I-Shou University Institutional Repository:Item 987654321/21388

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(1)義守大學生物技術與化學工程研究所碩士論文以 S. cerevisiae 突變株發酵生產 S- 腺. 苷基甲硫氨酸 Production of S-adenosyl L-methionine by S. cerevisiae mutant. 研究生：宋文峯指導教授：吳俊毅博士. 中華民國一零六年七月.

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(3) 中文摘要甲硫胺酸為 S-腺苷甲硫胺酸(SAM)的前驅物，SAM 可用於治療抑鬱症、關節炎、肝功能紊亂等疾病。本實驗室購買 ATCC 7752，能將甲硫胺酸代謝成 SAM，再經由化學突變後，利用最適化發酵條件，在充分的葡萄糖和甲硫胺酸下，菌體中 SAM 含量可達 8.72 %。於本研究中，以饋料批次的方式發酵生產 SAM，探討饋料種類和濃度對此饋料批次系統之影響。發酵液中有三種物質(葡萄糖、酒精、甲硫胺酸)會影響菌體生產 SAM，葡萄糖為菌體主要營養物，可供菌體成長和代謝 ATP，而在代謝葡萄糖的過程中會產生酒精，若加入過量的葡萄糖會造成 Crabtree 效應，若加入葡萄糖濃度不足，菌體將會消耗酒精，則會造成 ATP 的不足。 SAM 的生成是甲硫胺酸與 ATP 結合而成，加入過量甲硫胺酸會抑制菌體成長，故需加入適量的甲硫胺酸與適量的葡萄糖，並且系統中所生產的酒精不被消耗的情況下，可得到最佳生產 SAM 之方式。利用饋料方式添加葡萄糖和甲硫胺酸，在發酵槽中，以每小時添加葡萄糖 9g，甲硫胺酸消耗完畢時添加 1.5g，並且將轉速控制在 300 rpm 下，可得 SAM 最高產量為 3.6 g/L，與批次培養方式相比，SAM 濃度提升 6.2 倍，而菌體中 SAM 含量提升 33.5 %。. I.

(4) 英文摘要 S-adenosyl-methionine(SAM), the precursor of methionine, can be used for curing depression, arthritis, liver disorders and other diseases. Our research team bought S. cerevisiae ATCC 7752 from Food Industry Research and Development Institute(Taiwan), which could metabolize methionine into SAM. With the help of ATCC 7752, the SAM content in microorganism can be up to 8.72% by chemical mutation and the optimum fermentation conditions, providing sufficient glucose and methionine. In this study, SAM was produced by fed-batch fermentation to explore the impact of feed type and concentration on this fed-batch system. There are three kinds of substances in the fermentation broth (glucose, alcohol and methionine) that will affect the production of SAM in microorganism. As the main nutrient for the bacteria, glucose can promote the growth of microorganism and its metabolism of ATP. As alcohol is produced in the process of metabolism of glucose, excessive glucose can cause Crabtree effect, while if there is no sufficient glucose, the microorganism will consume alcohol, which can cause ATP deficiency. SAM is formed by the combination of methionine and ATP, in which excessive methionine will inhibit the growth of microorganism. Hence, adding the appropriate amount of methionine and the excessive amount of glucose can achieve the best production process with the condition that the alcohol in the system will not be consumed. In the fermenter, the conduction adding glucose 9 g per hours, and adding 1.5 g of methionine when consumed, under using 300 rpm of a reactor to can reach highest SAM 3.6 g/L. Compared with the batch culture, the II.

(5) concentration of SAM increased 6.2 times, while the cellular SAM content has increased by 33.5 %.. III.

(6) 致謝首先需要感謝指導教授吳俊毅博士，從我大三開始一路到研究所畢業的細心指導，給予我許多的鼓勵以及人生的方向，在研究中不斷的耐心指導與討論，對於研究的方向和思考邏輯一一的教導，無論是在研究上或處事態度，接受到老師的教誨，使得本研究可以順利的完成，並在待人處事道理上，讓我受益良多，敬致衷心感謝。感謝義守大學吳昭燕博士與洪哲穎博士，在百忙中抽空來參與學生的論文口試，給予許多寶貴的建言和指導，使得論文更加完整。從一開始踏進實驗室教導我的學長 BOBO、明耀給了我很多寶貴的意見以及研究上的幫助，以及俐儀、智淵兩位在我需要幫忙時適時的出手幫助我，同時也感謝 2401 這個大家庭的發哥、姵汝、芳茹、瑄憶、介文、庭瑋學弟妹們，使得我在研究所的求學階段更加多采多姿。最後感謝我的家人，在我求學的過程中對我無限的支持與鼓勵，研究生的日子雖然辛苦，但是心中充滿感激。謹以此論文，獻給敬愛的家人，感謝你們在我求學過程中不斷的鼓勵與支持。在此，願將本論文的成果與喜悅與你們分享。. IV.

(7) 目錄中文摘要 ......................................................................................................... I 英文摘要 ........................................................................................................ II 致謝 ...............................................................................................................IV 圖目錄 ......................................................................................................... VII 表目錄 ...........................................................................................................IX 第一章緒論 ................................................................................................... 1 1-1 前言 ....................................................................................................... 1 1-2 甲硫胺酸循環和 SAM 製造方法 ........................................................ 2 1-3 研究動機與目的 .................................................................................... 5 第二章文獻回顧 ........................................................................................... 6 2-1 以酵母菌發酵生產 SAM ...................................................................... 6 2-2 SAM 在醫療上之意義 .......................................................................... 7 第三章實驗材料與方法 ............................................................................... 9 3-1 實驗藥品與儀器 .................................................................................... 9 3-2 菌種保存、發酵條件與分析方法..................................................... 12. V.

(8) 第四章結果與討論 ..................................................................................... 22 4-1-1 菌種突變 .......................................................................................... 22 4-1-2 菌株生產特性 .................................................................................. 24 4-1-3 不同碳源對菌體之影響 .................................................................. 25 4-1-4 微量元素對菌體的影響 .................................................................. 29 4-1-4 不同甲硫胺酸濃度對菌體的影響 .................................................. 32 4-2 不同批次培養操作對 SAM 之影響 .................................................. 33 4-3 饋料批次培養 ..................................................................................... 39 4-3-1 添加葡萄糖對菌體代謝之影響 ...................................................... 39 4-3-2 葡萄糖與甲硫胺酸同時饋入對 SAM 影響 ................................... 46 第五章結論 ................................................................................................. 51 第六章未來展望 ......................................................................................... 53. VI.

