國立臺灣大學獸醫專業學院 分子暨比較病理生物學研究所
碩士論文
Graduate Institute of Molecular and Comparative Pathobiology School of Veterinary Medicine
National Taiwan University Master Thesis
活體外第二型豬的環狀病毒和豬瘟疫苗毒 對單核球來源樹突細胞的影響
The Effects of Porcine Circovirus type 2 (PCV2) and Lapinized Philippines Coronel Virus (LPCV) on Monocyte-Derived Dendritic Cells (MoDCs) in vitro
吳雨軒 Yu-Hsuan Wu 指導教授：
Advisor:
中華民國 103 年 6 月 June 2014
鄭謙仁 博士 龐 飛 博士
Chian-Ren Jeng, D. V. M, Ph.D.
Victor Fei Pang, D. V. M, Ph.D.
i
中文摘要
兔 化 豬 瘟 疫 苗(Lapinized Philippines Coronel, LPC) 為 豬 瘟 病 毒 (Classical Swine Fever Virus, CSFV)的減毒株，目前已有研究指出第二型豬環狀病毒 (Porcine Circovirus type 2, PCV2)的感染會減少 LPC 疫苗的保護效力，為了探討 PCV2 影響 LPC 疫苗的可能機制，本研究使用單核球來源之樹突細胞(Monocyte-derived dendritic cells, MoDCs)進行活體外的相關分析，以探討 PCV2 和豬瘟疫苗毒株(LPC Virus, LPCV)之間的交互作用。結果顯示，當 PCV2 和 LPCV 共同感染時，在早期 可檢測到IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-α 和 TNF-α 有較高的 mRNA 表現量，在 蛋白質層次也檢測到IL-8、IL-12p40 和 INF-γ 有較高的表現量，另外也發現 PCV2 的感染會使MoDCs 的存活率減低，凋亡率和壞死率升高。從本研究的實驗結果推 論PCV2 所誘導的免疫反應，特別是高表現的量的 INF-γ 以及誘導 MoDCs 的凋亡 或許可以解釋PCV2 影響 LPC 疫苗效價的部分原因。
關鍵字：豬瘟病毒、兔化豬瘟疫苗、豬第二型環狀病毒、豬單核球來源樹突細胞、
體外培養
ii
Abstract
The Lapinized Philippines Coronel (LPC) vaccine, an attenuated strain of classical swine fever virus (CSFV), it has been noted that porcine circovirus type 2 (PCV2) infection adversely affects the protective efficacy of LPC vaccine. In order to investigate the possible mechanisms of the PCV2-derived interference, an in vitro model was established to study the interaction of LPC virus (LPCV) and PCV2 in Monocyte-derived dendritic cells (MoDCs). The results showed that IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-α and TNF-α mRNA expression can be detected in early stage of PCV2 and LPCV co-infection in MoDCs. In addition, higher protein level of IL-8, IL-12p40 and INF-γ was also compatible present. Finally, apoptosis and low surviral rate can be induced by PCV2 and PCV2/LPCV in the late stage culture of MoDCs. The results of the present study may partially explain how PCV2 infection interferes with the efficacy of LPC vaccine.
Key words: classical swine fever virus, porcine circovirus type 2, Lapinized Philippine Coronel vaccine, monocyte-derived dendritic cells , in vitro
iii
目錄
中文摘要 i
英文摘要 ii
目錄 iii
表次 v
圖次 vi
第一章 序言 1
第二章 文獻回顧
. 2
第一節 豬瘟病毒 1-1 病毒學分類
. 2
1-2 歷史背景與流行病學
. 3
1-3 豬瘟病毒的傳播方式
. 4
1-4 臨床症狀與病理變化
. 5
1-5 致病機轉
. 6
1-6 豬瘟病毒的標的細胞與免疫調控
. 6
1-7 兔化豬瘟疫苗與次單位豬瘟疫苗
. 8
第二節 豬第二型環狀病毒 2-1 病毒學分類
. 9
2-2 歷史背景與流行病學
.10
2-3 豬環狀病毒傳播方式
.11
2-4 臨床症狀與離乳後多系統性消耗症侯群
.11
2-5 豬環狀病毒標的細胞與免疫調控
.12
第三節 豬相關病毒共同感染之免疫干擾 3-1 豬第二型環狀病毒與相關病毒共同感染
.13
3-2 豬第二型環狀病毒影響兔化豬瘟疫苗之效價
.16
第四節 豬單核球來源之樹突細胞研究模式 4-1 豬單核球來源樹突細胞簡介
.19
第三章 材料與方法
.22
第一節 實驗設計 1-1 實驗設計與流程圖
.22
第二節 實驗材料 2-1 實驗動物
.23
2-2 血球分離相關藥品
.23
2-3 細胞培養液和試劑
.24
2-4 豬第二型環狀病毒與兔化豬瘟疫苗病毒株
.25
2-5 核酸萃取及聚合酶鍊鎖反應之藥品
.25
2-6 流式細胞儀相關藥品
.25
2-7 酵素連結免疫分析法
.26
2-8 免疫螢光染色相關試劑
.27
2-9 儀器
.27
第三節 實驗方法 3-1 細胞分離與培養
.27
iv
3-1.1 豬周邊血液單核細胞的分離與純化 27
3-1.2 MACS 磁珠系統分選 SWC3+細胞與培養 28
3-2 豬第二型環狀病毒對兔化豬瘟疫苗在樹突細胞的影響
.29
3-2.1 以免疫螢光染色法檢測病毒對樹突細胞的感染率 29
3-2.2 以流式細胞儀檢測細胞表面抗原 30
3-2.3 以 AV-FITC/PI 染色檢測細胞凋亡和壞死率 31
3-2.4 S. aureus-FITC 檢測細胞攝取顆粒性抗原的能力 32
3-2.5 DQTM-OVA 檢測細胞攝取可溶性抗原的能力 32
3-2.6 以酵素連結免疫分析法檢測細胞激素蛋白表現量 33
3-2.7 以 Real-time PCR 偵測細胞激素 mRNA 表現量 34
3-3 統計分析
.35
第四章 結果 第一節 細胞純化
.37
第二節 豬第二型環狀病毒對兔化豬瘟疫苗在單核球來源樹突細胞的影響 2-1 病毒對單核球來源之樹突細胞感染率
.37
2-2 單核球來源之樹突細胞相關細胞表面抗原表現結果
.38
2-3 感染病毒後細胞之存活率、壞死率與凋亡率
.38
2-4 細胞攝取抗原之能力
.
412-5 單核球來源之樹突細胞相關細胞激素蛋白質的表現量
.42
2-6 單核球來源之樹突細胞相關細胞激素 mRNA 的表現量
.44
第五章 討論
.54
第六章 參考資料
.63
v
表次
Table 1.引子序列 36
vi
圖次
Fig.1. 豬的第二型環狀病毒(PCV2)和兔化豬瘟疫苗病毒株(LPCV)接種 於單核球來源之樹突細胞(MoDCs)免疫螢光染色(IFA)
47
Fig.2. 豬的第二型環狀病毒(PCV2)和兔化豬瘟疫苗病毒株(LPCV)接種 於單核球來源之樹突細胞(MoDCs)後的感染率(Infection Rate)
48
Fig.3. 單核球來源之樹突細胞(MoDCs)細胞表面抗原 CD14、CD80、
CD86、MHC I 和 MHC II 在接種豬的第二型環狀病毒(PCV2)和 兔化豬瘟疫苗病毒株(LPCV)後的第 48 小時之表現情形
49
Fig.4. 豬的第二型環狀病毒(PCV2)和兔化豬瘟疫苗病毒株(LPCV)接種 於單核球來源之樹突細胞(MoDCs)後細胞存活、凋亡及死亡的情 形
50
Fig.5. 豬的第二型環狀病毒(PCV2)和兔化豬瘟疫苗病毒株(LPCV)接種 於單核球來源之樹突細胞(MoDCs)後細胞攝取抗原的能力
51
Fig.6. 單核球來源之樹突細胞(MoDCs)在豬的第二型環狀病毒(PCV2) 和 兔 化 豬 瘟 疫 苗 病 毒 株(LPCV) 感 染 後 所 誘 導 的 細 胞 激 素 (Cytokine)和 Toll-like receptor(TLR)之 mRNA 相對表現量
52
Fig.7. 單核球來源之樹突細胞(MoDCs)在豬的第二型環狀病毒(PCV2) 和 兔 化 豬 瘟 疫 苗 病 毒 株(LPCV) 感 染 後 所 誘 導 的 細 胞 激 素 (Cytokine)蛋白質表現量
53
2
第一章 序言
豬瘟為豬隻高致死性之病毒性疾病，臨床上以發燒及全身臟器出血為主徵，
感染率與死亡率均高達95%。豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)對免疫 細胞具有特殊的親和性，會造成白血球減少症及淋巴細胞的流失等，故免疫系統 的傷害是該疾病最重要的致病機制。從日據時代以來，豬瘟病毒始終嚴重困擾著 國內養豬產業，並造成嚴重經濟損失。此現象持續至李崇道及林再春博士研發出 兔化豬瘟疫苗(Lapinized Philippines Coronel Vaccine, LPCV)後，方使整體豬瘟疫情 獲得控制。由於此疫苗可藉由誘發體液性與細胞性免疫反應達到完全保護的功 效，因此，LPC 疫苗長久已被視為防治與控制豬瘟的重要利器。近年，隨著第二 型豬環狀病毒(Porcine Circovirus type 2, PCV2)的入侵，國內養豬場幾乎皆已受到此 病毒的侵襲。此病毒可導致離乳仔豬罹患離乳後多系統性消耗症候群(PMWS)和表 現嚴重的免疫抑制，而PMWS 是最普遍的 PCV2 相關疾病(PCV2-associated diseases, PCVAD)。PCVAD 在全球的養豬產業中常造成嚴重的經濟損，PMWS 通常好發於 出生後20-120 天的豬隻，尤其是出生後 60-80 天的豬隻罹患 PMWS 的機率最高，
