續相關免疫分析的可信度。為了瞭解當 PCV2 預先存在於

MoDCs 時是否會影響 LPCV 的感染率，本試驗也將 PCV2 和 LPCV 共同感染後進

行分析，結果顯示在病毒感染後的第2~6 天，PCV2 不具影響 LPCV 感染 MoDCs 的能力，因此推測在MoDCs 的研究模式中，PCV2 並非藉由影響 LPCV 的感染力進而減低豬瘟疫苗的效力。

當樹突細胞調控適應性免疫時需仰賴一個成熟化的過程(Saito et al., 2008)，而未成熟的樹突細胞通常位於周邊黏膜組織與真皮層，通常具有高效的抗原攝取活性，在移動到二級淋巴器官再經過刺激即轉變為成熟的樹突細胞，並能有效地呈

現抗原給 T 細胞啟動免疫反應。在樹突細胞成熟的過程中，有許多樹突細胞特異

性的基因(DCs-specific gene)會受到誘導，特別是共同刺激分子 CD80、CD83 和 CD86 與主要組織相容性複合物第一型(MHC-I)和主要組織相容性複合物第二型 (MHC-II)皆會有表現量上升的情形(Kruse et al., 2000; Zhou et al., 2007)。因此區分樹突細胞的類型，和觀察感染 PCV2 和 LPCV 後是否會造成細胞表面分子表達的改變，為本試驗的目的。檢測結果CD14 和 MHC I 的表現率在每個實驗組分別約 97%和 94%的陽性率，由於 CD14 在許多文獻被討論到，無論是否給予 LPS 或 TNF-α 的刺激，CD14 在 MoDCs 皆會持續表現，但也可能會因為培養環境的不同而有所差異。本實驗先前也有相關研究使用CD14 作為單核球來源之細胞純度判斷依據，

而MHC I 通常表現於所有有核之細胞，同時也能提供細胞內部的狀況。當細胞受到病毒感染時，MHC I 能將病毒胜肽(peptide)呈現於細胞外側，提供毒殺型細胞進行偵測，屬於非特異性的免疫反應。CD80、CD86 和 MHC II 在每個實驗組的檢測結果為陰性，對照 Summerfield 等人(2009)和 Chen 等人(2012)的研究結果，PCV2 和 CSFV 感染樹突細胞時，沒有誘導其成熟之能力，因此在沒有另外給予刺激物的情況下，細胞成熟分子檢測結果為陰性似乎是可被接受的，但Vincent 等人(2003) 的研究顯示，即使未給予成熟的刺激物，MoDCs 的 CD80、CD86 和 MHC II 還是會有低至中等的表現量，與 Vincent 等人(2003)的研究不符合的可能原因為，本研究檢測細胞表面分子的時間參考 Chen 等人(2012)的研究，只選用接種病毒後的第 48 小時做為檢測時間，又另外在試驗當中所使用的抗體不同或培養環境不同也可能造成有誤差的實驗結果，因此CD80、CD86 和 MHC II 的表現量在沒有另外給予LPS 或 TNF-α 的情況下在未來還需要釐清。

在文獻探討的 1-6 章節曾經提及當 CSFV 感染細胞時，CSFV 的 NS2 蛋白會阻

斷細胞凋亡，也透過增加NF-κB 和 cyclin A 的表現防止細胞進入 S-phase (Tang et al., 2010 and 2011)，而感染豬瘟引起的淋巴球減少症，也已經被證明是豬瘟病毒藉由抑制 E^ens和粒線體跨模電位，間接地誘導淋巴細胞凋亡(Summerfield et al., 1998;

Bruschke et al., 1997)。目前也有文獻指出當 CSFV 感染 MoDCs 後的第 24~72 小時，

MoDCs 的存活與凋亡情形和模擬控制組無差異(Chen et al., 2012)。另外 PCV2 也常被發現存在於單核球/巨噬細胞系列之吞噬細胞和 DCs 中，PCV2 可停留在 DCs 數天，且不會造成細胞凋亡和細胞表面分子的調控，有學者認為 PCV2 可能只是利用DCs 作為散播病毒到身體其他組織的一種機制(Vincent et al., 2003)。本研究對細胞凋亡和死亡情形的分析結果顯示，當PCV2 感染 MoDCs 時會造成細胞較低的存

活率和較高的凋亡率及死亡率，這種情形從病毒感染後的第 6 天開始可觀察到，

並在病毒感染後的第 8 天最為明顯，當陰性對照組和 LPCV 感染組的存活率有 80~90%時，PCV2 感染組的存活率約 50%，而在 PCV2 和 LPCV 共同感染的組別存活率約只剩下 30%，細胞的凋亡率在陰性對照組約為 7%，LPCV 感染組約為 1%，PCV2 感染組約為 30%，而在 PCV2 和 LPCV 共同感染的組別凋亡率約達 45%，