(9) 圖目錄圖 1-1 甲硫胺酸與 ATP 結合方程式............................................................ 2 圖 1-2 甲硫胺酸循環圖 ................................................................................. 4 圖 3-1 SAM 標準品與樣品分析圖 .............................................................. 15 圖 3-2 SAM 濃度校正曲線 .......................................................................... 15 圖 3-3 甲硫胺酸標準品與樣品分析圖 ....................................................... 16 圖 3-4 methionine 濃度校正曲線圖 ............................................................ 17 圖 3-5 酒精標準品與樣品分析圖 ............................................................... 18 圖 3-6 酒精濃度校正曲線圖 ....................................................................... 18 圖 3-7 葡萄糖濃度校正曲線 ....................................................................... 19 圖 3-8 乾菌重與 OD570 校正曲線圖 ........................................................... 20 圖 4-1 NTG 致死率試驗流程....................................................................... 23 圖 4-2 0.05g/L NTG 對 ATCC 7752 反應時間與致死率關係圖................ 24 圖 4-3 原始菌株與六株菌株菌體的比較 .................................................... 25 圖 4-4 不同碳源對 ATCC 7752 與 NO.40 菌株之比較............................. 28 圖 4-5 葡萄糖濃度對 ATCC 7752 與 NO.40 的 SAM 含量 .................... 28 圖 4-6 基礎培養基與完全培養基的比較 .................................................... 31 圖 4-7 完全培養基中添加不同濃度的甲硫胺酸，SAM 最大值含量的比. VII.

(10) 較圖 ............................................................................................................... 32 圖 4-8 搖瓶、發酵槽(未控制溶氧)、發酵槽(調控溶氧值)的基質比較 . 36 圖 4-9 搖瓶、發酵槽(未控制溶氧)、發酵槽(調控溶氧值)的比較 .......... 38 圖 4-10 單一饋料和交替饋料的基質比較 ................................................. 43 圖 4-11 單一饋料和交替饋料的比較 ......................................................... 45 圖 4-12 單一饋料：使用單一濃度葡萄糖饋料；交替饋料：使用兩種不同濃度葡萄糖交替饋料；對照組 SAM 最大值含量長條圖 ........................ 45 圖 4-13 同時饋入葡萄糖和甲硫胺酸在不同的轉速下做培養的比較 ..... 50. VIII.

(11) 表目錄表 3-1 實驗藥品 ............................................................................................. 9 表 3-2 實驗設備及規格 ............................................................................... 11 表 4-1. ATCC 7752 與 NO.40 菌株，累積 SAM 的濃度與菌體中 SAM 含. 量最大值比較 ............................................................................................... 28 表 5-1 不同條件下擁有最大值 DCW、SAM、菌體中 SAM 含量、消耗甲硫胺酸各項比較 ....................................................................................... 51. IX.

(12) 第一章緒論 1-1 前言 S-腺苷甲硫胺酸（S-adenosyl L-methionine，簡稱 SAM）是甲硫胺酸 (Methionine)和 ATP 經 SAM synthetase 合成的產物。SAM 廣泛存在於動物、植物和微生物體內的一種重要的生理活性物質，參與細胞內眾多生化反應，可用於治療抑鬱症、關節炎、肝功能紊亂等疾症，在歐美暢銷多年，歐美保健食品的市場中，每年約有 24 億美金的銷售量， SAM 製備方法的優化也是近年研究熱點，大致分為三種：化學合成法、體外酶促轉化法和生物轉化法。 (1)化學合成法化學合成法採用 S-腺苷-L-高半胱胺酸 (S-Adenosyl-L-homocystein，簡稱 SAH) 和甲基供體 CH3I 合成 SAM，但化學合成產物除 (-) 型的 SAM 外，還有 (+) 型的 SAM，而 (+) 型的 SAM 並無生物活性且難以分離，再加上此方法產量極低，且原料昂貴，故無廣泛的使用(林海軍, 2008)。 (2)酵素反應法利用分離自生物體的 SAM synthetase，催化反應基質 L-甲硫胺酸（Lmethionine，簡稱 L-Met）和 ATP 合成 SAM。可從大鼠肝臟提取 SAM 合成酶用作催化劑，或從大腸桿菌和酵母中分離 SAM synthetase。酵素反應法具有反應週期短、最終產物累積量高、分離提純容易、生產無污染等優點，但也有合成酶分離純化困難和反應物 ATP 成本高的缺陷。因此，目前該方法在 SAM 生產中應用受到限制(公劍王 and 韋平和, 2001)。 (3)生物轉化法在微生物生長過程中，在培養基中添加適量甲硫胺酸，利用其體內的 SAM synthetase 和自身 ATP 轉化生產 SAM，是近年報導最多，也是目前生產 SAM 的主要方法(Chen, Wang, Cai, and Zhou, 2016; 胡曉清, 郭雯, and 韓 1.

(13) 國强, 2012)。根據 Schlenk 等人發現，在含有甲硫胺酸培養基中培養，高蛋白假絲酵母（Candida utilis）、釀酒酵母（S. cerevisiae）等多種酵母，皆可累積 SAM(Gawel, Turner, and Parks, 1962)。Shiozaki 等人從多種微生物中篩選得到清酒酵母（S. sake），積累 SAM 達 10.8 g/L(Shiozaki, Shimizu, and Yamada, 1986)。與前面兩種方法相比，微生物轉化法是直接在細胞體內進行轉化，微生物中含有 SAM synthetase，ATP 可以由細胞自身代謝提供。隨著基因重組和發酵技術的發展，能實現生產菌株中 SAM 合成酶過量表達、能量代謝的增強和細胞密度的提升，這對於強化微生物轉化 SAM 發揮重要作用，因此本方法是目前生產 SAM 的主要方法。. 1-2 甲硫胺酸循環和 SAM 製造方法 SAM 是經由甲硫胺酸循環而得來，當甲硫胺酸在生物體內與三磷酸腺苷 (ATP) 進行反應，ATP 上的 adenosyl group 轉移到甲硫胺酸的硫原子，形成硫帶正電的 S-adenosyl-l-methionine (SAM) ，再水解成三個磷酸根成為 pyrophosphate (PPi) 和 orthophosphate (Pi)(圖 1-1)(Ren et al., 2017)。在此反應過程中需要甲硫胺酸腺苷基轉移酵素 Methionine adenosyltransferase (MAT)，而此酵素存在於所有生物細胞中，故被認為是生命體中必要酵素之一(Mudd and Cantoni, 1958)。. PPi. Pi. 圖 1-1 甲硫胺酸與 ATP 結合方程式甲硫胺酸循環圖(如圖 1-2 所示)，SAM 結構上帶有一個活化的甲基，此 2.

(14) 甲基主要提供於 DNA、蛋白質、神經傳導等分子甲基化，DNA 甲基化是基因表達遺傳的控制方式，SAM 結構上的甲基提供給上述之分子後即形成 S-腺苷高半胱胺酸 (S-adenosyl-L-homocysteine，簡稱 SAH) ，SAH 為甲基轉移酵素抑制劑。DNA 甲基化隨著年齡上升而下降，則較低的 DNA 甲基化可能導致細胞突變及染色體的不穩定性，然而過量的 DNA 甲基化已被證實會在腦中產生甲醇、甲醛和甲酸等毒性物質引發中毒的可能(盧光明 and 姚孝元, 1999)。 SAH 經由水解生成 Homocysteine，近年來發現 Homocysteine 是個形成心血管疾病的危險因素，當體內缺乏葉酸、維生素 B6、B12 等時，Homocysteine 將無法轉換甲硫胺酸而累積，此現象與動脈粥狀硬化具有極大關聯(Maddocks, Labuschagne, Adams, and Vousden, 2016; Sydow and Böger, 2001)。 SAM 應用廣泛，對肝臟具有保護之功能。在慢性病上的文獻記載中，慢性肝病的 MAT 活性減少，會導致 SAM 及 GSH 遞減，若在肝臟疾病上賦予 SAM 後，肝臟的 GSH 則會遞增(Lu, 2000)。然而在精神疾病史上，歐美地區已開始應用 SAM 於治療憂鬱症狀。也有另一項研究指出可利用口服 SAM 的方式，通過血腦障蔽來影響中樞 monoamine 的代謝(T Bottiglieri, Hyland, and Bottiglieri, 1994)。SAM 和軟骨組織修復也有密切關聯，而被認為對關節炎有所療效。目前已經有 SAM 之相關健康食品於市面上販售。. 3.