這段時間剛好和兔化豬瘟疫苗(LPC)的免疫適應期重疊，這對 LPC 疫苗所誘導的免 疫保護有不利的影響。本實驗室在先前已觀察到 PCV2 感染會降低兔化豬瘟減毒 疫苗效力的情形，在實驗當中，如果沒有先感染 PCV2，在遇到野生型(wild-type) 豬瘟病毒時，LPCV 可以給予豬隻完全的保護，不會出現發燒、病毒血症和病毒釋 出於唾液或糞便等臨床症狀。但如果已有 PCV2 的存在時，幾乎多數的豬隻即使 有接種LPCV，還是會出現發燒等臨床症狀，此結果證明 LPCV 的效力會因為 PCV2 而減低。雖然上述研究結果在臨床上對於豬隻或許不會引起直接的影響，但對於 一個群體的免疫防治計畫卻出現很大的漏洞，wild-type 的豬瘟病毒很有可能因此 進入農場，造成潛伏性的感染甚至引起疫情的爆發。目前，對於 PCV2 的免疫抑 制能力以及干擾其他病毒功能之機制尚未清楚，因此為釐清兩種病毒之間的交互 作用，為此論文研究之目標。
2
第二章 文獻回顧
第一節 豬瘟病毒
1-1 病毒學分類
豬瘟病毒(Classic swine fever virus, CSFV)是一種小型，具有套膜的正單股 RNA 病毒，屬於黃病毒科(Flaviviridae)，瘟疫病毒屬(Pestivirus)。瘟疫病毒屬包括四種 病毒：豬瘟病毒(CSFV)、第一型牛病毒性下痢病毒(bovine viral diarrhea, BVDV)-1、
第二型牛病毒性下痢病毒(BVDV-2)及羊先天髓鞘形成不全病毒(Border disease virus, BDV) (Becher et al., 1999)。豬瘟病毒在 pH 5-10 的環境下能穩定生存，當 pH 值小於5、使用有機溶劑(例如乙醚或氯仿)、清潔劑及氫氧化鈉(2%)可去除豬瘟病 毒之活性。然而，豬瘟病毒在冷、潮濕和蛋白質豐富的環境條件下可存活於20°C 兩 個星期，4°C 則可存活六個星期以上(Haas et al., 1995)。
豬瘟病毒的基因長度大約為 12.3kb，其中在 5’非轉譯區包括 375 nt 的內部核 醣體進入位(Internal Ribosome Entry Site, IRES)、一個開放性閱讀框架(Open reading frame,ORF)，其編碼長度約為 3898 個胺基酸大小的蛋白質(polyprotein)和包括 230 nt 的 3’非轉譯區。此蛋白質經由病毒本身的轉譯和宿主水解蛋白質(protease)的酵 素 處 理 後 ， 可 形 成 四 個 結 構 性 和 八 個 非 結 構 性 且 具 有 功 能 的 蛋 白 質 ： NH2-Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2.3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH (Lindenach et al., 2001; Le Potier et al., 2006)。這些結構性和非結構性蛋白的功能已經被研究和描 述，而當病毒顆粒經由宿主細胞的胞釋作用釋出時，在形態學上通常不會造成細 胞的損傷(Lindenach et al., 2001; Le Potier et al., 2006)。在豬瘟病毒的複製過程中，
Npro蛋白是第一個被編碼出的非結構性蛋白，在此過程中，Npro蛋白和C 蛋白之間 會自動裂解開來，分裂的位置會直接突變形成具有水解蛋白功能的Glu-22、His-49 和Cys-69(Lindenach et al., 2001)。結構性蛋白包括核醣蛋白衣(nucleocapsid) C 蛋白 以及套膜醣蛋白(envelope glycoprotein) Erns、E1 和 E2，其中 C 蛋白是使 Erns醣蛋 白進入到內質網中的起始信號(Lindenach et al., 2001)，Erns醣蛋白會強力與細胞表 面受體結合，降解核醣核酸，此蛋白對淋巴球具有毒性，在感染豬瘟病毒的期間 也會誘導中和抗體的表現(van Gennip et al., 2005)。另外，E2 醣蛋白會與細胞表面
3
受體結合並誘導中和抗體，但是E2 醣蛋白結合的受體和 Erns醣蛋白結合的受體不 同(Hulst et al., 1997) 。 NS3 蛋 白 具 有 RNA 解 旋 酶 、 絲 氨 酸 水 解 蛋 白 和 RNA-stimulated NTPase 的活性，其中絲胺酸水解蛋白會裂解 NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B (Lindenach et al., 2001)。NS4A 蛋白係 NS3 絲胺酸水解蛋白的輔因子。
NS5A 蛋白推測為在 RNA 複製時之磷酸化蛋白。NS5B 蛋白為核醣核酸聚合酶，
負責將RNA 引子模板延伸製作成雙股 RNA (Xiao et al., 2003)。
1-2 歷史背景與流行病學
豬瘟病毒的基因型(genotypes)分為 1、2、3 共三種，依照 E2 和 NS5B 的部分 序列，每個基因型又可區分為三到四種亞型(sub-genotype)：1.1、1.2、1.3；2.1、
2.2、2.3；3.1、3.2、3.3、3.4 (Paton et al., 2000)，有關豬瘟病毒在基因庫中的分子 流行病學是非常重要的，在爆發疫情的地區可以幫助瞭解病毒的來源為何，並且 能針對此病毒提出適當的撲滅計畫(Vileck et al., 2006)。一般而言，作為經濟動物 使用的豬隻在澳洲、紐西蘭、北美洲和歐洲西部，豬瘟已經被清除(Paton et al., 2000)，然而，近十年在歐洲中部和東部、拉丁美洲及某些亞洲國家豬瘟又再度出 現；在歐洲，所有的豬瘟在 1970 年前發現時皆為第一基因型，但是在 1980 年到 1990 年這段時期，開始從各個歐洲國家分離出不同的基因型，例如 sub-genotype 2.1、2.2 和 2.3 (Paton et al., 2000; Stergeman et al., 2000; Biagetti et al., 2001)。
目前在某些歐洲國家爆發的豬瘟病毒，被懷疑和野生豬隻的遷徙有關(Paton et al., 2000; Leifer et al., 2010)，在拉丁美洲只有第一型豬瘟病毒被發現的相關研究報 導，在此地區流行的是sub-genotype 1.1、1.2 和 1.3 (Paton et al., 2000; Pereda et al., 2005; Sabogal et al., 2006)。另外也從古巴分離出 sub-genotype 1.2，從宏都拉斯和瓜 地馬拉則分離出sub-genotype 1.3，目前也持續從阿根廷、巴西、哥倫比亞和墨西 哥分離出sub-genotype 1.1 和疫苗病毒株(Pereda et al., 2005)。在亞洲地區，豬瘟病 毒相當普遍存在，亞洲地區不同的國家中都曾分離出第1、2、3 型的豬瘟病毒(Sarma et al., 2011; Blacksell et al., 2005; Desai et al., 2010)。然而，台灣在 1996 年以前發現 的豬瘟病毒株幾乎皆為sub-genotype 3.4，直到 1994 年分離出 sub-genotype 2.1 和 2.2 開始逐漸取代 sub-genotype 3.4(Pan et al., 2005)。
4
1-3 豬瘟病毒的傳播方式
豬瘟病毒主要的傳播方式分為兩種，分別為垂直傳染和水平傳染；垂直傳染 中：病毒在妊娠母豬體內經由胎盤傳染給胎兒，並可能導致流產、死胎、木乃伊 胎及仔豬持續帶有豬瘟病毒(Le Potier et al., 2006; Dewulf et al., 2005)。水平感染：
糞口傳染為最普遍的傳播途徑，豬隻可經由直接接觸、口鼻腔分泌物、結膜、尿 液及糞便受到感染。在歐洲，野豬是很重要的帶原者，豬瘟病毒會從野豬傳染到 家豬，主要是因為家豬間接食用到野豬的內臟或飼料受到野豬汙染，甚至是獵人 所使用過的器具(Dewulf et al., 2005; Leifer et al., 2010)。人類、齧齒類、寵物、節 肢動物和運送過豬隻的車輛都可能機械性的帶原病毒，將豬瘟病毒從疫區帶到非 疫區使豬瘟疫情爆發。如病毒是經由人的方式傳播，最常發生在獸醫、豬人工授 精操作者、篩檢者和生意人的衣服或物品受到被動性的汙染(Le Potier et al., 2006;
Dewulf et al., 2005)。運輸工具方面，如卡車、拖吊車和客車，皆能攜帶受到病毒 汙染的糞便和尿液移動一段很長的距離(Dewulf et al., 2005)。
目前已經有實驗證明馬蠅也是相當重要的傳播因子，馬蠅可將豬瘟病毒從受 到感染的豬隻帶到未受感染的豬隻身上(Dewulf et al., 2005)。事實上，也有實驗證 明空氣傳播也是豬瘟病毒傳播的途徑之一(Weesendorp et al., 2009)。十隻受到豬瘟 病毒感染的豬能在空氣層中生產超過103 TCID50/m3具有感染性的豬瘟病毒，和400 m3/h 的空氣流通率，每隻豬每天估計最大量能散佈 106.1 TCID50的病毒量在空氣層 中(Weesendorp et al., 2009)。豬瘟病毒能散播不同的致死性病毒株，主要的原因是 當豬隻受到強毒株的豬瘟病毒感染時所排出的唾液、糞便、尿液和口腔結膜都含 有 超 過 105 TCID50/ml/day 的 病 毒 量 ， 甚 至 鼻 腔 內 的 液 體 病 毒 量 達 到 107 TCID50/ml/day 以上。當感染中等毒性的豬瘟病毒時，病毒同樣也會在分泌物和排 泄物中慢性排出，雖然慢性感染所排出的病毒量較低，但病毒排出可維持30 天以 上，且最後排出的病毒總量大於強毒株誘導的急性期所排出的病毒量。然而，當 豬隻感染較低毒性的豬瘟病毒株或正處於恢復期時，所排出的病毒量較少且時間 較短；目前豬瘟病毒的傳播還是以慢性感染豬隻，並長時間地排出大量病毒為主 (Weesendorp et al., 2009)。
5
1-4 臨床症狀與病理變化
感染豬瘟病毒所造成的死亡率和臨床症狀不僅和病毒株的毒性有關，和宿主 本身的體重、年齡、健康狀況及免疫情形也有關聯(Moennig et al., 2003)。當豬隻 感染強毒株所引起的急性全身性出血熱時，幾天內就會死亡，其他急性期的症狀 為高燒、食慾不振、嗜睡、結膜充血、腹瀉及耳朵、鼻子、腿部和尾巴的皮膚出 現紅黑色的斑點(Moennig et al., 2003)。當豬隻感染中等毒性病毒株時，根據病程 的發展可能會導致死亡、慢性感染或康復等不同的情況，因此也會出現不同的亞 型症狀(Floegel-Niesmann et al., 2003)。通常豬隻於亞急性期所表現的症狀會比急性 期和緩，當亞急性期的豬隻存活超過30 天以上時，這些豬可能會復原或進入慢性 感染期。在慢性期，豬隻會出現輕微食慾不振、嗜睡、結膜炎、皮膚炎下痢和換 肉率低等症狀；感染弱毒株的豬瘟病毒時，可能不表現病狀或出現少許症狀，通 常最後都會康復(Weesendorp et al., 2009)。
