第二章 文獻回顧
第二節 豬第二型環狀病毒
al.,2007; Pauly et al., 1995; Armengol et al., 2002; Pirios et al., 2003)。
目前市面有兩種商業化的次單位疫苗分別為 BAYOVAC®CSF Marker 和 Porcilis Pesti 較常見，這兩種不同的次單位疫苗皆利用昆蟲桿狀病毒分別表現 32μg 和86-100 ELISA units/dose 的 E2 蛋白製作而成(Dong et al., 2007)，接種後只誘導體 液性免疫，缺乏細胞性免疫，但在臨床研究顯示在接種 E2 次單位疫苗後的第 14 天開始即可保護豬隻不被強毒株的豬瘟病毒感染，免疫效果至少可持續13 個月，
雖然施打疫苗的豬隻不會出現臨床症狀，但在施打後的第14 天還是檢測到病毒血 症及分泌物有病毒的釋出，目前還沒辦法完全避免垂直及水平的病毒傳播(Dong et al., 2007; van Oirschot, 2003)。
新型豬瘟疫苗的發展，係源自於為了讓 E2 次單位疫苗能成功誘導抗豬瘟病毒 的特異性中和抗體。大部分的多胜肽疫苗是使用E2 的 A 或 BC domain，但評估發 現免疫效不理想(Dong et al., 2007; Beer et al., 2007)。新型的 DNA 疫苗是用質體結 構，將E2 基因和細胞激素基因(如 IL-2、IL-3、IL-12、IL-18)結合，或是調整細胞 表現分子的基因(例如 CD154 和 CD40)以及結合刺激免疫反應的 CpG 和 BCG 等，
這些新型的疫苗都在發展當中(Ganges et al., 2008; Dong et al., 2007; Beer et al., 2007)。多數 DNA 重組疫苗都能誘發出體液性及細胞性免疫，但在接種疫苗後到 給予豬隻保護的時間比減毒疫苗及E2 次單位疫苗都要來的長，這段免疫空窗期是 DNA 疫苗需要改善的缺點(Ganges et al., 2008; Dong et al., 2007; Beer et al., 2007)。
以病毒為載體的疫苗包括Poxvirus、Pesudorabies virus (PRV)、porcine adenovirus 和BVDV 較常被應用(Dong et al., 2007; Beer et al., 2007)。多數 E2 嵌合重組活毒疫 苗免疫於豬隻都能夠提供完整的保護，但重組疫苗株有可能會和wild-type 病毒株 產生基因重組，這是其潛在風險，另外雖然施打重組疫苗對豬隻不會致死，但對 其他感受性高的宿主仍具有毒性，且會干擾病毒載體所誘導的中和抗體效價(Dong et al., 2007; Beer et al., 2007)。
第二節 豬第二型環狀病毒
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2-1 病毒學分類
豬環狀病毒(Porcine circovirus, PCV)為一小型，大小約 14-19nm、正二十面體 之 不 具 套 模 的 單 股 環 狀 DNA 病 毒 ， 基 因 序 列 長 1.76kb ，屬於環狀病毒科 (Circoviridae)，環狀病毒屬(Circovirus) (Finsterbusch et al., 2009; Mankertz et al., 2004)。其中環狀病毒屬還包括第一型、第二型豬環狀病毒(Porcine circovirus type 1、type2, PCV1, PCV2)、鵝環狀病毒(Goose circovirus, GoCV)、鸚鵡喙羽症病毒 (Psittacine beak and feather disease, PBFDV)、鴿環狀病毒(Pigeon cirovirus,PiCV)等 病毒(Bassami et al., 1998; Todd, 2004)。
豬環狀病毒最早於汙染的豬腎細胞株(PK15)被發原，此病毒對酸性環境 pH=3、氯仿和高溫皆具抵抗性。豬環狀病毒因基因序列和病源性的差異將之分為 兩型，其中最早由PK15 分離無病原性的病毒為第一型豬環狀病毒(PCV1)，另外由 豬離乳後多系統消耗性症侯群(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS) 所分離，具有病原性的病毒為第二型豬環狀病毒(PCV2) (Meehan et al., 1998;
Morozov et al,1998)。PCV1 的基因大小約 1758-1760 個核甘酸，不同的 PCV1 病毒 株基因序列相似度約98-99%。而 PCV2 的基因大小約 1767-1768 個核甘酸，在不 同國家所分離到的PCV2 病毒株基因序列相似度為 93-99% (Muhling et al., 2006)，
其中包括PCV2a、PCV2b 和 PCV2c 三種基因型(Segalés J et al., 2008; Cortey et al., 2011)；研究指出，PCV2 有 11 個開放式閱讀框架(Open reading frams, ORF)，其中 ORF1、ORF2 和 ORF3 已被證明是複製相關蛋白、衣殼蛋白及凋亡相關蛋白 (Finsterbusch et al., 2009; Mankertz et al., 2004)。PCV2 的核酸序列在 ORF1 的相似 度為97-100%，ORF1 所編碼的複製相關蛋白為 Rep 和 Rep’(Larochele et al., 2002;