(15) 圖 1-2 甲硫胺酸循環圖. 4.

(16) 1-3 研究動機與目的受限於成本與技術之因素，無法使用化學合成法和體外酵素轉化法在 SAM 生產上，所以大多使用生物轉化法之方式進行研究。SAM 在醫療上具有許多幫助，無論是在關節炎、肝病、憂鬱症等方面在醫療研究上皆有相當顯著成果。隨著運動風氣的盛行，膝蓋常會不當使用，退化性關節炎已呈年輕化趨勢，不再是老年人的專利；廣告台詞：肝若不好，人生是黑白的；肝若好，人生是彩色的，肝是人體最無聲的器官，若感受到肝所帶來的疾病與疼痛，往往已造成一定程度的損害；憂鬱症往往來自於現代的社會中無形的壓力，包含金錢、人際，甚至是家庭，都是造成發病的起因。綜合以上論點，找尋並改良如何提升 SAM 產量及增加醫療上的作用，是相當具有研究意義的。大多研究集中於利用 Saccharomyces cerevisiae 生產 SAM，本實驗室自新竹食品工業研究所菌種中心購買 S. cerevisiae ATCC 7752，該菌株可以在細菌體中累積 SAM，在培養基中添加定量的甲硫胺酸，經由發酵，便可獲得大量的 SAM。若要以此菌屬生產 SAM，又不侵犯專利，以物理或化學的方式進行誘導突變，將是有效的途徑之一。S. cerevisiae 以甲硫胺酸為基質，透過 SAM 合成酶與 ATP 反應，但高濃度的甲硫胺酸會抑制酵母菌的生長，適量的甲硫胺酸會經由 SAM 合成酶轉換成 SAM；因此突變時，利用高濃度甲硫胺酸進行篩選條件，將可找出能代謝硫基胺基酸產生 SAM 之高轉換能力菌株。本研究以此突變菌株進行研究，以饋料法探討延續發酵程序的可能性。目標為添加適量的甲硫胺酸，延長發酵時間並且增加菌體量，藉以提升 SAM 的生產力(Chen, Yang, et al., 2016; Zhao et al., 2016)，使菌株可產出最大 SAM 的濃度。. 5.

(17) 第二章文獻回顧 2-1 以酵母菌發酵生產 SAM 以微生物發酵技術生產 SAM 相較於化學合成與體外酵素轉換法，具有低成本、高產率、易分離等優勢，因此已有許多研究團隊投入相關領域，其結果相當豐富。 1961 年奧瑞岡州大學微生物學系研究團隊得知，SAM 參與多種酶轉移反應，主要作為甲基化中的甲基供體，也同時瞭解到使用化學合成法與酵素轉化法不合乎成本需求，故此研究團隊找尋以最適合菌種生產 SAM，當中試驗 E. coil、S. cerevisiae、Pseudomonas 等十種不同菌種，S. cerevisiae 可生產 SAM，而其產量卻是相當低(Gawel et al., 1962)。 1966 年日本東北大學 Hajime Takahashi 發現，在酵母菌的生長過程中添加適量的甲硫胺酸有助於 SAM 的生長，但添加過量的甲硫胺酸反而會抑制酵母菌的生長，且酵母菌將無法代謝甲硫胺酸生產 SAM(Takahashi and Takahashi, 1968)。 1975 年的伊利諾大學發現 S. cerevisiae ATCC 7752 在培養過程中，額外添加甲硫胺酸可提升 MAT 之活性，與未添加甲硫胺酸之活性相比提升 3 倍，則 SAM 的產量可提升 80 倍(Holcomb and Shapiro, 1975) 。 2003 年中國浙江大學使用廢棄啤酒酵母發酵同時生產 SAM 和 Glutathion。使用間歇式添加甲硫胺酸，並且提高葡萄糖濃度，以便於提供充足的 ATP 與甲硫胺酸合成 SAM，最終累積 SAM 濃度為 1 g/L，SAM 的產率為 4%。2004 年此研究團隊再次得知，葡萄糖一次給予較高濃度會造成 Crabtree 效應，導致菌體量無法提升且死亡，將原本添加葡萄糖方式改為使用饋料之方式，並且利用轉速控制 DO，將 DO 值恆保持大於 20%，而發酵過程中所產生的酒精濃度控制於 10 g/L 以下，最終 SAM 的產量達 1.55 g/L，有效提高 55%(Lin 6.

(18) et al., 2004) 。. 2-2 SAM 在醫療上之意義許多年前，SAM 就已被證實與肝臟有密切的關係，因為酒精肝硬化的患者的血液中累積大量甲硫胺酸(Mato, Alvarez, Ortiz, and Pajares, 1997) 。而在近幾年的臨床實驗指出， SAM 可以減輕關節炎疼痛 (Rutjes, Nüesch, Reichenbach, and Jüni, 2009) 。 2002 年美國馬里蘭州的研究團隊指出，長期使用 SAM 對於關節炎是相當有幫助的，同時也證明 SAM 之抑鬱效果，透過抑鬱效果間接影響長期飽受關節炎困擾之病患，減輕此疾病帶來的疼痛(Soeken, Lee, Bausell, Agelli, and Berman, 2002) 。 1987 年義大利臨床研究部門探討 SAM 對於關節炎治療效果，SAM 在關節的軟骨細胞上會刺激蛋白聚醣合成，具有止痛和消炎之作用，而在胃腸道和其他器官並無明顯之副作用，且 SAM 與其他針對關節發炎之用藥相比，藥效相似且病人的耐受性較高(Di Padova, 1987) 。 1987 年在阿根廷毒理學研究所每天給予患有關節炎的兔子 30 mg/kg 、 60 mg/kg，持續長達 12 週，最後結果相較於未給予 SAM 的兔子相比，軟骨有明顯增加，但劑量多寡並無明顯差異(Barceló, Wiemeyer, Sagasta, Macias, and Barreira, 1987) 。 1990 年甲基化已經證實與精神疾病有關，而 SAM 則是一個甲基供體，是一種有效抑制憂鬱的成分，作者研究 15 位重度憂鬱病患，發現 SAM 是一種安全有效的抗鬱藥，且副作用少效果快(Kagan, Sultzer, Rosenlicht, and Gerner, 1990) 。美國和英國的研究團隊指出，SAM 的合成與葉酸和維生素 B12 代謝有密切的相關，若缺少此維生素則會降低 SAM 的濃度，即葉酸和維生素 B12 可 7.