感染豬瘟病毒在急性期和亞急性期最重要的病理變化為嚴重的全身性出血，
在皮膚、淋巴結、喉結、膀胱、腎臟和迴腸結腸交會處皆曾經被描述出現出血性 斑點，在脾臟周邊也會出現多灶性梗塞和硬化(Le Potier et al., 2006; Belak et al., 2008)。而慢性感染期，大腸或迴腸會有鈕扣狀潰瘍和胸腺萎縮等病理變化，出血 性損傷較不常見(Le Potier et al., 2006; Choi et al., 2003)。
在組織病理學上，急性期和亞急性期的典型特徵為出血性和凝固性壞死(Le Potier et al., 2006; Belak et al., 2008)。扁桃腺的病理變化為細胞碎片、嗜中性球和 角質堆積造成的囊腫大和線窩栓塞。淋巴結較常看見急性出血、溫和的淋巴流失 和 濾 泡 壞 死 。 脾 臟 為 淋 巴 流 失 、 濾 泡 壞 死 和 淋 巴 球 出 現 動 脈 周 圍 的 淋 巴 鞘 (Periarteriolar lymphoid sheaths, PALS)。腎臟常發生間質性腎炎和絲球體腎炎。肺 臟支氣管炎幾乎在所有受到感染的豬都可觀察到。在大腦和小腦，主要的病灶為 小神經膠質細胞增生、單核球的發炎反應和內皮細胞的腫脹壞死所造成的血管炎 (Le Potier et al., 2006; Belak et al., 2008)。慢性感染較不常見壞死性損傷，比較明顯 的病理變化為中樞神經發炎和濾泡增生、淋巴結壞死(Le Potier et al., 2006; Choi et
6
al., 2003)。
1-5 致病機轉
口鼻傳染是豬瘟病毒最常見的傳播途徑；當豬瘟病毒進入豬隻體內後，首先 會在扁桃腺大量複製，再藉硫酸肝素(heparin sulfate)和硫酸軟骨素乙糖胺聚醣之受 體(chondroitin sulfate B glycosaminoglycan receptors)進入腺窩上皮細胞、巨噬細 胞、淋巴球和內皮細胞(Belak et al., 2008; Ophuis et al., 2006; Hulst et al., 2000)。六 天之內，豬瘟病毒會從淋巴結藉周邊血液完全散佈到骨髓、胰腺、腦部、迴腸、
腸繫膜淋巴結(Belak et al., 2008; Ophuis et al., 2006)。
在急性期，豬瘟病毒會誘導內皮細胞、淋巴球和骨髓造血細胞凋亡和壞死、
血小板減少症以及擾亂纖維蛋白原之合成所導致的出血(Summerfield et al., 2001;
Bensaude et al., 2004)。豬瘟病毒所誘導的凋亡和壞死，主要發生在 B 淋巴細胞、
CD3+CD4+CD8+記憶型幫手T 細胞、CD3+CD4+CD8-尚未接觸過抗原之幫手T 細 胞、CD3+CD4-CD8+毒殺型T 細胞、αβ-TCR+T 細胞及 CD3+CD4-CD8-/lowγδT 細胞 (Summerfield et al., 1998, 2000, 2001)。淋巴細胞流失在受到感染的豬隻將導致免疫 抑制的情形發生。
1-6 豬瘟病毒的標的細胞與免疫調控
豬瘟病毒主要標的細胞包括內皮細胞、淋巴球、單核球/巨噬細胞系列細胞、
樹突細胞和骨髓造血細胞，並使這些細胞的免疫功能和相關細胞激素功能低下。
病毒在內皮細胞所誘導表現的細胞激素有IL-1、IL-6、IL-8、血管內皮細胞生長激 素、E-selectin 和 integrin-β3，誘導減少分泌的有內皮細胞連接蛋白 43 (endothelial connexin 43)、內皮細胞一氧化氮合成酶 (endothelial nitric oxide synthase)，而當豬 瘟病毒感染內皮細胞時，也會藉由核轉錄因子κB (NF-κB)控制細胞發炎激素和細 胞黏附分子(Bensaude et al., 2004; Hsiao et al., 2010; Tang et al., 2010; Wang et al., 2011)。內皮細胞連接蛋白 43 分泌減少，主要是因連接蛋白 43 啟動子活性減低，
影響AP2 的結合(Hsiao et al., 2010)；另外一氧化氮的生物活性降低是由於一氧化 氮合成酶之啟動子、轉錄因子AP1-SP1 和 GATA1/2 受到調控下降的關係(Wang et
7
al., 2011)。在病毒感染急性期，細胞發炎激素和細胞貼附分子的活性受到影響時，
止血系統將被擾亂導致凝血和血栓，不僅如此，豬瘟病毒也會抑制內皮細胞分泌 IFN-α 和凋亡，並阻止細胞進入細胞週期的 S-phase (Bauhofer et al.,2007; Bensaude et al., 2004; Tang et al., 2010)。
研究顯示，抑制 IFN-α 的分泌和豬瘟病毒的 Npro和Erns蛋白有關。IFN-α 的製 造通常是由dsRNA 所誘導的干擾素調控因子 3 和 7 (interferon regulatory factor 3 and 7,IRF-3 and IRF-7)調控，而 Npro蛋白會阻斷IRF-3 的路徑，進而達到抑制 IFN-α 的作用。Erns蛋白是一種 RNase，主要的功能是裂解 dsRNA，抑制 dsRNA 刺激細 胞產生IFN-α (Bauhofer et al.,2007)。當豬瘟病毒感染細胞時，細胞週期也會受到影 響，豬瘟病毒的NS2 蛋白經由抑制 Endoplasmic reticulum stress (ER stress)阻斷細 胞凋亡，也透過增加NF-κB 和 cyclin A 的分泌防止細胞進入 S-phase (Tang et al., 2010 and 2011)。上述豬瘟病毒誘導的免疫抑制和阻斷細胞凋亡，都是使病毒本身 能在宿主體內的存活和複製更加順利。
豬瘟病毒引起的淋巴球減少症，被證明是豬瘟病毒藉由抑制 Erns和粒線體跨模 電位，間接或直接地誘導淋巴細胞凋亡(Summerfield et al., 1998; Bruschke et al., 1997)，另外，也有研究指出豬瘟病毒感染巨噬細胞時所誘導的 TNF-a 是導致 B 淋 巴細胞凋亡的原因(Choi et al., 2004)；當豬瘟病毒感染 T 淋巴細胞時會增加 CD49d、MHC II 和 Fas 的表現，使得 Fas-Fas 媒介所誘導的凋亡更具感受性 (Summerfield et al., 1998)。單核球/巨噬細胞系列的細胞為豬瘟病毒主要的標的細 胞，當豬瘟病毒順利感染單核球/巨噬細胞系列之細胞時，對病毒會較有利的釋放 更多促進疾病發展的媒介分子和激素，比較不同的是，豬瘟病毒並不會造成此類 型細胞的凋亡和病變(Knoetig et al., 1999)，使單核球和巨噬細胞發炎激素 IL-1、
IL-6、TNF-α 及 PEG2 的表現量增加，並抑制巨噬細胞一氧化氮的製造(Zaffuto et al., 2007; Sánchez-Cordón et al., 2002)。感染豬瘟造成的出血症和淋巴球流失等臨床症狀 和致病機轉，以及豬瘟病毒與淋巴球/巨噬細胞之間的交互作用扮演著很重要的角 色。
8
然而，樹突細胞功能的瓦解在豬瘟病毒造成的致病機轉是很重要的階段。豬 瘟病毒會在樹突細胞中複製，但不會調控 MHC 和 CD80/86 的功能以及 IL-6、
IL-10、IL-12、TNF-α 等細胞激素的表現(Carrssco et al., 2004)，有趣的是，豬瘟病 毒也會藉Npro蛋白抑制樹突細胞分泌IFN-α (Bauhofer et al., 2005)，但有研究指出，
這種抑制的情形只發生在普通的樹突細胞(Conventional dendritic cells, cDC)，在類 漿細胞樹突細胞(Plasmacytoid DC, pDC)，又稱自然製造干擾素的樹突細胞(natural interferon-producing cells, NIPC)不會被 Npro蛋白的抑制作用影響(McCullough et al., 2009)，此種抑制 IFN-α 分泌的機制，使得豬瘟病毒存活率提高並能隨著樹突細胞 移動到全身感染更多組織和器官。
1-7 兔化豬瘟疫苗與次單位疫苗
傳統的活毒減毒疫苗包括 Chinese C strain (C strain)、Japanese guinea-pig exaltation-negative strain (CPE- strain)及 Thiverval strain (T strain)，在畜牧場中是最 常被拿來使用的疫苗。其中C strain 已從兔子繼代數百餘代，製作成臺灣目前最常 使 用 的 兔 化 豬 瘟 疫 苗(Lapinized Philippines Coronel, LPC) ， 另 外 hog cholera Lapinized virus 和 Riems strains 也在不同的國家被使用(van Oirschot, 2003)。在 C strain 的 cDNA 全長序列中，有大約 12 個核甘酸長度的 T-rich 插入子在病毒基因 中的3’NTR 端(Pan et al., 2008)，CPE-疫苗是從強毒性的ALD strain 連續經由不同 的細胞培養製成，和親代的差異有225 個核甘酸。T strain 則是由 Alfort strains 經 過170 次的繼代製作而成(van Oirschot, 2003)。而 Chinese C strain 是一種安全無毒 性的疫苗株，此活毒疫苗會在淋巴器官複製，接種後主要在扁桃腺存在6 到 42 天 (Koenig et al., 2007)，有研究指出，當 C strain 疫苗接種在懷孕的母豬身上，可啟 動相關的體液性免疫和細胞性免疫，從接種後第5 天開始至少可提供 6-18 個月完 整的保護(van Oirschot, 2003)，而抗豬瘟病毒的中和抗體約在接種後第 12 天可被檢 測到，抗體力價在4-12 週達到最高峰，在早期中和抗體尚未出現的階段，主要是 仰賴細胞性免疫的保護(van Oirschot, 2003; Ganges et al., 2008)。豬瘟病毒特異性分 泌IFN-γ 的細胞主要來自於 CD4+CD8+淋巴球，在接種疫苗後的第6-140 天可被檢 測到；PBMC 來源的豬瘟病毒特異性細胞增殖反應主要為 CD4+CD8-和CD4-CD8+T 淋巴球，特異性毒殺細胞主要為CD4-CD8+T 淋巴球(van Oirschot, 2003; Suradhat et
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al.,2007; Pauly et al., 1995; Armengol et al., 2002; Pirios et al., 2003)。
