第一章 前言
1.3 蛋白質的磷酸化修飾(protein phosphorylation)
細菌的蛋白質形成後修飾主要包含：乙醯化(acetylation)、甲基化
(methylation)、蛋白酶解(proteolytic degradation)、脂化(lipidation)以及磷酸化 (phosphorylation)。其中，磷酸化通常發生在絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、酪胺 酸(Tyr)、以及組胺酸(His)的殘基上。其磷酸化系統可分為雙分子調控系統 (Two-component system,TCS)、磷酸轉移系統(phosphotransferase system, PTS) 和三磷酸腺苷依賴系統(ATP-dependent kinase phosphorylation system)。TCS 包 含兩個功能獨特的蛋白質 sensor kinase 受到外界訊息刺激後，藉由消耗 ATP，
將磷酸激團以共價鍵接在自身的組胺酸殘基上，經自我磷酸化後，再將磷酸基 傳給另一蛋白 response regulator 的天門冬胺酸殘基，而此 response regulator 的 磷酸化與否決定其調控功能。PTS 同樣將磷酸基團接在組胺酸上，與 TCS 最大 的不同在於 PTS 的磷酸基團由 phosphoenol-pyruvate (PEP)所提供，而且其磷酸 基團經一連串的蛋白質傳遞後，最終傳到醣分子(van Tilbeurgh et al., 2001)。在 第三個系統中，磷酸化位置發生於蛋白質的 Ser、Thr 以及 Tyr。絲胺酸/蘇胺酸 激酶(STK)和 TCS 的不同在於：(一)形成不同的磷酸酯類：STK 形成
phosphoester 而 TCS 形成 phosphoramidate (Stock et al.,2000)；(二)不同數目的 磷酸根傳遞：TCS 只傳遞一個磷酸根，STK 卻可能因多種激酶參與磷酸化，而 有多重磷酸根傳遞的現象(Inouye et al., 2008; Stock et al., 2000)；(三)TCS 影響 基因的轉錄(transcription)，而 STK 除了轉譯後修飾影響蛋白的活性外，當其磷 酸化到標的蛋白為轉錄因子時，也會因而影響其下游基因的轉錄(Lin, 2010)。
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1.3.1 蛋白 Ser/ Thr 的磷酸化激酶(STK)
真核細胞的蛋白磷酸化系統已被廣泛研究(Bakal et al., 2000)，而至最近幾十 年間，才陸續有細菌 STK 的報導，而某些和真核 STK 序列具有高度相似性的一 群被稱為類真核型的絲胺酸/蘇胺酸激酶(Eukaryotic-like Ser/ Thr Kinase,
ESTK)(Hanks et al., 1995)，但並非所有細菌 STK 都為 ESTK。
典型的 ESTK 和真核細胞中的 STK 催化中心具有高度的結構相似性(Canova et al., 2014)，且符合“Hanks’ motifs”法則：通常 N 端由較小區域的β-sheets 組 成，主要和磷酸根的供應者 ATP 結合，為可能的 ATP 鍵結區(ATP binding site)；
C 端由較大範圍的α-helixes 組成，會辨認並結合受質的特定序列殘基，為受質 鍵結區 (Pereira et al., 2011)。ESTK 具有 Glycine-rich motif 和 ATP 結合(但有些 ESTK 並無此特徵)，當 Glycine-rich motif 缺失時，此激酶可藉由 lysine-rich motif 或 Glutamate-rich motif 和 ATP 鍵結以獲得高能磷酸根；另外，ESTK 具有和金屬 (Mg2+、Mn2+)鍵結的 DFG motif，以穩定激酶活性；在 DFG 及 PE motif 間為磷 酸化修飾的活化部位，PE 的 Glutamate 會和 Arginine 形成鍵結；而 RDXXXXN motif 為鍵結 Aspartate，形成 ATP 傳遞予受質結合的結構。