(19) 能會引起相關的精神疾病，包括憂鬱症、癡呆等等，SAM 具有抗憂鬱之功效，初步研究表明可能改善癡呆症病患(Teodoro Bottiglieri, Hyland, and Reynolds, 1994; Shea and Rogers, 2014) 。 1990 年美國藥品食品管理局通過營養補充品健康及教育法，此法令同意 SAM 可用於食物添加劑，於同年 SAM 做成膠囊於市面上販售(Rutjes et al., 2009)。已有許多研究可證實 SAM 對於人體是有益的，不論是器官中的肝臟或者是關節處，甚至到精神疾病方面的憂鬱症，從這些研究指出，SAM 對於人體中是不可或缺的一項物質。. 8.

(20) 第三章實驗材料與方法 3-1 實驗藥品與儀器 1.. 實驗藥品酵母粉為食品級，甲醇、乙腈、辛烷磺酸鈉、三氯乙酸為 LC 級，其餘藥. 品皆為試藥級，實驗藥品如表 3-1 所列。. 表 3-1 實驗藥品藥品名稱. 廠牌. 供應廠商. 磷酸氫二鉀 (Dipotassium. SHOWA 昭和化學株. 景明化工股份. Hydrogenphosphate, K2HPO4)、磷. 式會社. 有限公司. 酸二氫鉀 (Potassium Dihydrogenphosphate, KH2PO4)、硫酸錳( Manganous(II) sulfate hydrate,MnSO4)、硫酸銅 ( Copper(II) sulfate,CuSO4) 氯化鈣(Calcium chloride,CaCl2). 日本試藥工業株式會社. 硫酸鋅(Zinc sulfate,ZnSO4). 島久株式會社. 酒精(Ethanol). ECHO. 氯化鎂(Magnesium. SIGMA. 友和股份貿易有限公司. chloride,MgCl2)、碳酸二氫鈉 (Sodium dihydrogen phosphate,NaH2PO4)、S - 腺苷甲硫胺酸(S – adenosyl methionine)、. 9.

(21) 乙腈(Acetonitrile)、氫氧化鈉 (Sodium Hydroxide,NaOH) 、磷酸 (phosphoric acid,H3PO4)、硫酸 (Sulfuric acid,H2SO4) 三氯乙酸(Trichloroacetic acid)、L - Alfa Aesar 甲硫胺酸(L – methionine) 辛烷磺酸鈉(1-Octanesulfonic acid,CH3(CH2)7SO3Na)、硫酸氨. J.T.Baker. (Ammonium Chloride, (NH4)2SO4) 洋菜 (Agar)、酵母萃取物 (Yeast. Difco. 啟新生物科技有限公司. Extract )、麥芽萃取物(Malt Extract)、消化蛋白質(peptone)。 Glucose analyze reagent. ASK. 東耀生物科技有限公司. 10.

(22) 2.. 儀器使用發酵實驗儀器與常用實驗設備規格列於表 3-2。. 表 3-2 實驗設備及規格設備名稱. 規格. 型號/廠牌. Max 13000rpm 桌上離心機. Heraeus Max load 24 x 4g. pH 偵測儀滅菌釜. 0.0 – 14.0 pH. SP-701 / Suntex. 消毒溫度 121℃ TM329 / Tomin 2. 消毒壓力 1.2 kg/m 高速離心機分光光度計. CF16RX / Hitachi 300~950 nm. SP-830/ Metertek. HPLC auto sample. LC - 10AT /Shimadzu. HPLC auto sample. 717 plus/ Waters. HPLC RI detector. 2414/Waters. HPLC ELSD detector. 2424/Waters. HPLC UV detector. SPD-10A / Shimadzu. HPLC pump. Delta 600/Waters. HPLC. 1110 Series / Agilent 4.6 x 250 mm. TC – 18 / Agilent Nucleodur. 4.6 x 250 mm HPLC column. C18/Macherey-Nagel ICE-99-9861/Chrom 7.8 x 300 mm Tech. 發酵槽. 5L 11. 進基.

(23) 溶氧電極. Oxyferm325/ Hamilton. 溶氧偵測儀. Biotop. 酸鹼電極. Mettler Toledo. 泡沫控制器. Bitotop. 空氣壓縮機. 7.5 HP/ Swan. 氣體流量控制儀. 0~10 LPM. Pwyer. 空氣過濾器. 0.2μm PTFE. Midisart 2000/ Sartorius. 空氣乾燥機. SMC. 搖瓶培養箱. S303R / Firstek. 3-2 菌種保存、發酵條件與分析方法 1.. 菌種來源原始菌株為 S. cerevisiae ATCC 7752，購自新竹食品工業研究所菌種中心，. 再經由突變篩選可耐高濃度甲硫胺酸，取得能大量生產並累積 SAM 之突變菌株。 2.. 菌種保存與培養 A. 菌株於固態培養基上活化，並置於28 ℃下，培養24小時。 B. 以高溫火焰槍加熱殺菌後之白金環刮取已活化之菌株，接種入含有 100 ml 液態前培養液之500 ml之搖瓶中。 C. 置於28 ℃，200 rpm 恆溫培養箱培養10-12小時。. 將經由滅菌釜滅菌過的無菌水及甘油，以 1:1 比例配製成甘油水溶液。含有菌液的搖瓶經恆溫培養箱培養 12-15 小時後，分別取 0.5 ml 的菌體懸浮液及 0.5 ml 甘油水溶液，置入離心管中，充份混合均勻後，置於 12.

(24) -80 ℃低溫冷凍保存。 3.. 培養基 A. 固態培養基(YPD Agar)：葡萄糖 20 g /L，酵母粉 10 g /L，蛋白腖 20 g/L，洋菜 15 g/L，pH 6.5。 B. 基礎培養基(Basal Medium)：葡萄糖 20 g/L，酵母粉 3 g/L，麥芽萃取粉 10 g/L，蛋白腖 5 g/L，pH 6.5。 C. 完全培養基(Complete Medium)：葡萄糖 20 g/L，酵母粉 5.5 g/L， (NH₄)₂S0₄ 6 g/L，K₂HP0₄ 2.5 g/L，KH₂PO₄ 5 g/L，MnSO₄ 0.045 g/L， ZnS0₄ 0.07 g/L，MgC1₂ 0.25 g/L，CaCl₂ 0.15 g/L，甲硫胺酸 0.42 g/L， CuSO₄ 0.0025 g/L，pH 6.5。. 4.. 搖瓶實驗取出保存於 4 ℃之固態培養基菌種，於室溫下回溫 15 分鐘後，在無菌操. 作台進行實驗，以高溫火焰槍加熱殺菌白金耳環，刮取已活化之菌株，接種入 100 ml 液態基礎培養基之搖瓶中，於 28 ℃、200 rpm 培養箱中培養 12 小時後，將菌液搖晃均勻取出 10 ml，接種入含有 90 ml 完全培養基之 500 ml 搖瓶中，於 28℃，200 rpm 培養箱中培養，並於適當時間取樣，進行 pH、菌體量(OD)、SAM 濃度、葡萄糖濃度、酒精濃度、甲硫胺酸濃度分析。 5.. 發酵槽培養取出保存於 4 ℃之固態培養基菌種，於室溫下回溫 15 分鐘後，在無菌操. 作台進行實驗，以高溫火焰槍加熱殺菌白金耳環，刮取已活化之菌株，接種入 300 ml 液態基礎培養基之搖瓶中，於 28 ℃、200 rpm 培養箱中培養 12 小時後，將菌液接種入含有 2700 ml 完全培養基發酵槽中，於 28℃，300 rpm 培養，通入空氣 2 vvm，並於適當時間取樣，進行 pH、菌體量(OD)、SAM 濃度、葡萄糖濃度、酒精濃度、甲硫胺酸濃度分析。 13.