目前市面有兩種商業化的次單位疫苗分別為 BAYOVAC®CSF Marker 和 Porcilis Pesti 較常見，這兩種不同的次單位疫苗皆利用昆蟲桿狀病毒分別表現 32μg 和86-100 ELISA units/dose 的 E2 蛋白製作而成(Dong et al., 2007)，接種後只誘導體 液性免疫，缺乏細胞性免疫，但在臨床研究顯示在接種 E2 次單位疫苗後的第 14 天開始即可保護豬隻不被強毒株的豬瘟病毒感染，免疫效果至少可持續13 個月，
雖然施打疫苗的豬隻不會出現臨床症狀，但在施打後的第14 天還是檢測到病毒血 症及分泌物有病毒的釋出，目前還沒辦法完全避免垂直及水平的病毒傳播(Dong et al., 2007; van Oirschot, 2003)。
新型豬瘟疫苗的發展，係源自於為了讓 E2 次單位疫苗能成功誘導抗豬瘟病毒 的特異性中和抗體。大部分的多胜肽疫苗是使用E2 的 A 或 BC domain，但評估發 現免疫效不理想(Dong et al., 2007; Beer et al., 2007)。新型的 DNA 疫苗是用質體結 構，將E2 基因和細胞激素基因(如 IL-2、IL-3、IL-12、IL-18)結合，或是調整細胞 表現分子的基因(例如 CD154 和 CD40)以及結合刺激免疫反應的 CpG 和 BCG 等，
這些新型的疫苗都在發展當中(Ganges et al., 2008; Dong et al., 2007; Beer et al., 2007)。多數 DNA 重組疫苗都能誘發出體液性及細胞性免疫，但在接種疫苗後到 給予豬隻保護的時間比減毒疫苗及E2 次單位疫苗都要來的長，這段免疫空窗期是 DNA 疫苗需要改善的缺點(Ganges et al., 2008; Dong et al., 2007; Beer et al., 2007)。
以病毒為載體的疫苗包括Poxvirus、Pesudorabies virus (PRV)、porcine adenovirus 和BVDV 較常被應用(Dong et al., 2007; Beer et al., 2007)。多數 E2 嵌合重組活毒疫 苗免疫於豬隻都能夠提供完整的保護，但重組疫苗株有可能會和wild-type 病毒株 產生基因重組，這是其潛在風險，另外雖然施打重組疫苗對豬隻不會致死，但對 其他感受性高的宿主仍具有毒性，且會干擾病毒載體所誘導的中和抗體效價(Dong et al., 2007; Beer et al., 2007)。
第二節 豬第二型環狀病毒
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2-1 病毒學分類
豬環狀病毒(Porcine circovirus, PCV)為一小型，大小約 14-19nm、正二十面體 之 不 具 套 模 的 單 股 環 狀 DNA 病 毒 ， 基 因 序 列 長 1.76kb ，屬於環狀病毒科 (Circoviridae)，環狀病毒屬(Circovirus) (Finsterbusch et al., 2009; Mankertz et al., 2004)。其中環狀病毒屬還包括第一型、第二型豬環狀病毒(Porcine circovirus type 1、type2, PCV1, PCV2)、鵝環狀病毒(Goose circovirus, GoCV)、鸚鵡喙羽症病毒 (Psittacine beak and feather disease, PBFDV)、鴿環狀病毒(Pigeon cirovirus,PiCV)等 病毒(Bassami et al., 1998; Todd, 2004)。
豬環狀病毒最早於汙染的豬腎細胞株(PK15)被發原，此病毒對酸性環境 pH=3、氯仿和高溫皆具抵抗性。豬環狀病毒因基因序列和病源性的差異將之分為 兩型，其中最早由PK15 分離無病原性的病毒為第一型豬環狀病毒(PCV1)，另外由 豬離乳後多系統消耗性症侯群(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS) 所分離，具有病原性的病毒為第二型豬環狀病毒(PCV2) (Meehan et al., 1998;
Morozov et al,1998)。PCV1 的基因大小約 1758-1760 個核甘酸，不同的 PCV1 病毒 株基因序列相似度約98-99%。而 PCV2 的基因大小約 1767-1768 個核甘酸，在不 同國家所分離到的PCV2 病毒株基因序列相似度為 93-99% (Muhling et al., 2006)，
其中包括PCV2a、PCV2b 和 PCV2c 三種基因型(Segalés J et al., 2008; Cortey et al., 2011)；研究指出，PCV2 有 11 個開放式閱讀框架(Open reading frams, ORF)，其中 ORF1、ORF2 和 ORF3 已被證明是複製相關蛋白、衣殼蛋白及凋亡相關蛋白 (Finsterbusch et al., 2009; Mankertz et al., 2004)。PCV2 的核酸序列在 ORF1 的相似 度為97-100%，ORF1 所編碼的複製相關蛋白為 Rep 和 Rep’(Larochele et al., 2002;
Mankertz et al., 2004)；PCV2 的核酸序列在 ORF2 的相似度為 91-100%，ORF2 主 要負責轉譯病毒的衣殼蛋白(capsid protein)；ORF3 編碼凋亡相關的蛋白質(Liu et al., 2005)。
2-2 歷史背景與流行病學
1996 年 ， 一 種 新 興 疾 病 - 豬 離 乳 後 多 系 統 消 耗 性 症 侯 群 (Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)在加拿大首次被發現，之後在美洲、歐洲
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和亞洲也陸續出現病例。由於從PMWS 發病的豬隻所分離出的環狀病毒和從被汙 染的PK15 分離出的環狀病毒，不管在基因序列、抗原性和病原性都有差異，因此 將此病毒命名為豬第二型環狀病毒(PCV2) (Meehan et al., 1998)，目前 PMWS 在許 多國家廣泛存在且造成許多經濟上的損失(Allan and Ellis, 2000)。而台灣首次發現 PCV2 的時間為 2001 年，之後的調查發現 PCV2 血清抗體陽性率為 83.5%，此結 果顯示PCV2 在台灣已普遍存在(Wang et al., 2004)。由世界各地分離出的 PCV2 雖 然同屬於一樣的病毒株，但基因序列仍有差異，目前也無證據顯示 PCV2 的基因 序列和地域性以及疾病的嚴重性有關連(Cheung et al., 2007; de Boisseson et al., 2004)。
2-3 豬環狀病毒傳播方式
豬 第 二 型 環 狀 病 毒 (PCV2) 的 垂 直 及 水 平 傳 播 方 式 已 被 證 明 為 環 境 傳 播 (Grau-Roma et al., 2011)；在水平傳播中，眼睛、咽喉、扁桃腺和支氣管分泌物、
唾液、糞便、尿液、母乳及精液都是重要的傳播因子(Chung et al., 2005; Shibate et al., 2006; Grau-Roma et al., 2011)，PCV2 的傳染經常是由間接或直接接觸到受到 PCV2 感染豬隻的分泌物所造成；在垂直傳染中，PCV2 可透過懷孕母豬的胎盤傳染給胎 兒(Pensaert et al., 2004, Grau-Roma et al., 2011)。
2-4 臨床症狀與離乳後多系統性消耗症侯群
豬離乳後多系統消耗性症侯群(PMWS)常發生於出生後 25-120 天的豬隻，
PMWS 的豬隻臨床上常出現皮膚蒼白、嗜睡、體重減輕、黃疸、呼吸急促、下痢 和發燒等非特異症狀；PCV2 的感染亦可為不顯性感染。有研究指出，出現 PMWS 症狀的豬隻只有15%是單獨感染 PCV2，大多數的 PMWS 都是和其他病原共同感 染，因此病情的發展和症狀較複雜和難預料，PMWS 的臨床症狀大都非特異性。
要確診為 PMWS 需同時具備以下條件：(1)耗弱、呼吸困難和鼠蹊淋巴結腫大(2) 組織病理學的損傷為淋巴組織出現中等到嚴重的淋巴細胞流失和組織球中有葡萄 球狀雙染性的嗜鹼性包涵體(3)受到損傷的淋巴組織內可檢測到高 PCV2 病毒量 (Segalés J et al., 2004; Chae, 2004)。
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具有 PMWS 症狀的豬隻常見到鼠蹊部、腸繫膜和縱膈腔的淋巴結腫大，在某 些病例可見到淋巴結有多發性至融合性的壞死、胸腺萎縮、肺葉塌陷和肝腫大等 病理變化，部分病例亦可見到黃疸、腸道蒼白、潰瘍等現象(Rosell et al., 1999;
Segalés J et al., 2004)。在組織病理學的診斷當中，PMWS 主要的病變發生於淋巴組 織，包括淋巴結、扁桃腺、peyer’s patches 和脾臟等，典型特色為肉芽腫性的炎症 反應、組織球內有嗜鹼性包涵體、多發性凝固性壞死、不同程度的淋巴細胞流失 伴隨著組織球和多核巨細胞浸潤。其他組織的病變有間質性肺炎、肝細胞發炎、
腎炎等(Allan and Ellis, 2000; Darwich et al., 2004; Segalés J et al., 2004)。
有研究指出，豬第二型環狀病毒(PCV2)是藉由已受到感染豬隻的口鼻或呼吸 道分泌物直接接觸未受感染的豬隻散播。當病毒進入宿主體內會先在頭部的扁桃 腺和淋巴結，之後進入單核球、巨噬細胞及濾泡的樹突細胞，但不會進行複製。
PCV2 在樹突細胞是不易被察覺的，細胞對病毒沒有毒殺作用，但病毒有可能會改 變細胞表面抗原MHC I 和 MHC II 的表現(Vincent et al., 2003)。另外，也有學者認 為PCV2 感染單核球的目的是為了藉單核球散佈到全身，並感染淋巴器官(Darwich et al.,2004; Gillespie et al., 2009)。但是當淋巴球未受到抗原刺激時，病毒的感染率 和病毒量都會較低，而且並不會出現 PMWS 的症狀。然而，PCV2 次臨床感染 (subclinically infected)豬隻若受到具傳染性或不具傳染性的輔助因子(cofactors)刺 激免疫系統，就有可能使病毒複製效率提高並發展成 PMWS 豬隻(Darwich et al.,2004)。使用 Concanavalin A(con A)作為免疫刺激原活化淋巴球，對 PCV2 也有 類似於酵素催化的功能，使淋巴球增值和 PCV2 的複製效率提高；也有研究特別 注意到，PCV2 需在細胞週期中的 S phase 並依賴宿主細胞核內的聚合酶才能順利 進行複製(Lin et al.,2008; Tischer et al., 1987)。
