Hydrogenphosphate, K2HPO4)、磷 酸二氫鉀 (Potassium
Dihydrogenphosphate, KH2PO4)、
硫酸錳( Manganous(II) sulfate hydrate,MnSO4)、硫酸銅 ( Copper(II) sulfate,CuSO4)
SHOWA 昭和化學株 式會社
景明化工股份 有限公司
氯化鈣(Calcium chloride,CaCl2) 日本試藥工業株式會 社
硫酸鋅(Zinc sulfate,ZnSO4) 島久株式會社 酒精(Ethanol) ECHO
氯化鎂(Magnesium
chloride,MgCl2)、碳酸二氫鈉 (Sodium dihydrogen
phosphate,NaH2PO4)、S - 腺苷甲 硫胺酸(S – adenosyl methionine)、
SIGMA 友和股份貿易
有限公司
乙腈(Acetonitrile)、氫氧化鈉 (Sodium Hydroxide,NaOH) 、磷酸 (phosphoric acid,H3PO4)、硫酸 (Sulfuric acid,H2SO4)
三氯乙酸(Trichloroacetic acid)、L -甲硫胺酸(L – methionine)
Alfa Aesar
辛烷磺酸鈉(1-Octanesulfonic acid,CH3(CH2)7SO3Na)、硫酸氨 (Ammonium Chloride, (NH4)2SO4)
J.T.Baker
洋菜 (Agar)、酵母萃取物 (Yeast Extract )、麥芽萃取物(Malt Extract)、消化蛋白質(peptone)。
Difco 啟新生物科技
有限公司
Glucose analyze reagent ASK 東耀生物科技 有限公司
2. 儀器使用
發酵實驗儀器與常用實驗設備規格列於表 3-2。
表 3-2 實驗設備及規格
設備名稱 規格 型號/廠牌
桌上離心機
Max 13000rpm Max load 24 x 4g
分光光度計 300~950 nm SP-830/ Metertek HPLC auto sample LC - 10AT /Shimadzu HPLC auto sample 717 plus/ Waters
HPLC RI detector 2414/Waters HPLC ELSD detector 2424/Waters
HPLC UV detector SPD-10A / Shimadzu HPLC pump Delta 600/Waters
HPLC 1110 Series / Agilent
HPLC column
4.6 x 250 mm TC – 18 / Agilent
溶氧電極 Oxyferm325/ Hamilton
溶氧偵測儀 Biotop
酸鹼電極 Mettler Toledo
泡沫控制器 Bitotop
空氣壓縮機 7.5 HP/ Swan
氣體流量控制儀 0~10 LPM Pwyer
空氣過濾器 0.2μm PTFE Midisart 2000/ Sartorius
空氣乾燥機 SMC
搖瓶培養箱 S303R / Firstek
3-2 菌種保存、發酵條件與分析方法
1. 菌種來源
原始菌株為 S. cerevisiae ATCC 7752，購自新竹食品工業研究所菌種中心，
再經由突變篩選可耐高濃度甲硫胺酸，取得能大量生產並累積 SAM 之突變菌 株。
2. 菌種保存與培養
A. 菌株於固態培養基上活化，並置於28 ℃下，培養24小時。
B. 以高溫火焰槍加熱殺菌後之白金環刮取已活化之菌株，接種入含有 100 ml 液態前培養液之500 ml之搖瓶中。
C. 置於28 ℃，200 rpm 恆溫培養箱培養10-12小時。
將經由滅菌釜滅菌過的無菌水及甘油，以 1:1 比例配製成甘油水溶液。
含有菌液的搖瓶經恆溫培養箱培養 12-15 小時後，分別取 0.5 ml 的菌體
懸浮液及 0.5 ml 甘油水溶液，置入離心管中，充份混合均勻後，
置於-80 ℃低溫冷凍保存。
(NH₄)₂S0₄ 6 g/L，K₂HP0₄ 2.5 g/L，KH₂PO₄ 5 g/L，MnSO₄ 0.045 g/L，
ZnS0₄ 0.07 g/L，MgC1₂ 0.25 g/L，CaCl₂ 0.15 g/L，甲硫胺酸 0.42 g/L，
CuSO₄ 0.0025 g/L，pH 6.5。