(25) 6.. SAM 的萃取 D. 醱酵液離心(12000 rpm)，將上清液保留待後續實驗的分析，收集菌體，用 R.O 水將殘留的發酵液清洗乾淨並離心收集菌體，再用 1.0M 的過氯酸(HClO₄)室溫下進行破菌萃取 30 min，12000 rpm 離心收集上清液，進行 HPLC 分析。(Wang, Kramer, Yang, Pereira, and Tao, 2001). 7.. SAM 分析以 Macherey-Nagel 的 Nucleodur C18 (4.6 x 250mm)管柱為固定相，移動. 相分為兩種(A 和 B)，移動相 A：0.1 M 磷酸二氫鈉、0.008 M OSA、2 % ACN，以 1 M 的磷酸調整 pH 至 2.65；移動相 B：0.15M 磷酸二氫鈉、0.008M OSA、 26 % ACN，再以 0.45 µm 之過濾器過濾使用。移動相流速為 1 ml/min，起始移動相比例為 85：15 (A：B)，5 分鐘時 30： 70 (A：B)，20 分鐘時 0：100 (A：B)，以 Shimadzu SPD-10A UV detector (波長為 254 nm)分析，每次注射樣品量為 20 µL，以 SISC 軟體分析。SAM 滯留時間為 19.8 分鐘，分析結果如圖 3-1，校正曲線如圖 3-2。(Wang et al., 2001) 將 SAM 標準品 1g/L 分析結果圖(圖 3-1)中 11.2 分鐘、13.7 分鐘和 19.8 分鐘的波峰面積相加後再除以 19.8 分鐘的波峰面積最後乘上所分析之濃度，計算之後，需將分析後 SAM 的濃度乘上 0.62，方為準確濃度。. 14.

(26) SAM STD SAM Sample. 500. 400. mV. 300. 200. 100. 0 0. 10. 20. 30. 40. Time (min). 圖 3-1 SAM 標準品與樣品分析圖. 0.7. SAM = 1.6*10-7Area R² = 0.9996. 0.6 SAM (g/L). 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0. 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 Area (uv*sec) 圖 3-2 SAM 濃度校正曲線. 15.

(27) 8.. 甲硫胺酸分析以 Anglient 的 TC-C18 (4.6 x 250mm)管柱為固定相，移動相分為兩種(A. 和 B)，移動相 A：水中含有 0.1 %三氯乙酸，移動相 B：ACN 中含有 0.1 %三氯乙酸，再以 0.45 µm 之過濾器過濾使用。移動相流速為 0.6 ml/min，起始移動相比例為 100：0 (A：B)，分析時間從第 5 分鐘開始至 20 分鐘時，移動相比例由 100：0 (A：B)至 60：40 (A：B)，以 Waters 2424 ELSD 進行分析漂移管溫度為 90 ℃，高氮進氣量為 20 psi，固定相溫度為 30℃，將上述離心後的上清液取 10 µL，以 SISC 軟體分析。甲硫胺酸滯留時間為 14.2 分鐘，分析結果如圖 3-3，校正曲線如圖 3-4。. 100. methionine STD methionine Sample. 90 80 70. mV. 60 50 40 30 20 10 0 0. 10. 20. 30. 40. Time (min). 圖 3-3 甲硫胺酸標準品與樣品分析圖. 16. 50.

(28) 0.9 0.8 methionine (g/L). 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3. methionine = -4.55*10-15Area2 + 1.24*10-7Area R² = 0.9989. 0.2 0.1 0 0. 5000000 10000000 Area (uv*sec). 15000000. 圖 3-4 methionine 濃度校正曲線圖 9.. 酒精分析以 Chrom Tech 的 ICE-99-9861(7.8 x 300mm)為固定相，移動相為 0.01 N. H2SO4，再以 0.45 µm 之過濾器過濾使用。移動相流速為 0.6 ml/min，以 Waters 2424 RI detector 進行分析溫度為 45 ℃，每次注射樣品量為 20 µL，以 SISC 軟體分析。酒精滯留時間為 22.9 分鐘，分析結果如圖 3-5，校正曲線如圖 3-6。. 17.

(29) Ethanol STD Ethanol Sample 25. 20. mV. 15. 10. 5. 0 0. 5. 10. 15. 20. 25. 30. Time (min). 圖 3-5 酒精標準品與樣品分析圖. 25 Ethanol = 1.25*10-5Area R² = 0.9999. Ethanol (g/L). 20 15 10 5 0 0. 500000. 1000000 1500000 Area (uv*sec). 圖 3-6 酒精濃度校正曲線圖. 18. 2000000.

(30) 10. 葡萄糖的測定 1）配製不同濃度之葡萄糖標準溶液，濃度為 0 g/L ~ 2 g/L。 2）各濃度之葡萄糖溶液各取 10 μL，加入微量離心管中。 3）在含各濃度葡萄糖溶液之微量離心管加入 1 ml 之葡萄糖水劑，並充分混合。 4）將微量離心管置於 37 ℃之恆溫水浴槽，以 100 rpm 之轉速震盪 10 分鐘。 5）以分光光度計於 500 nm 之波長測定吸收值。 6）吸收值對葡萄糖濃度作圖，可得濃度為 0.0～2.0 g/L 之葡萄糖濃度檢量線。. 7）取上述離心的上清液樣品 10 μL，再按照上述步驟與葡萄糖水劑做反應，測量得知其 OD 值並代入所做出的檢量線即可得知葡萄糖濃度。校正曲線如圖 3-7。. 2.5 Glucose = 2.75*OD R² = 0.9933. Glucose (g/L). 2 1.5 1 0.5 0 0. 0.2. 0.4 OD500. 圖 3-7 葡萄糖濃度校正曲線. 19. 0.6. 0.8.