2-5 豬第二型環狀病毒標的細胞與免疫調控
在有 PMWS 症狀的豬隻可以明顯在淋巴組織看到細胞激素的變化，例如在胸 腺、淋巴結、脾臟和血液可以檢測到高表現量的IL-10 (Doster et al., 2010; Crisci et al., 2010; Sipos et al., 2004; Darwich et al.,2003 and 2004)。有趣的是，會表現大量 IL-10 的細胞通常是 CD163+單核細胞/巨噬細胞等非主要標的細胞(bystander)和少
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數 CD4+和 CD8+細胞，IL-10 並非由真正受到 PCV2 感染的細胞所表現(Doster et al.,2010; Crisci et al., 2010)。另外有研究在各淋巴組織的 Th1 和 Th2 觀察到 IL-2、
IL-4、IL-10、IL-12p40 及 IFN-γ 的 mRNA 表現量減少(Darwich et al.,2003)。而 PCV2 感染肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage, AM)時會明顯的分泌 TNF-α，以及表現 IL-8 和MCP-1 的 mRNA (Chang et al., 2006)，在單核球分化而成的巨噬細胞也可檢測到 MCP-1 和 MIP-1 明顯的表現(Tsai et al., 2010)。從以上的結果可以推測，當 PCV2 感染巨噬細胞來源細胞時，會增加發炎相關細胞激素的分泌。
目前已經有研究證明 PCV2 可感染樹突細胞和巨噬細胞(Chang et al., 2006;
Vincent et al., 2003)。單核球來源之樹突細胞(Monocyte-derived dendritic cells, MoDCs)和骨髓來源之樹突細胞(Bone marrow-derived DC, BMDCs)可藉由胞吞的 方式使 PCV2 存在於細胞中，感染率約 80-90%，PCV2 不會造成 DC 死亡也不會 在DC 內複製。在 DC 發展過程中的細胞表面抗原 MHC I、MHC II、CD14、CD16、
CD25 和 CD80/86 皆不受 PCV2 影響(Vincent et al., 2003)。另外，PCV2 對肺泡巨 噬細胞(AM)的感染率超過 90%，PCV2 可存在於細胞質和細胞核中，當 PCV2 感 染AM 時不會造成細胞凋亡率上升，但細胞吞噬和微生物毒殺能力會明顯的降低，
而IL-8、TNF-α、AMCF-II、G-CSF 和 MCP-1 等細胞發炎激素皆明顯的增加(Chang et al., 2006)。上述相關研究顯示 PCV2 的抗原和 DNA 會堆積於單核球/巨噬細胞之 系列細胞當中，但 PCV2 對細胞不會造成損傷也不會在此類細胞複製，因此推測 這些免疫相關的細胞只是扮演傳播病毒的媒介角色。
第三節 豬隻相關病毒共同感染之免疫干擾
3-1 豬第二型環狀病毒與相關病毒共同感染
Kekarainen 等學者(2008)認為免疫反應在 PCV2 感染造成的損傷中佔最重要的 因素。PMWS 的豬隻會發現嚴重的淋巴組織損傷，包括淋巴細胞流失和肉芽腫性 炎症反應及改變淋巴器官和 PBMCs 之細胞激素的表現。例如誘導 IL-4 的表現量 下降以及IL-2、IL-10 和 IFN-γ 的分泌，其中，試管內的實驗顯示 PCV2 似乎能誘 導IL-10 的表現量上升(Darwich et al., 2003)。體外研究也觀察到感染 PCV2 豬隻在
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胸腺的IL-10 mRNA 表現量有上升的趨勢(Sipos et al., 2004)。目前普遍認為受到 PCV2 感染的仔豬之血液中的 IL-10 和 PMWS 的發展有重要的關聯(Stevensonet al., 2006)。
如先前所述，PCV2 不會在 DC 內複製，也不會改變 DC 抗原的攝取及表現 (Vincentet al., 2005)，然而，PCV2 的感染會抑制骨髓系和類漿細胞之樹突細胞分泌 IFN-α 和 TNF-α (Vincent et al., 2005 and 2007)。為了研究 PCV2 是否藉由分泌 IL-10 影響假性狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)之記憶性抗原(recall antigen)反應，
Tuija 在 10-13 週齡的實驗豬隻先接種商業化減毒 PRV 疫苗，之後分別給予 PCV2 和PRV 的刺激，檢測 IFN-γ、IFN-α、 IL-10、 IL-2 和 IL-12 在蛋白質層次表現的 情形，藉此探討影響 PRV 記憶性抗原的因子，結果顯示，在 PBMCs 和 BMDCs 研究模式之下，PCV2 可抑制 IFN-α 的表現量，當 PCV2 和 PRV 共同刺激時，IL-10 的分泌量會明顯的增加(Kekarainen et al., 2008)。先前的研究指出(Darwichet al., 2003a, b; Hasslung et al., 2005; Stevenson et al., 2006) PCV2 的感染可能會影響細胞 激素表現的趨勢，並推測IL-10 可能是影響細胞激素分泌的機制之一，但沒有研究 能夠明確指出相關的資料。因此Kekarainen等學者的研究發現PCV2 所誘導的 IL-10 會使記憶性抗原的反應降低，並連帶抑制IFN-γ、IFN-α、IL-2 和 IL-12 的表現量，
其中令人驚訝的發現是，PCV2 會抑制 IFN-α 進而影響記憶性抗原的反應，但在 naïve 細胞 PCV2 則會誘導 IFN-α 的產生，此作用機制尚未清楚，但推測可能是 PCV2
會鎖住細胞的記憶功能，干擾記憶型 T 細胞和抗原呈現細胞之間的交互作用。以
IL-10 為媒介抑制 T 細胞活性在某些人類及動物病毒已經被證明，而 IL-10 所誘導 的免疫抑制也被認為是導致病毒能持續感染的原因之一(Brooks et al., 2006)。在人 類的文獻指出IL-10 抑制 IL-12 和 IL-2，進而影響到 Th1 的增值反應(Taga et al., 1993)。這些研究幫助我們了解 PCV2 具有強烈抑制特異性抗原記憶反應(recall antigen)的趨勢，這對於某些需要使用疫苗來防治的疾病會造成衝擊性的影響 (Kekarainen et al., 2008)。
Chang 等 學 者 (2005) 認 為 PCV2 和 豬 呼 吸 道 與 生 殖 綜 合 症 病 毒 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)在豬身上都是屬於常見的病
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毒，因此使用豬肺泡巨噬細胞對這兩種病毒進行共同感染(co-infection)，並觀察細 胞的形態及相關的免疫影響。研究結果顯示當 PCV2 單獨感染時不會造成細胞死 亡也有較高的抗原包涵率(antigen-containing)。當 PRRSV 單獨感染時細胞有較高的 死亡率和凋亡率，而共同感染時，PRRSV 的傳播率和細胞死亡率、凋亡率都較低，
特別的是，在有PCV2 感染的組別都有高表現量的 IFN-α。在 mock 和 PRRSV 單 獨感染的組別皆未觀察到有IFN-α 的分泌，另外 PRRSV 感染豬肺泡巨噬細胞所引 起的細胞病變效應(cytopathic effect, CPE)也會因為 PCV2 的存在而相對減少，但加 入IFN-α 的中和抗體，此情形就不會發生，因此 Chang 等人推論 PCV2 的感染會 誘導IFN-α 的產生，因此降低 PRRSV 的 CPE 和感染率(Chang et al., 2005)。
Cecere 等人在 2012 年發表了關於 PCV2 和 PRRSV 共同感染 DC 所誘導 CD4+CD25+FoxP3+Tregs的相關研究。以病毒為媒介調節 T 細胞(regulatory T cells, Tregs)對宿主的免疫反應是一種特異性的致病機制，且有利於病毒的生存(Belkaid, 2007)。Tregs大致分成胸腺來源的自然Tregs和後天誘導的 Tregs，以及胸線來源以外 的naïve CD4+T 細胞(Askenasy et al., 2008)，目前 CD4+CD25+FoxP3+Tregs細胞在豬 的研究模式中已被確認具有不同機制的抑制活性(Kaser et al., 2008; Kaser et al., 2011)。病毒感染藉由 Tregs改變宿主的免疫反應已經在許多病毒中發現，包括疱疹 病毒(herpes simplex virus)、C 型肝炎病毒(hepatitis C virus)、B 型肝炎病毒(hepatitis B virus) 、 人 類 免 疫 不 全 病 毒 (human immunodeficiency virus) 、 巨 細 胞 病 毒 (cytomegalovirus)和人類疱疹病毒第四型(Epstein-Barr virus) (Belkaid, 2007; Li et al., 2008; Rouse et al., 2006)；近幾年的研究顯示當 PCV2 和 PRRSV 共同感染 PBMC 時會減少IFN-γ 的表現量和增加 IL-10 的分泌(Shi KC, 2010)，而 PRRSV 不管是在 試管內或體內實驗都有誘導Tregs的情形發生。PCV2 雖然能夠大量堆積在 DC 的細 胞質中，但沒有結果顯示PCV2 會在 DC 內複製，病毒的傳播也不會活化同源性的 T 細胞和造成細胞的死亡(Steiner et al., 2008; Vincent et al., 2005; Vincent et al., 2003)。而當宿主啟動抗 PCV2 之免疫反應時，PCV2 誘導的 Tregs可能會減少IFN-γ 的反應、抑制 IL-2 以及阻斷效應型 T 細胞(effector T cells)的趨化作用和增值 (Askenasy et al., 2008)。在 PCV2 和 PRRSV 共同感染所誘導的 Tregs研究結果顯示 會增加PCV2 的複製和臨床徵狀，除了增加 IL-10 的表現量，抑觀察到 IL-2、IL-4、
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IL-6、IL-12p40 和 IFN-γ 有被抑制的情形(Shi KC, 2010)。
