4-1-1 菌種突變
以突變技術改善菌種，利用 NTG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 進行化學突變，以致死率試驗找出合適突變條件，並將甲硫胺酸(L-Methionine) 蒸餾水中製成菌懸液，取出適當體積稀釋塗抹於 YPD 培養基(YPD medium)的 洋菜培養皿中，再置於28 ℃培養箱中培養 24 小時，進行原始菌量計數(N0)。
將剩餘的菌懸液離心去除上清液，接到已配置好之不同濃度的 NTG 溶液，反 應不同的時間後取出，作適當稀釋倍率塗抹於肉汁培養基中，置於28 ℃培養 箱中培養 24 小時後，以平板計數法分別計算突變前與突變後菌量(NF)，實驗 流程如圖 4-1 所示。致死率計算公式如下：
%
所以實驗選用 NTG 化學突變，以突變技術改善菌種(Saccharomyces cerevisiae)，
以致死率試驗找出合適突變條件，並將 3 g/L 甲硫胺酸當成篩菌機制，找出
24
0 5 10 15 20 25
Cellure SAM content (%)
Time (hr)
(b)
圖 4-3 原始菌株與六株菌株菌體的比較 (a)菌體歷時圖(b)菌體中 SAM 含量歷 時圖
4-1-3 不同碳源對菌體之影響
26
0 4 8 12 16 20 24 28 0.00
0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
SAM(g/L)
Time(hr)
Glu- ATCC 7752 Glu- 40
Gal- ATCC 7752 Gal- 40
Mal- ATCC 7752 Mal- 40
(a)
28
0 4 8 12 16 20 24 28
0 1
2 Glu- ATCC7522
Glu- 40 Gal- ATCC7522 Gal- 40 Mal- ATCC7522 Mal- 40
Cellular SAM content (%)
Time(hr)
大值比較
SAM (g/L) 菌體中 SAM 含量 (%) ATCC 7752 NO.40 ATCC 7752 NO.40 Glu 40 g/L 0.05 0.18 1.18 1.7 Gal 40 g/L 0.037 0.0558 0.97 1.48 Mal 40 g/L 0.05 0.062 1.06 1.5
4-1-4 微量元素對菌體的影響
微量元素對菌體生長有不可或缺的影響，如鉀、鈉離子控制細胞膜的滲 透性，鎂、鈣、錳離子對酵素活性具有啟動作用，磷酸根離子影響細胞體內的 能量儲存。本實驗以葡萄糖 20 g/L，酵母粉 5.5 g/L，甲硫胺酸 0.42 g/L 為基 礎培養基(basal medium)，另以基礎培養基和微量元素為完全培養基(complete medium)進行菌體培養，比較 ATCC 7752 與突變菌株 NO.40 的菌體生長歷時 變化與菌體內 SAM 含量的變化。圖 4-6(a)為以基礎培養基與完全培養基進行 菌體生長變化歷時圖，不論是突變菌株 NO.40 或 ATCC 7752，可看出添加微 量元素的培養基利於菌體成長，而在完全培養基中，ATCC 7752 菌體量比 NO.40 菌體量高 19%，對於 ATCC 7752 成長的助益遠大於突變株。圖 4-6(b) 為不同培養基下，菌體中 SAM 含量的歷時變化圖，由圖中可看出在 NO.40 菌 中，當基質含有微量元素時，有助於菌體中 SAM 的累積，約可增加 58.9 %的
30
菌體中 SAM 含量。若以完全培養基(葡萄糖、酵母萃取粉、甲硫胺酸和微量 元素)進行突變株 NO.40 的培養，第 15 小時菌體中 SAM 含量可達 5.58 %，
為原始菌株 ATCC 7752 菌體中 SAM 含量的 1.36 倍。SAM 的累積與葡萄糖 濃度、甲硫胺酸濃度、發酵時間有關，從圖 4-6(b)中可看出 NO.40 菌株的 SAM 含量於第 15 小時達到最高，但 ATCC 7752 的菌體中 SAM 含量於第 12 小時 達到最高。
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
0 2 4 6 8 10
DCW(g/L)
Time(hr) 40 (Complete)
40 (Basal)