(31) 11.. 菌株濃度測定菌體量的測量以分光光度計於波長 570 nm 測量，經由校正曲線公式換算. 成菌體量。菌體量之校正曲線製作： 1）將鋁皿放入 105 ℃烘箱 12 小時後秤重。 2）將發酵液測量 OD 完後，菌體以 12000 rpm 離心 20 分鐘。 3）離心後的菌體以 R.O 水潤洗，再以 12000 rpm 離心 20 分鐘。 4）離心後的菌體與 30 ml 無菌水充分混合。 5）將混合溶液倒入鋁皿中，以 105 ℃烘箱烘乾(12 小時)，再秤其重量。. 6）將烘乾之菌體量(DCW)與其 OD570 值做圖，繪出菌體量對 OD 值之標準曲線。校正曲線如圖 3-8。. 7. DCW (g/L). 6. DCW = 0.6264*OD R² = 0.9963. 5 4 3 2 1 0 0. 2. 4. 6 OD570. 8. 圖 3-8 乾菌重與 OD570 校正曲線圖. 20. 10. 12.

(32) 12. 菌體中 SAM 的含量(Cellular SAM content)計算公式. 菌體中 SAM 的含量的計算方式為，利用 HPLC 所分析 SAM 的濃度除以. 乾菌重，並且換算成百分比。 Cellular SAM content (%) =. SAM. DCW. 21. x 100(%).

(33) 第四章結果與討論 4-1-1 菌種突變以突變技術改善菌種，利用 NTG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 進行化學突變，以致死率試驗找出合適突變條件，並將甲硫胺酸(L-Methionine) 高濃度耐受性菌株當成篩菌條件，找出能代謝硫基胺基酸產生 SAM 之有效菌株。 NTG 為強氧化劑，配製時需配載口罩及手套等保護裝備。NTG性質不穩定，遇光易分解釋放出 NO，顏色由黃色變為綠色誘變效應降低，須以棕色瓶子置於 -20 ℃乾燥低溫保存，使用時再行配置。在水溶液中，NTG 隨著不同的pH變化產生不同的分解產物，進而影響突變效應。當溶液pH 小於 5.5 時，NTG 分解成 HNO₂，HNO₂ 本身具有誘變作用；當溶液 pH 8.0 以上時，NTG 會分解成重氮甲烷(CH₂N₂)，對核酸起烷化作用，引起微生物突變；當溶液 pH 6.0 時， NTG 本身和 DNA 起烷化反應而導致突變，通常在 pH6.0 條件下進行變異處理。以醱酵液態前培養基進行 ATCC 7752 培養 12 小時，再進行 11000 rpm 離心，移除上清液剩下的菌體置於已滅菌的磷酸緩衝溶液，充份洗滌後離心去除上清液，重覆步驟兩次洗淨菌體。離心收集菌體後，將菌體加入滅過菌的蒸餾水中製成菌懸液，取出適當體積稀釋塗抹於 YPD 培養基(YPD medium)的洋菜培養皿中，再置於 28 ℃培養箱中培養 24 小時，進行原始菌量計數(N0)。將剩餘的菌懸液離心去除上清液，接到已配置好之不同濃度的 NTG 溶液，反應不同的時間後取出，作適當稀釋倍率塗抹於肉汁培養基中，置於 28 ℃培養箱中培養 24 小時後，以平板計數法分別計算突變前與突變後菌量(NF)，實驗流程如圖 4-1 所示。致死率計算公式如下：. 22.

(34) R D (%) =. N0 − N F × 100% N0. RD：致死率，N0：原始菌數，NF：NTG/UV 處理後菌數菌體經培養 12hr 活化之醱酵液. 離心經 buffer 洗滌. 1ml 菌液作為原點(N₀). 0.9ml 菌液+0.1ml NTG 溶液. 稀釋培養在篩菌 agar 上. 每 15~30min 定時取點. 以 buffer 洗滌 2 次(Nғ). 28°C，24hr，計算菌落數. 圖 4-1 NTG 致死率試驗流程. NTG 有超誘變劑之稱，能使細胞發生一次或多次突變，誘變效果良好。所以實驗選用 NTG 化學突變，以突變技術改善菌種(Saccharomyces cerevisiae)，以致死率試驗找出合適突變條件，並將 3 g/L 甲硫胺酸當成篩菌機制，找出能代謝硫基胺基酸產生 SAM 之有效菌株。由致死率試驗結果，突變條件選用 0.05 g/L NTG 作用 60 min，其致死率達到 97 %(圖 4-2)。以含有 3 g/L 甲硫胺酸之篩菌平板培養基進行篩菌，挑選生長速度快與菌量面積大的菌落，初步挑出 266 株菌株，以醱酵液態前培養基加上 1 g/L 甲硫胺酸，經液態培養 3hr 並以 HLPC 分析 SAM，挑出 6 株 SAM 產量最高菌株，編號分別為 3、13、 23、26、40 與 44。. 23.

(35) 100. 致死率 (%). 95 90 85 80 75 70 0. 10. 20. 30. 40 50 60 Time (min). 70. 80. 90. 100. 圖 4-2 0.05g/L NTG 對 ATCC 7752 反應時間與致死率關係圖. 4-1-2 菌株生產特性以醱酵液態完全培養基進行六隻菌株的歷時培養，分析其 pH 變化、菌體量變化(OD)與 SAM 濃度。醱酵液中起始 pH 6.5，pH 隨著菌體成長逐漸下降，最後落於 pH 5.0~5.5。圖 4-3(a)為原始菌株與六株突變菌株菌體量的生長歷時圖，原始菌株的生長速度最快，比生長速率為 0.19 hr-1，菌體量可達 9 g/L。突變後六隻菌株的比生長速率與菌體量差異不大，平均比生長速率為 0.17 hr1. ，平均菌體量為 7.5 g/L。以 HPLC 分析其菌體內 SAM 比率，如圖 4-3(b)所. 示。隨著菌體消耗葡萄糖與轉換基質中的甲硫胺酸，菌體內的 SAM 含量隨時間而增加；當菌體完全代謝葡萄糖後，菌體內的 SAM 含量逐漸降低。原始菌的 SAM 含量在第 12 小時達到最高(5.3%)，六隻突變菌株的菌體內部 SAM 量均比原始菌株為高，可見突變策略確實可以提高菌體內的 SAM 含量。第 15 小時，NO.40 突變株中 SAM 含量可達 8.6%，較原始菌株增加 62% 的 SAM 含量。. 24.

(36) 10. DCW (g/L). 8. ATCC 7752 NO.3 NO.13 NO.23 NO.26 NO.40 NO.44. 6. 4. 2. 0 0. 5. 10. 15. 20. 25. Time (hr). (a) ATCC 7752 NO.3 NO.13 NO.23 NO.26 NO.40 NO.44. 1.0. Cellure SAM content (%). 0.8. 0.6. 0.4. 0.2. 0.0 0. 5. 10. 15. 20. 25. Time (hr). (b) 圖 4-3 原始菌株與六株菌株菌體的比較 (a)菌體歷時圖(b)菌體中 SAM 含量歷時圖. 4-1-3 不同碳源對菌體之影響 25.