Cecere 等人(2012)的研究結果為 PCV2 和 PRRSV 共同感染 DC 時，可在共同 感染組觀察到TGF-β 的表現量大於單獨感染 PCV2 或 PRRSV 的組別，但 IL-10 在 所有實驗組卻沒有顯著差異，這樣的結果相似於2009 年 Silva-Campa 等人所發表 的文獻(Silva-Campa et al., 2009)。在細胞培養上清液檢測到的 TGF-β 可能是 DC 或 T 淋巴球所製造，和 CD4+CD25+FoxP3+Tregs似乎沒有直接的關聯性，因此 TGF-β 的分泌可能還有其他因子所誘導。另外在Cecere 等人的研究中並沒有使用 LPS 或 其他病毒刺激 DC 成熟，所以沒辦法明確指出病毒特異性的增加 Tregs反應和發炎 激素的產生，是否符合體內真實的情況。
3-2 豬第二型環狀病毒影響兔化豬瘟疫苗之效力
目前已經有研究證明 PCV2 的感染的會減少豬呼吸道與生殖綜合症病毒 (PRRSV)疫苗的保護效力(Opriessnig et al., 2006)，也有文獻指出 PCV2 的病毒構造 或 PCV2 所誘導的可溶性分子 IL-10 會影響假性狂犬病病毒(PRV)的記憶性抗原 (recall antigen)反應(Kekarainen et al., 2008)，Huang 等人(2011)觀察到 PCV2 感染會 降低兔化豬瘟減毒疫苗(Lapinized Philippines Coronel Vaccine, LPCV)效力的情形，
在實驗當中，如果沒有先感染PCV2，在野生型(wild-type)豬瘟病毒功毒時，LPCV 可以給予豬隻完全的保護，不會出現發燒、病毒血症和病毒釋出於唾液或糞便等 臨床症狀。但如果事先已經有PCV2 的存在時，幾乎多數的豬隻即使有接種 LPCV，
還是會出現發燒等臨床症狀；此結果證明LPCV 的效力會因為 PCV2 而減低。
在淋巴球活化和增值的分析中，先感染 PCV2 的實驗組 IgM+、CD4+、CD8+
和CD4+CD8+淋巴球群皆明顯地低於沒有PCV2 感染的實驗組。此 PCV2 所主導之 干擾淋巴球的活化和降低宿主體液性免疫和細胞性免疫，推測和抗豬瘟病毒的中 和抗體短暫延遲出現，以及抑制對豬瘟病毒具有特異性PBMC 的增殖有關連。根 據以往的研究顯示PCV2 可能會藉由 IL-10 和 CpG motif 影響 PRV 的記憶性抗原，
但在Huang 等人的研究中顯示 PCV2 的 CpG motif 和所誘導的 IL-10 對豬瘟病毒特 異性的 PBMC 增殖反應在每個組別沒有明顯的差異，因此推論 PCV2 減少 LPCV
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疫苗的效價和PCV2 影響 PRV 記憶性抗原的致病機制可能不同。所有的活毒減毒 豬瘟疫苗都仰賴著疫苗所誘導的體液性免疫和細胞性免疫才能發揮完整的免疫保 護效力，在剛施打疫苗的早期階段，抗豬瘟病毒的中和抗體還未出現時，細胞性 免疫就顯得格外重要。對豬瘟病毒具有特異性的細胞性免疫包括IFN-γ 分泌細胞、
細胞增殖的活性以及毒殺型淋巴細胞，皆和對抗豬瘟病毒的感染有關聯。而當 PCV2 存在時，LPCV 所誘導的體液性免疫和細胞性免疫都明顯地減少活性，雖然 中和抗體的力價沒有差異，但在抗體出現的時間卻有延遲的反應。當LPC 疫苗沒 有辦法誘導完整的免疫反應時，遇到wild-type 的豬瘟病毒便會引起短暫的發燒以 及病毒血症等臨床症狀。另外預先感染PCV2 所引起的 CD4+、CD8+和CD4+CD8+ 淋巴球群的減少也意味著幫手型(helper)T 細胞和毒殺型(cytotoxic)T 細胞被相對抑 制；然而，當給予去活性(UV-inactivated)的 PCV2 時也同樣能夠抑制豬瘟病毒特異 性PBMC 的增殖，有文獻指出 PCV2 病毒顆粒的殼衣蛋白(capsid protein)在感染期 間 會 與 細 胞 表 面 的 硫 酸 肝 素(heparin Sulfate) 和 硫 酸 軟 骨 素 乙 醣 胺 聚 醣 受 體 (chondroitin sulfate B glycosaminoglycan receptors)結合，因此懷疑 PCV2 所誘導的 免疫缺陷可能和病毒本身的殼衣蛋白有關(Misinzo et al., 2006)。在沒有給予 LPC 疫苗的情況下，如先感染PCV2 再感染 wild-type 的豬瘟病毒時，豬隻存活的時間 會比沒有感染PCV2 的豬隻還短，且臨床症狀會更加嚴重，此結果推論 PCV2 會調 整宿主的免疫反應，使LPC 疫苗的效力減低，使豬瘟病毒更容易感染並導致更嚴 重的臨床症狀(Huang et al., 2011)。
PCVAD 在全球的養豬產業中常常會造成嚴重的經濟損，PMWS 通常好發於出 生後20-120 天的豬隻，尤其是出生後 60-80 天的豬隻罹患 PMWS 的機率最高(Allan and Ellis, 2000; Darwich et al., 2004)，這段時間剛好和兔化豬瘟疫苗(LPC)的免疫適 應期重疊，這對LPC 疫苗的防治效果有不利的影響(Huang et al., 2011)；從 PMWS 豬隻所分離出的PBMC，給予分裂原刺激也不會正常生產 IFN-γ 或 IL-2(Darwich et al., 2003, 2004)，如單獨將 PCV2 感染 CD172a+單核球系列細胞時可誘導大量 IL-10，PCV2 也有抑制自然干擾素製造細胞(Natural interferon producing cells, NIPC) 製造IFN-α 的情形被描述(Vincent et al., 2005, 2006)，以上結果顯示 PCV2 的基因和 蛋白質結構有可能具有強烈的免疫抑制活性。Huang 等人(2014)提到 LPCV 可以在
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肺泡巨噬細胞中複製，肺泡巨噬細胞能將 LPCV 帶到淋巴組織中並表現抗原予以 刺激免疫細胞，而PCV2 對巨噬細胞的感受性和 LPCV 相似。在 Huang 等人(2014) 使用此模式進行兩種病毒交互作用的研究發現，PCV2 主導的干擾反應係呈現劑量 效應，而PCV2 的 DNA 結構和所誘發的 IFN-γ 或許可以解釋干擾 LPC 疫苗效價的 一種機制；研究結果顯示LPCV 在 AM 的複製會因為 PCV2 的存在而減少。且不 論是預先感染PVC2、同時感染或感染 LPCV 後再感染 PCV2 的結果，肺泡巨噬細 胞中的LPCV 抗原偵測皆明顯地減少，推測 PCV2 可能會抑制 LPCV 進入 AM 或 干擾LPCV 的複製。PCV2 抑制 LPCV 的感染和 PCV2 感染的劑量也有關聯，預先 感染PCV2(pre-infection)會比後感染 PCV2(post-infection)具有更強力的抑制作用。
這在2006 年 Chang 等人所發表 PCV2 會使 PRRSV 感染率降低也有提到，此結果 顯示PCV2 的感染順序和干擾強度具有正相關性。而 LPC 疫苗效力減少的程度在 不同畜場也不盡相同，另外也發現 PCV2 對 LPCV 的干擾具有劑量效應，目前已 知PCV2 的病毒量和 PMWS 的相關性，這反映了 LPCV 防治計畫失敗通常都發生 在PMWS 的疫區。
在過去的研究中曾提到去活性的 PCV2 和具有活性的 PCV2 同樣能夠抑制豬瘟 病毒特異性PBMC 的增殖(Kekarainen et al., 2008)，但在 AM 的研究模式中發現，
去活性的PCV2 不會影響 LPCV 的複製。因此 Huang 等人(2014)推測干擾 LPCV 複 製的因子可能是PCV2 的基因或是 PCV2 複製時的中間產物或兩者皆是，但 PCV2 的衣殼蛋白就研究結果顯示可能不是干擾LPCV 在 AM 複製的因子。無論是 PCV2 的全長基因或片段序列，特別是CpG-ODN C9 序列皆能抑制 LPCV 在 AM 的複製；
PCV2 的 CpG-ODN 片段能夠減少假性狂犬病(PRV)在 PBMC 所誘導的 IFN-γ 和 IL-2，及減少 PRV 在骨髓來源樹突細胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs) 所分泌之IL-12(Kekarainen et al., 2008b)，以上結果推測 PCV2 的 CpG-ODN 片段會 可能會抑制其他病原體所誘導的免疫刺激，減少疫苗的保護效力。然而，影響病 毒感染和複製的因子還有某些細胞激素，在過去的文獻有提到 IFN-α、IFN-γ 和 TGF-β1 皆有可能抑制或增強病毒的感染和複製(Bensaude et al., 2004; Chang et al., 2005; Graham et al., 2012; Presser et al., 2013; Reed, 1999)。
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Huang 等人(2014)的研究顯示，以 PK15 作為研究模式時 LPCV 的抗原結合率 與IFN-γ 的產生具有負相關性，IFN-γ 干擾 LPCV 複製的情形在單核球也同樣被觀 察到(Grahan et al., 2012)，又 IFN-γ 的表現量和宿主對抗豬瘟病毒的感染具有正相 關性(Suradhat et al., 2007; Grahan et al., 2012)；而 PCV2 在 PBMC 可能會誘導或抑 制IFN-α 的分泌和 LPCV 的感染率減少也有文獻提及過(Bensaude et al., 2004; Chen, 2007; Hasslung et al., 2003)，但在 Huang 等人(2014)的研究中於每個組別皆未檢測 到IFN-α，這和 Chang 在 2005 所發表的文獻中所提到的 PCV2 可藉由 IFN-α 的分 泌減少PRRSV 在 AM 的感染結果不符合(Chang et al., 2005)。推測可能的原因，除 病毒基因序列、病毒劑量和感染的時間點皆不相同外，不同病毒之間的交互作用 不同，才導致研究的結果相異(Chen, 2007; Hasslung et al., 2003)，因此 Huang 等人 於 2014 發表的研究結果發現在 AM 的研究模式中，PCV2 本身的全長基因、
CpG-ODN C9(Sequence 5’-3’ GGGGCCAGTTCGTCACCCTTTCC)片段序列以及 PCV2 所誘導的 IFN-γ 可能為干擾 LPC 疫苗效價的部分原因。
第四節 豬單核球來源之樹突細胞研究模式
4-1 豬單核球來源樹突細胞簡介
樹突細胞(Dendritic cells)在免疫系統擔任高效率的防護角色，特別是一般傳統 型的樹突細胞(conventional DC, cDC)、類漿細胞樹突細胞(plasmacytoid DC, pDC) 以及單核球系列細胞之間相輔相成的交互作用，才形成一個成熟的免疫防護系 統，然而當不同的的病原體感染不同亞型的DC 時，致病機制會趨向複雜化。然而 疫苗常常會搭配佐劑確保效用，疫苗本身提供抗原可啟動特異性的適應性免疫，