ATCC7752 (Complete) ATCC7752 (Basal)
(a)
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 0
1 2 3 4 5 6 7
Cellular SAM content (%)
Time(hr)
40 (Complete) 40 (Basal)
ATCC 7752 (Complete) ATCC 7752 (Basal)
(b)
圖 4-6 基礎培養基與完全培養基的比較 (a)菌體歷時圖(b) 菌體中 SAM 含量 的歷時圖，Complete：完全培養基；Basal：基礎培養基；40：NO.40 菌株；
ATCC 7752：原始菌株(ATCC 7752)。
32
4-1-4 不同甲硫胺酸濃度對菌體的影響
高濃度的甲硫胺酸對菌體有抑制作用，在好氧條件下，菌體亦可利用甲 硫胺酸轉換成 SAM。因此本實驗探討不同甲硫胺酸濃度對菌體生長與菌體中 累積 SAM 的影響。在完全培養基中添加不同濃度的甲硫胺酸，於第 12 小時 分析菌體中 SAM 含量，結果如圖 4-7 所示。隨著甲硫胺酸濃度的增加，ATCC 7752 與 NO.40 突變株的菌體中 SAM 含量皆會增加，當甲硫胺酸濃度為 0.42 g/L 時，NO.40 菌株中 SAM 含量為 5.58%，較原始菌株高出 1.36 倍。相同時 間下，當甲硫胺酸濃度達 0.56 g/L 以上，菌體內的 SAM 含量開始下降，顯見 甲硫胺酸濃度過高將會影響菌體生長與累積 SAM 的活性(Hu and Wang, 2009)。
0.14 0.28 0.42 0.56 0.70
0 2 4 6
Cellular SAM content (%)
Methionine(g/L) 40
ATCC 7752
圖 4-7 完全培養基中添加不同濃度的甲硫胺酸，SAM 最大值含量的比較圖 40：NO.40 菌株；ATCC 7752：原始菌株(ATCC 7752)。
4-2 不同批次培養操作對 SAM 之影響
圖 4-8(a)、4-8(b)和 4-8(c)相互比較，可得知在發酵過程中，當菌體進入對 數成長期後，菌體將會消耗大量的氧氣和葡萄糖，葡萄糖在第 6 小時完全消
使用搖瓶做發酵培養，SAM 累積濃度達 0.367 g/L，發酵槽做發酵培養，SAM
34
的累積濃度可達 0.496 g/L，調控溶氧值之發酵培養，SAM 的累積濃度可達 0.51 g/L。使用發酵槽培養與搖瓶培養相互比較下，SAM 的累積濃度提高 33.5%，而菌體中 SAM 含量提高 19.4%，使用發酵槽做培養可提升 SAM 的產 量，最主要的原因為提升氧氣質傳，提升氧氣質傳後可提升 ATP 的生產量 (Miller, Wilke, and Blanch, 1987)，與足夠的甲硫胺酸結合而提升 SAM 的產量，
而搖瓶培養的氧氣質傳不如發酵槽佳，又再加上甲硫胺酸並沒有消耗完畢，
故使用搖瓶所生產 SAM 比使用發酵槽生產還要低(如圖 4-9(c))。
將發酵槽(未控制溶氧)與發酵槽(調控溶氧值)相比，兩者 SAM 的最高濃 度只有些微差異，發酵槽(調控溶氧值)的 SAM 累積濃度僅提升 1.2 %，但在 SAM 的累積速率上卻有明顯的差異。從圖 4-6(c)可發現，發酵槽(調控溶氧值) 甲硫胺酸消耗速率比發酵槽(未控制溶氧)來得快。SAM 從原點累積至最大值，
使用發酵槽(未控制溶氧)做培養 SAM 生成速率為 0.026 g/L-hr，而發酵槽(調 控溶氧值)的 SAM 生成速率 0.034 g/L-hr，整體提升 31 %。
從圖 4-9(c)可得知，發酵槽(調控溶氧值)與發酵槽(未控制溶氧)兩種不同 的方式下培養，兩者皆在第 15 小時將甲硫胺酸完全消耗完畢；而搖瓶第 15 小時至第 24 小時甲硫胺酸的濃度並無變化。從甲硫胺酸與 ATP 結合的平衡 方程式可得知，並且將甲硫胺酸設定為限量試劑，理論上每克甲硫胺酸可產 出 2.67g 的 SAM。這三種不同的方式培養，SAM 的轉化率也有所不同，在發 酵槽(調控溶氧值) 甲硫胺酸轉化率達 45.5 % ；在發酵槽(未控制溶氧)中培養，
甲硫胺酸轉化率達 44.3 %；在搖瓶中培養，甲硫胺酸轉化率達 32.8 %。使用 發酵槽培養甲硫胺酸轉化率皆比搖瓶培養高，故後續將以發酵槽為主要培養 方式。