首先在 E. coli 中發現參與檸檬酸循環酵素 IDH (isocitrate dehydrogenase)的 活性與其 Ser/ Thr 磷酸化有關(Garnak et al., 1979)，然而，IDH 是透過雙功能的 激酶/去磷酸酶(bifunctional kinase/phosphatase) 在 Ser 的位置進行磷酸化，此雙 功能的激酶/去磷酸酶和 ESTK 的胺基酸序列並不相似(La Porte et al., 1985)。直 到 1991 年，第一個名為 Pkn1 的 ESTK 在 Myxococcus xanthus 中被發現，其激脢 活性會影響生長(Munoz-Dorado et al., 1991)。在其他的細菌中，陸續也發現 ESTK 與其代謝，胞子、細胞壁及莢膜的生成有關，也可能是細菌的毒性因子
(Edwards-Jones et al., 2004; Richards et al., 2006; Roque et al., 2009; Zheng et al., 2007)。
1.3.2 ESTK─ YihE(RdoA)
大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌(Shigella)的YihE (RdoA)具有高度的序列相
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似性。yihE和其下游基因dsbA為一組基因操縱子(operon)，此操縱子受Cpx的轉 錄調控(Turcot et al., 2001; Suntharalingam et al., 2003)。而yihE (或rdoA)相關的表 現型，可能會因為在不同種細菌間有所不同(Suntharalingam et al., 2003； Lin, 2010)。許多相關報導yihE/rdoA的缺失突變會影響基因的轉錄、表現量、以及磷 酸化其他蛋白的能力：S. flexneri的微陣列(microarray)分析實驗發現rdoA剔除後 會影響和能量代謝、碳原子降解、胺基酸及核苷酸的合成及蛋白質運輸相關之基 因的轉錄(Li, et al., 2001)；也有研究提出DnaK、GroEL、Ef-Tu具有RdoA依賴性 磷酸化的現象，因此推測它們是RdoA的受質(Roque, 2009)，但仍未經證實。S.
flexneri YihE（RdoA）會調控galERKM表現而影響LPS的生成量，進而決定其毒 性高低(Edwards-Jones et al., 2004)；但在S. typhimurium中，YihE（RdoA）並不 影響LPS的表現量；另外，RdoA也會影響線毛的生成或造成鞭毛狀態的改變 (Richards, 2006; Zheng et al., 2007)。
結構分析的研究結果顯示 YihE（RdoA）在胺基酸 H199 的位置，會藉由和 其他胺基酸的交互作用改變結構，進而影響激脢活性；H199 和 D201 及 V216 的 主鏈形成氫鍵鍵結，使得 D201 和 D217 的支鏈方向改變，而 D217 的主要功用 是和鎂離子鍵結，進而催化其受質的羫基(hydroxyl group)去質子化
(deprotonation)，而受質取得 ATP 的γ-磷酸根後會被磷酸化，因此，將 D217 突 變成 alanine 則會喪失其激酶的活性；另外，S36 會透過其羫甲基(hydroxymethyl group)和 ATP 的β-磷酸根結合，形成過度態來穩定 ATP(Zheng et al., 2007)。
1.3.3 KpnK 的調控及功能
2012 年，類真核型磷酸化激酶 KpnK (K. pneumonia Kinase)首先在 KP MGH78578 中被證實此激酶會受外界環境壓力的刺激，影響 KP 抗氧化及抗抗生 素的生存率(Srinivasan et al., 2012)。KpnK 不具完整的特定 ESTK 胺基酸序列，
但仍被歸屬於 APH-3’-IIIa and choline kinase 家族，具有鍵結 ATP、錳離子相關 序列，富含賴胺酸(lysine-rich)和 RDX6N motis，屬於非典型的 ESTK。
KpnK在中性環境具有自我磷酸化的能力，錳離子為其協同因子(cofactor)，
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在kpnK的基因缺失會使KP對抵抗滲透壓力、氧化壓力及抗生素的能力降低；同 時，KpnK在轉錄過程中會受CpxR的正向調控(Srinivasan et al., 2012)。