而佐劑可刺激最初的先天性免疫，先天性免疫會連帶影響到適應性免疫的價值，
進而決定整個免疫系統的防護效率，在這之中DC 扮演著重要的關鍵角色。然而，
免疫系統也並非無所不能，在我們生活的自然環境中總是不斷有新的病原體在挑 戰免疫系統，宿主的目的始終是保護自己不受病原侵害，相對的對病毒和各種病 原體最重要的是如何逃避宿主的攻擊繼續存活下去。
cDC 主要分佈在全身的各組織和器官，這意味著 cDC 會在受到感染的部位或
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疫苗施打的地方(例如:皮膚和黏膜)和抗原接觸，並將抗原攜帶至淋巴濾泡，而 cDC 最重要的作用是攝取及呈現抗原片段給 T 淋巴球進行辨識和毒殺(Carrasco et al., 2001; Summerfield et al., 2003; Piersma et al., 2006; Basta et al., 2000)，同時也促進 B 淋巴球的活化反應(Bergamin et al., 2007)。雖然 cDC 扮演著免疫防禦發展的關鍵角 色，但為了避免在第一線的cDC 過度活化，因此需要經過成熟的步驟確保免疫系 統的反應適當(Gogola´k et al., 2003)。未成熟的 DC (immature DC, imDC)具有高效 率的細胞吞噬能力，以及抗原攝取和處理的能力。成熟的DC (mature DC, mDC) 吞噬能力較低，但有較高的MHC 和協同刺激分子的表現能力，可增強抗原特異性 淋巴球的反應(McColl, 2002; Uhlig et al., 2004)。imDC 在轉變為 mDC 的過程中，
需要一個特殊的”危險(danger)”訊號，如果適當的辨認危險訊息和正確處理抗原，
就能有效促進先天性免疫和適應性免疫的發展，相反的如果缺少有效的危險訊 息，cDC 的功能即缺乏效率甚至不活化。在 2006 年，Blander and Medzhitov 證明 了老鼠的 cDC 能吞噬雞蛋溶酶體(hen egg lysozyme, HEL)，但是若沒有脂多醣 (Lipopolysaccharides, LPS)提供”危險”訊號，cDC 就不會處理和表現攝入的抗原 (Blander and Medzhitov, 2006)。 cDC 的細胞表面具有各種不同執行免疫反應的受 體，例Toll-like receptors (TLRs)、Scavenger receptors (SRs)和 C-type lectin receptors (CLR)，這些都是相當重要的模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)，能 夠辨認病原體上的相關分子(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)。當抗 原和PRRs 結合時，PRRs 能迅速活化細胞，包括發炎激素的釋放以及促進協同刺 激分子和免疫細胞的反應(Pulendran et al., 2004)。不同的 TLRs 能夠辨認不同的細 菌和病毒(Oda and Kitano, 2006)，例如 TLR2 和 TLR4 在細胞表面能夠辨認細菌和 病毒的表面分子，而TLR3、TLR7/8 和 TLR9 在細胞內能各自辨認不同的核酸(Kawai and Akira, 2006; Kenneth C et al., 2009)。
在 in vitro 條件下產生的 DC，依照來源分為單核球來源之樹突細胞(MoDCs) 與骨髓來源之樹突細胞(BMDCs)。由於 MoDCs 的取得方便，因此是免疫相關研究 的良好模式，一般使用IL-4 和 GM-CSF 的條件下培養 4-7 天，使單核球分化為具 有樹突構造的樹突細胞供後續研究使用(Carrasco et al., 2001; Paillot et al., 2001)。
MoDCs 的細胞表面分子表現型為 CD1+、CD14+、CD16+、CD80/86+、CD172a+和
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MHCII+ (Raymond et al., 2005; Carrasco et al., 2001; Chamorro et al., 2004; Foss et al., 2003; Paillot et al.,2001)，而 CD14 通常被認為是單核球系列之細胞表面抗原，並非 樹突細胞特有(Banchereau et al., 2000)。但在貓、狗和牛的 DCs 都帶有 CD14 (Miranda et al., 2006)，在近年關於豬的 DCs 的研究中也顯示無論是否給予刺激，
豬的 DCs 均會表現 CD14。CD172a (SWC3)屬於骨髓單核細胞來源所表現之抗原 (Alvarez et al., 2000)，在早期分化的階段 CD172a 會表現於單核球或顆粒球 (Summerfield et al.,1997)。而樹突細胞的功能在豬隻的重要性除了呈現抗原擔任細 胞性免疫的媒介角色外，作為第一線接觸疫苗抗原給淋巴球的樹突細胞在豬隻的 免疫系統中顯得格外重要；因此在本研究選用實驗室誘導產生的MoDCs 作為觀察 PCV2 影響 LPC 疫苗效價的細胞模式。
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第三章 材料與方法
第一節 實驗設計
本實驗目的為探討豬第二型環狀病毒感染血液單核球來源之樹突細胞，是否干 擾兔化豬瘟疫苗效力的可能機制。從無特定病原(SPF)豬隻採血後，分離周邊血液 單核細胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)，並使用 MACS MicroBeads 磁珠分選系統篩選出CD172a+細胞，繼續培養成未成熟樹突細胞(immature MoDCS, imDCs)。實驗組分為四組，分別為陰性控制組、第二型豬環狀病毒單獨感染組、
兔化豬瘟疫苗病毒株單獨感染組以及共同感染組，觀察各實驗組之樹突細胞在感 染病毒後不同時間點的細胞型態、病毒感染率、細胞存活率、細胞凋亡率、細胞 壞死率、細胞攝取抗原之能力、細胞表面抗原的改變和細胞激素mRNA 及蛋白質 的表現量，藉此釐清其可能干擾機制。
1-1 實驗設計與流程圖
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第二節 實驗材料
2-1 實驗動物自臺灣動物科技研究所購買四隻六週齡無特定病原(Specific pathogen free, SPF)健康豬隻，無特定病原定義包括豬第二型環狀病毒、豬瘟病毒、豬生殖與呼 吸道綜合症病毒、假性狂犬病病毒、豬細小病毒、豬流行性感冒病毒及豬肺炎黴 漿菌等病原的感染，在酵素免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 檢測結果為陰性。為了減少干擾因素，使用聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction, PCR)再次檢測是否汙染豬第一及第二型環狀病毒、豬瘟病毒、豬生殖與 呼吸道綜合症病毒等四種病毒，檢測結果皆為陰性；豬隻飼養於行政院農委會家 畜衛生試驗所動物房，每週採血進行實驗。
2-2 血球分離相關藥品
1. K2-EDTA 真空無菌紫頭採血管(VacutainerTM)：採血管內壁噴霧 K2-EDTA，藉 由螯合血液中促進血液凝固的鈣離子，進而達到抑制血液凝固的作用。
2. Antibiotic-antimycotic 抗生素(GibcoTM)：內含Amphotericin B、Streptomycin 和 Penicillin，用途為抑制細菌及黴菌汙染。
3. Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (D-PBS)：在本實驗中配製藥品及試劑是使 用不含鈣和鎂的D-PBS (GibcoTM)，使用 1 公升二次水溶解後，調整 pH 值至 7.4-7.5，經高壓滅菌釜滅菌後使用。
4. 2% Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)：0.01M Na2EDTA (Merck, Darmstadt, Germany) 20g 溶解於 1 公升 D-PBS，校正 pH 值至 7.4-7.5，經高壓滅菌後使用。
5. Ficoll-Paque (Sigma-Aldrich®)：血液中之血球有不同的沉降係數，利用此原理 將同密度細胞分布在同一介面，並使用離心在密度梯度中分離細胞。
Ficoll-paque 溶液密度為 1.007 g/ml，分離過程中細胞和溶液會形成四個介面，
由下而上順序為紅血球、Ficoll-paque、buffy coat、RPMI medium。
6. Ammonium chloride potassium chloride (ACK) lysing buffer：在分離血球過程 中，溶解紅血球。每1 公升二次水含 0.15M NH4Cl 8.29 g、1M KHCO3 1 g、0.01M EDTA 37.2mg，調整 pH 值至 7.2-7.4，以 0.22μm 過濾杯(Corning Costar Corp) 過濾後使用。
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7. Roswell Park Memorial Institute (RPMI)1640 培養液(GibcoTM)：適合培養懸浮性 細胞，在本實驗分離豬周邊血液單核球時用來清洗細胞，可防止細胞集結成 塊，使用前每1 公升加入抗生素 10ml 和 2% EDTA 10 ml 後方可使用。
8. QuadroMACSTMStarting Kits (MACS Miltenyi Biotec)：磁珠分選系統的原理是 利用具特殊抗原鍵結磁珠(MicroBeads)捕捉欲篩選之細胞，當細胞通過管柱 時，目標細胞因抗體鍵結會被強力磁性吸附在管壁中，藉此去除其他細胞，
提高實驗特異性。此系統包含具有磁性的分離器(Separator)、磁座(MultiStand) 及離心管架。
9. LS Columns (MACS Miltenyi Biotec)：適用於正向篩選(positive selection)，每 次分選細胞總數最大值為2X109，磁珠標記細胞最大值為108。
10. Mouse Anti-Pig CD172a conjugate FITC (AbD Serotec):：0.1mg，isotype IgG1，
CD172a 表現於骨髓單核球系列之細胞，例如單核球、樹突細胞、巨噬細胞等，
在本實驗當中為一級抗體所使用。