這是令人感到驚訝的差異。在MoDCs 的研究模式下，PCV2 在感染後期會導致細胞的凋亡，並且在共同感染的情況下會使可能具有抑制細胞凋亡功能的 LPCV 失去抑制的能力，甚至擴大細胞凋亡與死亡的情形。回顧Chang 等人(2006)對離乳後多系統性消耗症侯群(PMWS)造成的淋巴細胞流失之機制所進行的研究顯示，當 PRRSV 單獨感染和 PCV2/PRRSV 共同感染於與脾臟巨噬細胞共同培養的脾臟淋巴球和周邊組織淋巴球時，細胞的存活率會下降，凋亡率會上升，在脾臟巨噬細胞同時也發現Fas ligand 的表現量上升，共同培養的脾臟淋巴球和周邊組織淋巴球的Fas 表現量上升等情形，而 Fas (CD95)和 Fas ligand (FasL)的活化目前也已經被證明為誘導T 細胞和記憶型 B 細胞死亡的媒介(Alderson et al.,1994, 1995; De Milito et al., 2001)。由於本研究是單純的 MoDCs 培養系統，並無其他細胞共同培養，因此MoDCs 的細胞凋亡是否係經由 Fas-Fas L 的活化所致仍需進一步證實。

雖然樹突細胞在免疫學發展的早期就已經被發現，但直到 90 年代藉由體外細胞因子大量培養成功後，DCs 的研究才逐漸成為免疫學中一個不斷升溫的熱門題材，但目前相關的文獻還是有限，導致許多免疫機制和致病因子尚未明瞭。而本

試驗在細胞存活率與凋亡率的調查與Vincent 等人(2003)發表的文獻有所牴觸的原因有三，一為MoDCs 的純化條件不同，二為在實驗當中使用的 PCV2 病毒株亞型可能不同，三為本研究實際上觀察到顯著差異的時間點為接種病毒後的第 144 小時和192 小時，而 Vincent 等人的研究係檢測第 24 小時至 72 小時，以上原因可能導致具有差異的觀察結果，另外由於本實驗所使用的 PCV2 病毒液力價為 10⁶ TCID50，PCV2 病毒液須加到 250ul 才能達到 0.5 MOI 的實驗條件，因此也不能排除病毒液佔細胞培養液的比例太高導致細胞營養成分被稀釋進而造成凋亡的可能性。凋亡在細胞自我瓦解(self-destruction)的過程中是一種正常的生理機能，並伴隨著型態和功能的改變，而外界引發凋亡的刺激與訊號的產生是來自於細胞內，以半胱胺酸蛋白酶(caspases)為媒介所誘導凋亡的路徑被活化所致。在許多病毒的生活史當中，誘導細胞凋亡是很自然的一個部分，原因是細胞凋亡對病毒而言是引起宿主細胞最小化的發炎或免疫反應，對病毒本身不會有太大的危害卻又能同時將病毒顆粒釋放與散佈出去。目前已有研究證明PCV2 的 ORF3 蛋白在 PK15 引起的細胞凋亡是活化caspase-8 和 caspase-3 路徑所導致(Liu et al., 2005)。而細胞趨向凋亡和壞死的因素有很多，當細胞受到不同病毒共同感染時誘導凋亡之機制可能更為複雜，雖然PCV2 誘導 MoDCs 凋亡的機制目前尚未清楚，但從本研究當中可發現 PCV2 感染於 MoDCs 所引起的凋亡及壞死是較延遲的反應，且這種情形在 PCV2/LPCV 共同感染時更為明顯，在未來若證實 MoDCs 的凋亡確實是由 PCV2 所主導，或許可以推測豬隻受到PCV2 感染後，再施打 LPC 疫苗所造成的效力減低與其可能有重要的關聯性。

未成熟的樹突細胞通常可透過巨胞飲作用(macropinocytosis)、以受體為媒介的胞吞作用(receptor-mediated endocytosis)和噬菌作用(phagocytosis)來達到攝取及處

理抗原的目的，因此評估此功能是 DCs 相關研究中的重要項目。本研究使用的

DQ^TM-ovalbumin 主要係模擬大分子的可溶性抗原作為測試物質，DQ^TM-ovalbumin 的受體為mannose receptors，在經過細胞吞噬降解其片段後才會呈現綠色螢光，另外Staphylococcus. aureus-FITC 則是作為顆粒性抗原的測試物質。在本實驗中，於 MoDCs 接種 PCV2 和 LPCV 後，不論是單獨感染和共同感染在可溶性抗原及顆粒性抗原的檢測皆無顯著差異，對照Steiner 等人(2008)將 PCV2 感染於豬腎細胞、內

皮細胞和MoDCs 所做的研究顯示，MoDCs 吞噬 DQ^TM-ovalbumin 的能力約 80%，

與本研究的結果相近。另外有學者指出當假性狂犬病病毒(PRV)感染骨髓來源之未成熟樹突細胞時，細胞的吞噬能力在24 小時便會顯著地下降，原因可能為不成熟樹狀突細胞受到外來刺激原如病毒感染等刺激時，可從抗原吞噬作用旺盛的不成

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