0 5 10 15 20 25 30
100 mL Shaking flask
5L Fermentor (without DO control)
5L Fermentor (DO was controlled above 10%)
DCW (g/L)
5L Fermentor (without DO control)
5L Fermentor (DO controlled above 10%)
(b)
36
20 100 mL Shaking flask
5L Fermentor (without DO control)
5L Fermentor (DO was controlled above 10%)
Glucose (g/L)
Time (hr)
(c)
圖 4-8 搖瓶、發酵槽(未控制溶氧)、發酵槽(調控溶氧值)的基質比較 (a)菌體 歷時圖 (b)溶氧值歷時圖 (c)葡萄糖消耗歷時圖，溫度：28℃，搖瓶轉速：200 rpm，發酵槽轉速(without DO control)：300 rpm，發酵槽轉速(DO was controlled above 10%)：300 rpm→400 rpm，發酵槽進氣量：空氣 2vvm。
0 5 10 15 20 25 30
0.0 0.2 0.4 0.6
100 mL Shaking flask
5L Fermentor (without DO control) 5L Fermentor (DO controlled above 10%)
SAM (g/L)
Time (hr)
(a)
0 5 10 15 20 25 30
0 2 4 6 8
100 mL Shaking flask
5L Fermentor (without DO control) 5L Fermentor (DO controlled above 10%)
Cellular SAM content (%)
Time (hr)
(b)
38
0 5 10 15 20 25 30
0.0 0.2 0.4 0.6
100 mL Shaking flask
5L Fermentor (without DO control)
5L Fermentor (DO was controlled above 10%)
methionine (g/L)
Time (hr)
(c)
圖 4-9 搖瓶、發酵槽(未控制溶氧)、發酵槽(調控溶氧值)的比較 (a) SAM 生成 歷時圖(b)菌體中 SAM 含量歷時圖(c)甲硫胺酸消耗歷時圖，溫度：28℃，搖 瓶轉速：200 rpm，發酵槽轉速(without DO control)：300 rpm，發酵槽轉速(DO was controlled above 10%)：300 rpm→400 rpm，發酵槽進氣量：空氣 2vvm。
4-3 饋料批次培養
利用饋入葡萄糖的方式提高菌體量，並且適度添加生產 SAM 的前驅物甲 硫胺酸才可提升 SAM 的產量(O'Connor, Sanchez‐Riera, and Cooney, 1992)，除 了添加甲硫胺酸之外，必須持續添加碳源以供給菌體能量和生長菌體。後續 的實驗將以饋料的方式進行，除了不斷的添加葡糖糖之外，並且使用批次方 式添加甲硫胺酸，探討葡萄糖與甲硫胺酸持續添加對於菌體成長和代謝生產 SAM 之影響。
4-3-1 添加葡萄糖對菌體代謝之影響
菌體以葡萄糖為碳源，代謝葡萄糖後生成菌體與產物，持續饋入葡萄糖 可提升發酵過程中的菌體密度。酵母菌發酵時，酒精為副產物，若葡萄糖濃度 較低，則會影響菌體所需碳源不足，且會消耗酒精，並增加 NADH 的量，進 而提高 NADH：NAD+比值，影響 TCA 循環中 malate 氧化反應不足，最後 降低 ATP 的生成。若葡萄糖濃度較高，則會不斷累積酒精，並產生 Crabtree 效應(Cai et al., 2016)。故後續設計兩種不同葡萄糖饋料條件的實驗，單一濃度 饋料方式為：在葡萄糖消耗完畢時，每小時給予系統葡萄糖 6g，交替濃度饋 料方式為：在葡萄糖消耗完畢時，添加兩種不同濃度的葡萄糖分別為 6g 和 15g，並且以酒精來調控葡萄糖所添加的量，若酒精濃度有所下降即代表葡萄 糖濃度不足，則給予 15g 葡萄糖；反之若酒精濃度有所上升，則給予 6g 葡萄 糖，使用交替饋料之方式調控酒精濃度。兩項實驗之葡萄糖起始濃度為 20g/L，
