2.1 實驗菌株、質體、核酸引子、培養條件
實驗用菌株、質體、核酸引子分別詳列於表一、表二、表三。用於鏈聚合酶 連鎖反應(PCR)中，作為增幅目標基因之模版之核酸，源自於林口長庚紀念醫院 臨床分離株 K. pneumonia CG43(K2)，分離自肝膿瘍病患(Peng et al., 1992)，在 小鼠體內具有很高的致命性(Chang HY et al., 1996)。實驗中，細菌皆培養於 37°C、
Luria-Bertani (LB)液態培養基或固態 LB 洋菜膠培養基上，並依不同使用條件加 入不同濃度之抗生素包括 kanamycin(25 μg/ml)、ampicillin(100 μg /ml)、
tetracycline(5 μg/ml)、streptomycin(500 μg/ml)以及 cloramphenicol(35 µg/ml)。
細菌的生長狀態則藉由波長 600 奈米(nm)光吸收度(OD600)所測量。
2.2 質體建構
2.2.1 缺失突變體(specific gene-deletion mutants)及回補質體 (complementary plasmid)的建構
KP CG43 基因體上的缺失突變及回補，是將特定目標基因的前後約
~800-1000 bp 的片段，選殖(clone)入 pKAS46 這個自殺型載體，因此當 KP CG43 在複製時，會將攜帶的片段置換入基因體上，且由於 pKAS46 含 rpsL，空載體 (vector only)會被鏈黴素(streptomycin)所淘選(selection)掉。建構完成的質體會 由 E.coli S17-1λ pir 以 conjugation 的方式送入 KP CG43，之後則會與基因體進行 同源互換(homologous recombination)，再以 M9 kanamycin(25 μg/ml)與
ampicillin(100 μg /ml)固態洋菜膠培養基進行篩選，所得菌落再以
streptomycin(500 μg/ml)固態 LB 洋菜膠培養基進行篩選，則會得到同時對 kanamycin 與 ampicillin 型以及抗 streptomycin 型的菌落，即為所求突變體或基因 體回補。最後，再以 PCR 的方式確認。
另一種，質體型的回補則是分別將包含及不包含啟動子(promoter)的該基因
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選殖(clone)入 pRK415 的載體中，(不包含啟動子的質體之後實驗時，須加 IPTG 以誘導表現)，建構完成的質體會由 E.coli S17-1λ pir 以 conjugation 的方式送入 KP CG43，再以 M9 tetracycline(5 μg/ml)固態洋菜膠培養基進行篩選，所得菌落 再以 streptomycin(500 μg/ml)及 tetracycline(5 μg/ml)固態 LB 洋菜膠培養基進行 篩選，則會得到同時抗 tetracycline 及抗 streptomycin 型的菌落，即為所求質體回 補菌落。其中，pRK415-stk 和 pRK415-kpnK 位分別代表包含及不包含啟動子 (promoter)的 KpnK 質體型回補。
2.2.2 定點突變體(Site-directed mutagenesis)
定點突變以 yT&A-HY5 為板模，並以 Thermo scientific Inc.的 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase kit 分別製作了 S36A、D201A、D217A、T325A，
實驗流程皆參考操作手冊(Thermo scientific Inc.)。再以 BamHI、SacI(選購自 MBI Fermentas)酵素切下，並與 pETQ31 相接。實驗所需之核酸引子，皆由 MDBio, Inc.