4. 搖瓶實驗
6. SAM 的萃取
D. 醱酵液離心(12000 rpm)，將上清液保留待後續實驗的分析，收集菌體，
用 R.O 水將殘留的發酵液清洗乾淨並離心收集菌體，再用 1.0M 的過 氯酸(HClO₄)室溫下進行破菌萃取 30 min，12000 rpm 離心收集上清 液，進行 HPLC
分析。(Wang, Kramer, Yang, Pereira, and Tao, 2001) 7. SAM 分析
以 Macherey-Nagel 的 Nucleodur C18 (4.6 x 250mm)管柱為固定相，移動 相分為兩種(A 和 B)，移動相 A：0.1 M 磷酸二氫鈉、0.008 M OSA、2 % ACN，
以 1 M 的磷酸調整 pH 至 2.65；移動相 B：0.15M 磷酸二氫鈉、0.008M OSA、
26 % ACN，再以 0.45 µm 之過濾器過濾使用。
移動相流速為 1 ml/min，起始移動相比例為 85：15 (A：B)，5 分鐘時 30：
70 (A：B)，20 分鐘時 0：100 (A：B)，以 Shimadzu SPD-10A UV detector (波 長為 254 nm)分析，每次注射樣品量為 20 µL，以 SISC 軟體分析。SAM 滯留 時間為 19.8 分鐘，分析結果如圖 3-1，校正曲線如圖 3-2。(Wang et al., 2001) 將 SAM 標準品 1g/L 分析結果圖(圖 3-1)中 11.2 分鐘、13.7 分鐘和 19.8 分 鐘的波峰面積相加後再除以 19.8 分鐘的波峰面積最後乘上所分析之濃度，計 算之後，需將分析後 SAM 的濃度乘上 0.62，方為準確濃度。
0 10 20 30 40 SAM Sample
圖 3-1 SAM 標準品與樣品分析圖
0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000
S AM (g/L )
Area (uv*sec)
16
8. 甲硫胺酸分析
以 Anglient 的 TC-C18 (4.6 x 250mm)管柱為固定相，移動相分為兩種(A 和 B)，移動相 A：水中含有 0.1 %三氯乙酸，移動相 B：ACN 中含有 0.1 %三
methionine STD methionine Sample
圖 3-3 甲硫胺酸標準品與樣品分析圖
圖 3-4 methionine 濃度校正曲線圖 9. 酒精分析
以 Chrom Tech 的 ICE-99-9861(7.8 x 300mm)為固定相，移動相為 0.01 N H2SO4，再以 0.45 µm 之過濾器過濾使用。
移動相流速為 0.6 ml/min，以 Waters 2424 RI detector 進行分析溫度為 45
℃，每次注射樣品量為 20 µL，以 SISC 軟體分析。酒精滯留時間為 22.9 分鐘，
分析結果如圖 3-5，校正曲線如圖 3-6。
methionine = -4.55*10
-15Area
2+ 1.24*10
-7Area R² = 0.9989
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
0 5000000 10000000 15000000
m ethionine ( g/L )
Area (uv*sec)
18
Ethanol STD Ethanol Sample
圖 3-5 酒精標準品與樣品分析圖
圖 3-6 酒精濃度校正曲線圖
Ethanol = 1.25*10
-5Area
R² = 0.9999
0 500000 1000000 1500000 2000000
E tha nol ( g/L )
Area (uv*sec)
10. 葡萄糖的測定
Glucose = 2.75*OD
R² = 0.9933
20
DCW = 0.6264*OD
R² = 0.9963
12. 菌體中SAM 的含量(Cellular SAM content)計算公式
菌體中 SAM 的含量的計算方式為，利用 HPLC 所分析 SAM 的濃度除以 乾菌重，並且換算成百分比。
Cellular SAM content (%) =DCWSAM x 100(%)
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