Mankertz et al., 2004)；PCV2 的核酸序列在 ORF2 的相似度為 91-100%，ORF2 主 要負責轉譯病毒的衣殼蛋白(capsid protein)；ORF3 編碼凋亡相關的蛋白質(Liu et al., 2005)。
2-2 歷史背景與流行病學
1996 年 ， 一 種 新 興 疾 病 - 豬 離 乳 後 多 系 統 消 耗 性 症 侯 群 (Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)在加拿大首次被發現，之後在美洲、歐洲
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和亞洲也陸續出現病例。由於從PMWS 發病的豬隻所分離出的環狀病毒和從被汙 染的PK15 分離出的環狀病毒，不管在基因序列、抗原性和病原性都有差異，因此 將此病毒命名為豬第二型環狀病毒(PCV2) (Meehan et al., 1998)，目前 PMWS 在許 多國家廣泛存在且造成許多經濟上的損失(Allan and Ellis, 2000)。而台灣首次發現 PCV2 的時間為 2001 年，之後的調查發現 PCV2 血清抗體陽性率為 83.5%，此結 果顯示PCV2 在台灣已普遍存在(Wang et al., 2004)。由世界各地分離出的 PCV2 雖 然同屬於一樣的病毒株，但基因序列仍有差異，目前也無證據顯示 PCV2 的基因 序列和地域性以及疾病的嚴重性有關連(Cheung et al., 2007; de Boisseson et al., 2004)。
2-3 豬環狀病毒傳播方式
豬 第 二 型 環 狀 病 毒 (PCV2) 的 垂 直 及 水 平 傳 播 方 式 已 被 證 明 為 環 境 傳 播 (Grau-Roma et al., 2011)；在水平傳播中，眼睛、咽喉、扁桃腺和支氣管分泌物、
唾液、糞便、尿液、母乳及精液都是重要的傳播因子(Chung et al., 2005; Shibate et al., 2006; Grau-Roma et al., 2011)，PCV2 的傳染經常是由間接或直接接觸到受到 PCV2 感染豬隻的分泌物所造成；在垂直傳染中，PCV2 可透過懷孕母豬的胎盤傳染給胎 兒(Pensaert et al., 2004, Grau-Roma et al., 2011)。
2-4 臨床症狀與離乳後多系統性消耗症侯群
豬離乳後多系統消耗性症侯群(PMWS)常發生於出生後 25-120 天的豬隻，
PMWS 的豬隻臨床上常出現皮膚蒼白、嗜睡、體重減輕、黃疸、呼吸急促、下痢 和發燒等非特異症狀；PCV2 的感染亦可為不顯性感染。有研究指出，出現 PMWS 症狀的豬隻只有15%是單獨感染 PCV2，大多數的 PMWS 都是和其他病原共同感 染，因此病情的發展和症狀較複雜和難預料，PMWS 的臨床症狀大都非特異性。
要確診為 PMWS 需同時具備以下條件：(1)耗弱、呼吸困難和鼠蹊淋巴結腫大(2) 組織病理學的損傷為淋巴組織出現中等到嚴重的淋巴細胞流失和組織球中有葡萄 球狀雙染性的嗜鹼性包涵體(3)受到損傷的淋巴組織內可檢測到高 PCV2 病毒量 (Segalés J et al., 2004; Chae, 2004)。
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具有 PMWS 症狀的豬隻常見到鼠蹊部、腸繫膜和縱膈腔的淋巴結腫大，在某 些病例可見到淋巴結有多發性至融合性的壞死、胸腺萎縮、肺葉塌陷和肝腫大等 病理變化，部分病例亦可見到黃疸、腸道蒼白、潰瘍等現象(Rosell et al., 1999;
Segalés J et al., 2004)。在組織病理學的診斷當中，PMWS 主要的病變發生於淋巴組 織，包括淋巴結、扁桃腺、peyer’s patches 和脾臟等，典型特色為肉芽腫性的炎症 反應、組織球內有嗜鹼性包涵體、多發性凝固性壞死、不同程度的淋巴細胞流失 伴隨著組織球和多核巨細胞浸潤。其他組織的病變有間質性肺炎、肝細胞發炎、
腎炎等(Allan and Ellis, 2000; Darwich et al., 2004; Segalés J et al., 2004)。
有研究指出，豬第二型環狀病毒(PCV2)是藉由已受到感染豬隻的口鼻或呼吸 道分泌物直接接觸未受感染的豬隻散播。當病毒進入宿主體內會先在頭部的扁桃 腺和淋巴結，之後進入單核球、巨噬細胞及濾泡的樹突細胞，但不會進行複製。
PCV2 在樹突細胞是不易被察覺的，細胞對病毒沒有毒殺作用，但病毒有可能會改 變細胞表面抗原MHC I 和 MHC II 的表現(Vincent et al., 2003)。另外，也有學者認 為PCV2 感染單核球的目的是為了藉單核球散佈到全身，並感染淋巴器官(Darwich et al.,2004; Gillespie et al., 2009)。但是當淋巴球未受到抗原刺激時，病毒的感染率 和病毒量都會較低，而且並不會出現 PMWS 的症狀。然而，PCV2 次臨床感染 (subclinically infected)豬隻若受到具傳染性或不具傳染性的輔助因子(cofactors)刺 激免疫系統，就有可能使病毒複製效率提高並發展成 PMWS 豬隻(Darwich et al.,2004)。使用 Concanavalin A(con A)作為免疫刺激原活化淋巴球，對 PCV2 也有 類似於酵素催化的功能，使淋巴球增值和 PCV2 的複製效率提高；也有研究特別 注意到，PCV2 需在細胞週期中的 S phase 並依賴宿主細胞核內的聚合酶才能順利 進行複製(Lin et al.,2008; Tischer et al., 1987)。