(37) 發酵過程中，碳源提供菌體成長代謝的營養源，單糖、雙糖或寡糖均有不同的作用。本實驗分別以 40 g/L 之葡萄糖、麥芽糖、半乳糖等不同碳源與 5.5 g/L 酵母萃取粉和甲硫胺酸 0.42 g/L，進行原始菌株 ATCC 7752 與 NO.40 菌株之菌體培養，觀察其菌體生長、SAM 含量變化。圖 4-4(a)為 100 ml 發酵液中 SAM 累積濃度比較圖，雖然麥芽糖與半乳糖有利於菌體量的增加，但無助於菌體內 SAM 的累積。以葡萄糖為碳源，NO.40 突變株的 SAM 累積濃度高於 ATCC 7752 原始菌。圖 4-4(b)為不同碳源下進行菌體培養，發酵液中菌體內 SAM 含量之歷時變化圖，由圖 4-4 (a) (b)可看出，雖然半乳糖與麥芽糖有利於菌體的生長，但葡萄糖有利於菌體轉換甲硫胺酸為 SAM，因此以葡萄糖為碳源，NO.40 菌株中的 SAM 含量高於其他條件。以葡萄糖為主要碳源，使用葡萄糖 20 g/L 與 40 g/L 相比較，酵母萃取粉 5.5g/L，並且再加入 0.42 g/L 甲硫胺酸，從圖 4-2 中可看出，相同菌株進行發酵，葡萄糖濃度不利於菌體中 SAM 的合成；以 ATCC 7752 和 NO.40 為例， 20 g/L 葡萄糖進行發酵，ATCC 7752 SAM 含量達 0.27 g/L，而 NO.40 SAM 含量達 0.42 g/L，由此可確認 NO.40 菌株確實可較原始菌 SAM 產量為高。以 40 g/L 葡萄糖進行發酵，ATCC 7752 SAM 含量減少 70.4 %，NO.40 SAM 含量減少 68.1%。由此可再確認 NO.40 菌株的發酵條件，葡萄糖起始濃度為 20 g/L 比 40 g/L 對於菌體生產 SAM 更加有幫助。經由上述的實驗整理如表 4-1，葡萄糖、半乳糖、麥芽糖起始濃度為 40 g/L，在三種不同的碳源培養之下，NO.40 菌株代謝生產 SAM 的能力或者菌體中 SAM 的含量，皆高於原本 ATCC 7752 菌株，三種不同碳源為基礎碳源的培養基，其中以葡萄糖培養所得 SAM 產量最佳，再從圖 4-5 可得知，培養基中的葡萄糖起始濃度為 20 g/L，對於發酵系統中可得最多的 SAM，故後續使得培養基主要碳源為葡萄糖，且起始濃度為 20g/L。 26.

(38) Glu- ATCC 7752 Glu- 40 Gal- ATCC 7752 Gal- 40 Mal- ATCC 7752 Mal- 40. 0.10. 0.08. SAM(g/L). 0.06. 0.04. 0.02. 0.00 0. 4. 8. 12. 16. Time(hr). (a). 27. 20. 24. 28.

(39) Cellular SAM content (%). 2. Glu- ATCC7522 Glu- 40 Gal- ATCC7522 Gal- 40 Mal- ATCC7522 Mal- 40. 1. 0 0. 4. 8. 12. 16. 20. 24. 28. Time(hr). (b) 圖 4-4 不同碳源對 ATCC 7752 與 NO.40 菌株之比較 (a) SAM 生成歷時圖 (b) 菌體中 SAM 含量的歷時圖，Glu：葡萄糖，Gal：半乳糖，Mal：麥芽糖 NO.40 ATCC 7752. 0.3. SAM (g/L). 0.2. 0.1. 0.0 0. 20. 40. 60. Glucose (g/L). 圖 4-5 葡萄糖濃度對 ATCC 7752 與 NO.40 的 SAM 含量. 表 4-1 ATCC 7752 與 NO.40 菌株，累積 SAM 的濃度與菌體中 SAM 含量最 28.

(40) 大值比較菌體中 SAM 含量 (%). SAM (g/L) ATCC 7752. NO.40. ATCC 7752. NO.40. Glu 40 g/L. 0.05. 0.18. 1.18. 1.7. Gal 40 g/L. 0.037. 0.0558. 0.97. 1.48. Mal 40 g/L. 0.05. 0.062. 1.06. 1.5. 4-1-4 微量元素對菌體的影響微量元素對菌體生長有不可或缺的影響，如鉀、鈉離子控制細胞膜的滲透性，鎂、鈣、錳離子對酵素活性具有啟動作用，磷酸根離子影響細胞體內的能量儲存。本實驗以葡萄糖 20 g/L，酵母粉 5.5 g/L，甲硫胺酸 0.42 g/L 為基礎培養基(basal medium)，另以基礎培養基和微量元素為完全培養基(complete medium)進行菌體培養，比較 ATCC 7752 與突變菌株 NO.40 的菌體生長歷時變化與菌體內 SAM 含量的變化。圖 4-6(a)為以基礎培養基與完全培養基進行菌體生長變化歷時圖，不論是突變菌株 NO.40 或 ATCC 7752，可看出添加微量元素的培養基利於菌體成長，而在完全培養基中，ATCC 7752 菌體量比 NO.40 菌體量高 19%，對於 ATCC 7752 成長的助益遠大於突變株。圖 4-6(b) 為不同培養基下，菌體中 SAM 含量的歷時變化圖，由圖中可看出在 NO.40 菌中，當基質含有微量元素時，有助於菌體中 SAM 的累積，約可增加 58.9 %的 29.

(41) 菌體中 SAM 含量。若以完全培養基(葡萄糖、酵母萃取粉、甲硫胺酸和微量元素)進行突變株 NO.40 的培養，第 15 小時菌體中 SAM 含量可達 5.58 %，為原始菌株 ATCC 7752 菌體中 SAM 含量的 1.36 倍。SAM 的累積與葡萄糖濃度、甲硫胺酸濃度、發酵時間有關，從圖 4-6(b)中可看出 NO.40 菌株的 SAM 含量於第 15 小時達到最高，但 ATCC 7752 的菌體中 SAM 含量於第 12 小時達到最高。. 10. 40 (Complete) 40 (Basal) ATCC7752 (Complete) ATCC7752 (Basal). 8. DCW(g/L). 6. 4. 2. 0 0. 3. 6. 9. 12. 15. Time(hr). (a). 30. 18. 21. 24. 27. 30.

(42) 40 (Complete) 40 (Basal) ATCC 7752 (Complete) ATCC 7752 (Basal). 7. Cellular SAM content (%). 6 5 4 3 2 1 0 0. 3. 6. 9. 12. 15. 18. 21. 24. 27. 30. Time(hr). (b) 圖 4-6 基礎培養基與完全培養基的比較 (a)菌體歷時圖(b) 菌體中 SAM 含量的歷時圖，Complete：完全培養基；Basal：基礎培養基；40：NO.40 菌株； ATCC 7752：原始菌株(ATCC 7752)。. 31.