酵母萃取粉起始濃度為 5.5 g/L，甲硫胺酸的起始濃度皆為 0.42 g/L，探討此兩 種不同饋入葡萄糖方式對於整個發酵系統之影響。
由圖 4-10(a)可知，兩種不同的實驗方式，皆從第 6 小時開始，菌體進入 對數成長期，直到第 39 小時菌體進入平穩期。從圖 4-10(b)和 4-10(c)可知，
40
小時，但這兩種不同的饋料方式，SAM 累積至最大值皆為第 12 小時，後續 將會饋入葡萄糖和適量的甲硫胺酸，藉由達到提升菌體量並且提升 SAM 的產 量。
42
Hourly addition by fixed amount of 6g/hr
Hourly addition by feeding amount of 6g/hr or 15g/hr
(a)
Hourly addition by fixed amount of 6g/hr
Hourly addition by feeding amount of 6g/hr or 15g/hr
Glucose (g/L)
Time (hr)
(b)
0 10 20 30 40 50 60 0
2 4 6 8 10 12 14
Hourly addition by fixed amount of 6g/hr
Hourly addition by feeding amount of 6g/hr or 15g/hr
Ethanol (g/L)
Time (hr)
(c)
圖 4-10 單一饋料和交替饋料的比較 (a)菌體歷時圖(b)葡萄糖消耗歷時圖 (c) 酒精歷時圖，溫度：28℃，發酵槽轉速：300 rpm，發酵槽進氣量：空氣 2vvm。
44
0 5 10 15 20 25 30
0.0 0.2 0.4 0.6
Hourly addition by fixed amount of 6g/hr
Hourly addition by feeding amount of 6g/hr or 15g/hr
methionine (g/L)
Time (hr)
(a)
0 10 20 30
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
0.5 Hourly addition by fixed amount of 6g/hr
Hourly addition by feeding amount of 6g/hr or 15g/hr
SAM (g/L)
Time (hr)
(b)
0 10 20 30
5 Hourly addition by fixed amount of 6g/hr
Hourly addition by feeding amount of 6g/hr or 15g/hr
Cellular SAM content (%)
Time (hr)
Hourly addition by fixed amount of 6g/hr
5L Fermentor (without DO control) Hourly addition by
feeding amount of 6g/hr or 15g/hr
SAM (g/L)
圖 4-12 單一饋料：使用單一濃度葡萄糖饋料；交替饋料：使用兩種不同濃度 葡萄糖交替饋料；對照組 SAM 最大值含量長條圖
46
小時 SAM 累積速率為 0.63 g/L-hr，第 20 小時至第 32 小時 SAM 累積速率下
48
0 10 20 30 40 50 60 70 80
50
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0 2 4 6 8 10
Specific cellular SAM content (%)
Time (hr) 300 rpm
400 rpm
(f)
圖 4-13 同時饋入葡萄糖和甲硫胺酸在不同的轉速下做培養的比較 (a)菌體歷 時圖(b)葡萄糖消耗歷時圖(c)酒精歷時圖(d)甲硫胺酸消耗歷時圖(e) SAM 生成 歷時圖(f)菌體中 SAM 含量歷時圖，溫度：28℃，300 rpm：全程轉速皆 300 rpm，400 rpm：起始轉速 300 rpm，第 8 小時將轉速調整為 400 rpm 直到結束，
發酵槽進氣量：空氣 2vvm。