2-5 豬第二型環狀病毒標的細胞與免疫調控
在有 PMWS 症狀的豬隻可以明顯在淋巴組織看到細胞激素的變化，例如在胸 腺、淋巴結、脾臟和血液可以檢測到高表現量的IL-10 (Doster et al., 2010; Crisci et al., 2010; Sipos et al., 2004; Darwich et al.,2003 and 2004)。有趣的是，會表現大量 IL-10 的細胞通常是 CD163+單核細胞/巨噬細胞等非主要標的細胞(bystander)和少
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數 CD4+和 CD8+細胞，IL-10 並非由真正受到 PCV2 感染的細胞所表現(Doster et al.,2010; Crisci et al., 2010)。另外有研究在各淋巴組織的 Th1 和 Th2 觀察到 IL-2、
IL-4、IL-10、IL-12p40 及 IFN-γ 的 mRNA 表現量減少(Darwich et al.,2003)。而 PCV2 感染肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage, AM)時會明顯的分泌 TNF-α，以及表現 IL-8 和MCP-1 的 mRNA (Chang et al., 2006)，在單核球分化而成的巨噬細胞也可檢測到 MCP-1 和 MIP-1 明顯的表現(Tsai et al., 2010)。從以上的結果可以推測，當 PCV2 感染巨噬細胞來源細胞時，會增加發炎相關細胞激素的分泌。
目前已經有研究證明 PCV2 可感染樹突細胞和巨噬細胞(Chang et al., 2006;
Vincent et al., 2003)。單核球來源之樹突細胞(Monocyte-derived dendritic cells, MoDCs)和骨髓來源之樹突細胞(Bone marrow-derived DC, BMDCs)可藉由胞吞的 方式使 PCV2 存在於細胞中，感染率約 80-90%，PCV2 不會造成 DC 死亡也不會 在DC 內複製。在 DC 發展過程中的細胞表面抗原 MHC I、MHC II、CD14、CD16、
CD25 和 CD80/86 皆不受 PCV2 影響(Vincent et al., 2003)。另外，PCV2 對肺泡巨 噬細胞(AM)的感染率超過 90%，PCV2 可存在於細胞質和細胞核中，當 PCV2 感 染AM 時不會造成細胞凋亡率上升，但細胞吞噬和微生物毒殺能力會明顯的降低，
而IL-8、TNF-α、AMCF-II、G-CSF 和 MCP-1 等細胞發炎激素皆明顯的增加(Chang et al., 2006)。上述相關研究顯示 PCV2 的抗原和 DNA 會堆積於單核球/巨噬細胞之 系列細胞當中，但 PCV2 對細胞不會造成損傷也不會在此類細胞複製，因此推測 這些免疫相關的細胞只是扮演傳播病毒的媒介角色。
第三節 豬隻相關病毒共同感染之免疫干擾
3-1 豬第二型環狀病毒與相關病毒共同感染
Kekarainen 等學者(2008)認為免疫反應在 PCV2 感染造成的損傷中佔最重要的 因素。PMWS 的豬隻會發現嚴重的淋巴組織損傷，包括淋巴細胞流失和肉芽腫性 炎症反應及改變淋巴器官和 PBMCs 之細胞激素的表現。例如誘導 IL-4 的表現量 下降以及IL-2、IL-10 和 IFN-γ 的分泌，其中，試管內的實驗顯示 PCV2 似乎能誘 導IL-10 的表現量上升(Darwich et al., 2003)。體外研究也觀察到感染 PCV2 豬隻在
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胸腺的IL-10 mRNA 表現量有上升的趨勢(Sipos et al., 2004)。目前普遍認為受到 PCV2 感染的仔豬之血液中的 IL-10 和 PMWS 的發展有重要的關聯(Stevensonet al., 2006)。
如先前所述，PCV2 不會在 DC 內複製，也不會改變 DC 抗原的攝取及表現 (Vincentet al., 2005)，然而，PCV2 的感染會抑制骨髓系和類漿細胞之樹突細胞分泌 IFN-α 和 TNF-α (Vincent et al., 2005 and 2007)。為了研究 PCV2 是否藉由分泌 IL-10 影響假性狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)之記憶性抗原(recall antigen)反應，
Tuija 在 10-13 週齡的實驗豬隻先接種商業化減毒 PRV 疫苗，之後分別給予 PCV2
Tuija 在 10-13 週齡的實驗豬隻先接種商業化減毒 PRV 疫苗，之後分別給予 PCV2