(Taiwan)及 IDT, Inc. (Taiwan)所合成。建構的所有質體詳列於表一及表二。
2.3 生長曲線測量
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2.7 西方墨點法(Western Blot analysis)
細菌在 LB 培養液 37°C 培養 16 小時後，取 1 ml 菌液 15000 rpm、離心 5 分
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鐘後，去掉上清液，再以 200 µl 二次水回溶，並以 95°C、10 分鐘加熱破菌。測 定濃度後，將蛋白依等比例混合蛋白質染劑(0.0626 M Tris-HCl pH6.8、2% SDS、
10 % glycerol、0.01% bromophenol blue 以及 100 mM dithiothreitol)，再以 95°C 加熱 10 分鐘，取適量蛋白質(10 μg/lane)加入 13.5% SDS-PAGE 電泳分離蛋白 (80V~100V)。蛋白質經過電泳分離後，將膠上之蛋白質轉漬(400 mA、60 分鐘) 於聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride, PVDF；Millipore, Billerica, MA, USA) 上，再以溶於 1X TBS(Tris-buffered saline；pH 7.4)的 5%脫脂奶粉 4°C 處理隔夜，
遂以 1X TBS 洗去殘留於膜上的脫脂牛奶。接著，加入一級抗體、室溫 2 小時作 用，以 1X TBS 洗去殘留於膜上非專一性的一級抗體訊號，再以二級抗體(alkaline phosphatase- conjugated anti rabbit immunoglobulin G)在室溫下處理 1 小時，以 1X TBS 洗去殘留於膜上非專一性的二級抗體訊號。隨後，加入鹼性磷酸酶緩衝液 (alkaline phosphatase buffer)、呈色劑 BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate)、
NBT(nitro blue tetrazolium chloride)避光呈色。
2.8 蛋白質高量表現之質體建構
高量表現之質體的引子設計，詳列於表三。將欲高量表現蛋白質的編碼區 (coding regions) DNA 片段，以 PCR 增幅後，皆入 yT&A 選殖載體中，再轉殖至 蛋白質表現載體 pETQ31 中，使欲表達蛋白質之 DNA 片段與 pETQ31 黏合，將 質體送入 KpCG43 中，再藉由 0.5 mM 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β -D-thiogalactopyranoside, IPTG)誘導，大量表達欲取得之蛋白質。
15 止反應，以 13.5% SDS-PAGE 電泳將蛋白分離。將電泳後的膠，以 Fix buffer(50%
甲醇、10%乙酸)固定蛋白 30 分鐘、重複兩次，以二次水洗淨膠上殘餘的甲醇及 乙酸，隨後以 Pro-Q Diamond 染劑(Invitrogen)染膠 90 分鐘，再用 Destain buffer(Invitrogen)退染三次、每次 30 分鐘，最後以二次水洗淨，並以 UV 光照影。
實驗流程皆參考操作手冊(Invitrogen, Pro-Q Diamond phosphoprotein gel stain)。
2.11 酵母菌凝集測試(Yeast Agglutination)
實驗相關流程參考文獻(Blumer et al., 2005)。細菌在 LB 培養液 37°C 隔夜培
16 0.1%SDS、及 35 μl 之氯仿(Chloroform)，並混合均勻。在 30°C 水浴槽中反應 10 分鐘後，加入 200 μl 的 4 mg/ml ONPG(ortho-nitrophenyl-β
-D-galactopyranoside)(Sigma-Aldrich)，直到反應液呈現黃色，以 500μl 之 1M Na2CO3終止反應，記錄每個反應株 OD420的數值，並以 Miller unit [ 1 Miller unit
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2.14 剛果紅(Congo red)及鈣螢光(Calcofluor)表現型分析
配置包含 20 µg/mLbrilliant blue、40 µg/mL 剛果紅(Congo red)的(不含 NaCl)LB 固態培養基，及包含 4 mg/L glucose、1mM HEPES、20 µg/L 鈣螢光 (calcofluor)的 LB 固態培養基，將 37°C 培養 16 小時的菌液，各以 10 µl 一次 3 重複滴於剛果紅固態培養基上，在 28°C 培養 48 小時、並於 37°C 再培養 24 小 時，以觀察菌落現象。將 37°C 培養 16 小時的菌液，以接菌環塗佈於鈣螢光固態 培養基上，37°C 避光培養 16 小時後，利用黑燈管照射，以觀察是否有螢光顯現。
呈現的數據為三次獨立實驗中，較具代表性的一次。
2.15 數據分析
氧化壓力或酸性環境生存率測定、啟動子活性分析以及生物膜染色定量分析，
皆為每次獨立實驗，以至少三重複數據換算出平均值及標準差(standard deviation, SD)，呈現的數據為三次獨立實驗中具代表性的一次。數據以平均值+標準差呈 現，群組間的差異以雙尾(two tailed)的 Student’s t-test 計算，P-value 小於 0.05 具統計差異。
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藉由 Pro-Q Diamond assay 證明，ManB 會失去磷酸化訊號(附錄一 B)，且可能因 其酵素活性降低而影響 CPS 的生成(萬舉豪，2012)。如圖一 A、B 所示，前人 建構的 kpnK 基因缺損突變株 kpnK_1，比其親本株 CG43S3 更容易以低速離心沉 降下來，此暗示∆kpnK_1 會影響 CPS 的生合成，但在質體回補株∆kpnK_1 [pRK415-kpnK]卻無法恢復其 CPS 的生成。
3.2 kpnK 下游基因 dsbA 缺失對 CPS 生合成的影響 kpnK 基因缺失突變體及回補株，分別以引子對 HY18F/HY18R 及 HY19F/HY19R 進行鏈狀聚合反應，產生 504-bp 及 837-bp 的 A、B 片段，並利用 pKAS46 自殺