11. Anti-FITC MicroBeads (MACS Miltenyi Biotec)：2ml，可用於 200 次以上分選 (每次分選細胞 2X109內)。
12. MACS Running Buffer (MACS Miltenyi Biotec)：磁珠分選系統中用來清洗細 胞之緩衝液。1 公升 D-PBS 含有 0.5% Bovine serum albumin (BSA)及 2mM EDTA，需調整 pH 值至 7.2，0.22 μm 過濾杯(Corning Costar Corp)過濾後使用。
2-3 細胞培養液和相關試劑
1. Fetal bovine serum (Biological Industries)：胎牛血清經非働化後使用。
2. Recombinant swine granulocyte macrophage-colony stimulating factor
(rsGM-CSF)顆粒球巨噬細胞生長刺激因子(InvitrogenTM, Karlsruhe, Germany)：在 本實驗GM-CSF 係用來刺激單核球分化為樹突細胞，100 μg/vial 粉末使用 1ml D-PBS 溶解成 100 μg/ml 分裝儲存。
3. Recombinant swine interleukin-4 (rsIL-4 ) (InvitrogenTM, Karlsruhe, Germany)：
IL-4 可刺激單核球分泌 GM-CSF，使單核球分化為樹突細胞，10 μg/vial 粉末使 用100 μl D-PBS 溶解成 100 μg/ml 分裝儲存。
4. Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)培養基(GibcoTM)：豬單核球來源樹突
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細胞(MoDCs)培養液，刺激分選出單核球分化成 MoDCs。使用前每 500ml 需添 加上節所述之抗生素5ml、FBS 50ml、rsGM-CSF 20 ng/ml 及 rsIL-4 20 ng/ml。
2-4 豬第二型環狀病毒與兔化豬瘟疫苗病毒株
1. 兔化豬瘟疫苗Lapinized Philippines Coronel (LPC) vaccine：由行政院家畜衛生 試驗所豬瘟組分讓。
2. 豬第二型環狀病毒porcine circovirus type 2 (PCV2)：基因型為 PCV2b，由宜蘭 大學郭村勇老師實驗室分讓。
2-5 核酸萃取及聚合酶鍊鎖反應之藥品
1. 2-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich®)：在收取細胞過程中減緩 RNA 降解。
2. RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)：用於抽取細胞 RNA。此套組內含 RNesay mini spin columns、Collection tubes、Buffer RLT、Buffer RW1、Buffer RPE 及RNase-free water。Buffer RPE 55ml 使用前須加入 220ml 絕對酒精
(Sigma-Aldrich®)。Buffer RLT 每 10ml 加入 100 μl 2-mercaptoethanol。
3. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo scientific)：在本研究中所使 用的cDNA 轉換試劑。內含 Thermo Scientific RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase、Thermo Scientific RiboLock Ribonuclease Inhibitor、5x Reaction Buffer、10mM dNTP Mix、Oligo(dT)18 Primer、Random Hexamer Primer、
DEPC-treated Water。
4. KAPA PROBE FAST qPCR Kit Master Mix (2X) Universal (Kapa Biosystems)：在 即時聚合酶鏈鎖反應時使用之試劑。
5. 本實驗所使用的probe 及 primer 列於 Table. 1。
2-6 流式細胞儀相關藥品
1. ： Annexin V 能夠與正在凋亡細胞的磷脂質絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)結 合，Propidium Iodide (PI)可插入壞死細胞的 DNA 鹼基對中，藉由雙染便能得 知細胞凋亡與壞死的情形。此套組內含Annexin V-FITC、Propidium Iodide 及 Annexin V Binding Buffer。
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2. DQTMovalbumin (Molecular Probes®, Eugene, OR, USA)：1mg，用於偵測細胞攝 取可溶性抗原之能力。
3. Staphylococcus. aureus conjugates FITC (Molecular Probes® Eugene, OR, USA)：
10 mg，用於偵測細胞攝取及處理顆粒性抗原之能力。
4. Mouse Anti-Pig CD14 conjugate FITC (AbD Serotec)：0.1 mg，。
5. Anti-Mouse CD80 conjugate FITC (B7-1) (eBioscience)：0.5 mg。
6. Rabbit Anti-pig CD86 conjugate PE (B7-2) (Bioss, USA)：0.1 mg。
7. Mouse Anti-Pig SLA Class I-FITC (AbD Serotec)：0.1 mg。
8. Mouse Anti-Pig SLA Class II-FITC (AbD Serotec)：0.1 mg。
9. BD FACSFlow Sheath Fluid (BD FACSFlow™)：流式細胞儀所使用鞘流液。
2-7 酵素連結免疫分析法
1. IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、TNF-α、IFN-γ 測定，使用商業化套組 Quantikine® ELISA (R&D systems)：內含 Microplate、Standard、Control、
Conjugate、Assay Diluent、Calibrator Diluent、Wash Buffer、Color reagent A、
Color reagent B、Stop Solution。
2. Protein Detector HRP Microwell Kit (KPL)：測定 IFN-α，內含 Coating Solution Concentrate、BSA Diluent/Blocking Solution、Wash Solution、50% glycerol solution、HRP-labeled Anti-Mouse IgG (H+L)、ABTS Peroxidase Substrate、ABTS Stop Solution。
3. Recombinant Porcine Interferon Alpha (PBL Assay Science)：0.1 ml，1x105 units
，activity 1.66x106 Units/ml。
4. Mouse Anti-pig Interferon Alpha (PBL Assay Science)：500 μg，clone K9。
5. Mouse Anti-pig Interferon Alpha (PBL Assay Science)：500 μg，clone F17。
6. Avidin-Horseradish peroxidase (eBioscience)：用於 ELISA 檢測，1 : 500 稀釋。
2-8 免疫螢光染色相關試劑
1. WH303 Mouse Anti-Pestiviruses (Classical Swine Fever Specific) (AHVLA Scientitic)：1mg，在免疫螢光染色中之一級抗體。
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2. Mouse Anti-porcine circovirus type 2 (分讓自行政院農委會家畜衛生試驗所 豬 瘟組)：在螢光染色中之一級抗體。
3. Goat Anti-mouse IgG conjugate FITC (BD pharmingemTM, NJ, USA)：在免疫螢光 染色中之二級抗體。
4. Propidium Iodide (Sigma-Aldrich®)：在免疫螢光染色時染細胞核所使用。
2-9 儀器
1. Real-time PCR：LightCycler®480 system (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Germany)
2. 流氏細胞儀：FACS Calibur flow cytometer (Becton and Dickinson, Sunnyvale, CA, USA)
3. PCR：yT&A® vector (Yestern Biotech)
4. 細胞抹片離心機：Shandon cytospin centrifuge (Shandon Southern Instrument, Sewelicky, PA, USA)
第三節 實驗方法
3-1 細胞分離與培養
3-1-1 豬周邊血液單核細胞(PBMCs)的分離與純化
1. 四隻SPF 豬隻固定各採血 20 ml，平均分配於真空無菌紫頭管，新鮮血液與管 內EDTA 充分混勻。
2. 離心1800 xg，30 分鐘，4°C。
3. 抽取血漿與血球之間的Buffy coat，與 3ml RPMI-1640 (內含 0.02 % EDTA)混合 均勻，緩慢滴入事先準備好的7ml Ficoll-Paque，使細胞懸浮液在 Ficoll-Paque 上層，勿衝破液面。離心1800 xg，30 分鐘，4°C。
4. 抽取位於第二層的PBMCs，與 3ml RPMI-1640 混合均勻後補滿 RPMI-1640。
5. 離心200 xg，10 分鐘，4°C。
6. 去除上清液，加入5 ml ACK 緩衝溶液與底部細胞混合均勻，5 分鐘，4°C。
7. 加入10 ml RPMI-1640 中止 ACK 緩衝溶液反應，離心 180 xg，10 分鐘，4°C。