(43) 4-1-4 不同甲硫胺酸濃度對菌體的影響高濃度的甲硫胺酸對菌體有抑制作用，在好氧條件下，菌體亦可利用甲硫胺酸轉換成 SAM。因此本實驗探討不同甲硫胺酸濃度對菌體生長與菌體中累積 SAM 的影響。在完全培養基中添加不同濃度的甲硫胺酸，於第 12 小時分析菌體中 SAM 含量，結果如圖 4-7 所示。隨著甲硫胺酸濃度的增加，ATCC 7752 與 NO.40 突變株的菌體中 SAM 含量皆會增加，當甲硫胺酸濃度為 0.42 g/L 時，NO.40 菌株中 SAM 含量為 5.58%，較原始菌株高出 1.36 倍。相同時間下，當甲硫胺酸濃度達 0.56 g/L 以上，菌體內的 SAM 含量開始下降，顯見甲硫胺酸濃度過高將會影響菌體生長與累積 SAM 的活性(Hu and Wang, 2009)。. Cellular SAM content (%). 6. 40 ATCC 7752. 4. 2. 0 0.14. 0.28. 0.42. 0.56. 0.70. Methionine(g/L). 圖 4-7 完全培養基中添加不同濃度的甲硫胺酸，SAM 最大值含量的比較圖 40：NO.40 菌株；ATCC 7752：原始菌株(ATCC 7752)。. 32.

(44) 4-2 不同批次培養操作對 SAM 之影響使用搖瓶與 5L 發酵槽進行培養，討論不同體積與氧氣質傳的影響，搖瓶的培養體積為 100ml，5L 發酵槽培養液體體積為 3L，皆使用完全培養基，葡萄糖起始濃度為 20 g/L，酵母萃取粉起始濃度為 5.5 g/L，甲硫胺酸起始濃度為 0.42 g/L。操作條件分為三種(1)將搖瓶的溫度恆定於 28℃，轉速為 200 rpm 下培養，(2)將 5L 發酵槽的系統溫度恆定於 28℃，轉速為 300 rpm，通入 2 vvm 的空氣，(3)將 5L 發酵槽的系統溫度恆定於 28℃，初始轉速為 300 rpm，通入 2 vvm 的空氣，並且在發酵過程中，當溶氧值低於 10%時(圖 4-8(b)第 9 小時)調整轉速，使發酵系統的溶氧量達 10%以上。用此三種不同批次方式做培養，以(2)方式培養設定為對照組，進行發酵期間的菌體量、基質和產物比較。使用這三種不同的批次發酵方式，從圖 4-8(a)可知，這三種不同的培養方式，菌體量的最大值並沒有明顯的差異，使用發酵槽培養菌體量最高，與搖瓶相比提升 15%。從原點至第 12 小時比生長速率，搖瓶培養為 0.446 h-1；發酵槽(未控制溶氧)為 0.447 h-1；發酵槽(調控溶氧值)為 0.472 h-1，皆使用發酵槽培養下，而調控溶氧值後，菌體比生長速率提升 5.5%。圖 4-8(a)、4-8(b)和 4-8(c)相互比較，可得知在發酵過程中，當菌體進入對數成長期後，菌體將會消耗大量的氧氣和葡萄糖，葡萄糖在第 6 小時完全消耗完畢，而從第 6 小時至第 9 小時系統溶氧大幅下降呈現無氧的狀態，因此在第 9 小時(即溶氧值低於 10%)時調整轉速，轉速從原本的 300 rpm 調整至 350 rpm，但整體系統的溶氧值仍然低於 10%，故再將轉速調整為 400 rpm，使發酵系統的溶氧量達 10%以上。 SAM 的合成方式為 ATP 與甲硫胺酸的結合，圖 4-9(a)和圖 4-9(b)可得知，使用搖瓶做發酵培養，SAM 累積濃度達 0.367 g/L，發酵槽做發酵培養，SAM 33.

(45) 的累積濃度可達 0.496 g/L，調控溶氧值之發酵培養，SAM 的累積濃度可達 0.51 g/L。使用發酵槽培養與搖瓶培養相互比較下，SAM 的累積濃度提高 33.5%，而菌體中 SAM 含量提高 19.4%，使用發酵槽做培養可提升 SAM 的產量，最主要的原因為提升氧氣質傳，提升氧氣質傳後可提升 ATP 的生產量 (Miller, Wilke, and Blanch, 1987)，與足夠的甲硫胺酸結合而提升 SAM 的產量，而搖瓶培養的氧氣質傳不如發酵槽佳，又再加上甲硫胺酸並沒有消耗完畢，故使用搖瓶所生產 SAM 比使用發酵槽生產還要低(如圖 4-9(c))。將發酵槽(未控制溶氧)與發酵槽(調控溶氧值)相比，兩者 SAM 的最高濃度只有些微差異，發酵槽(調控溶氧值)的 SAM 累積濃度僅提升 1.2 %，但在 SAM 的累積速率上卻有明顯的差異。從圖 4-6(c)可發現，發酵槽(調控溶氧值) 甲硫胺酸消耗速率比發酵槽(未控制溶氧)來得快。SAM 從原點累積至最大值，使用發酵槽(未控制溶氧)做培養 SAM 生成速率為 0.026 g/L-hr，而發酵槽(調控溶氧值)的 SAM 生成速率 0.034 g/L-hr，整體提升 31 %。從圖 4-9(c)可得知，發酵槽(調控溶氧值)與發酵槽(未控制溶氧)兩種不同的方式下培養，兩者皆在第 15 小時將甲硫胺酸完全消耗完畢；而搖瓶第 15 小時至第 24 小時甲硫胺酸的濃度並無變化。從甲硫胺酸與 ATP 結合的平衡方程式可得知，並且將甲硫胺酸設定為限量試劑，理論上每克甲硫胺酸可產出 2.67g 的 SAM。這三種不同的方式培養，SAM 的轉化率也有所不同，在發酵槽(調控溶氧值) 甲硫胺酸轉化率達 45.5 % ；在發酵槽(未控制溶氧)中培養，甲硫胺酸轉化率達 44.3 %；在搖瓶中培養，甲硫胺酸轉化率達 32.8 %。使用發酵槽培養甲硫胺酸轉化率皆比搖瓶培養高，故後續將以發酵槽為主要培養方式。. 34.

(46) 100 mL Shaking flask 5L Fermentor (without DO control) 5L Fermentor (DO was controlled above 10%). 8. DCW (g/L). 6. 4. 2. 0 0. 5. 10. 15. 20. 25. 30. Time (hr). (a) 5L Fermentor (without DO control) 5L Fermentor (DO controlled above 10%). 9 8 7. DO (ppm). 6 5 4 3 2 1 0 0. 3. 6. 9. 12. Time (hr). (b). 35. 15. 18. 21. 24.

(47) 100 mL Shaking flask 5L Fermentor (without DO control) 5L Fermentor (DO was controlled above 10%). 20. Glucose (g/L). 15. 10. 5. 0 0. 5. 10. 15. 20. 25. 30. Time (hr). (c) 圖 4-8 搖瓶、發酵槽(未控制溶氧)、發酵槽(調控溶氧值)的基質比較 (a)菌體歷時圖 (b)溶氧值歷時圖 (c)葡萄糖消耗歷時圖，溫度：28℃，搖瓶轉速：200 rpm，發酵槽轉速(without DO control)：300 rpm，發酵槽轉速(DO was controlled above 10%)：300 rpm→400 rpm，發酵槽進氣量：空氣 2vvm。. 100 mL Shaking flask 5L Fermentor (without DO control) 5L Fermentor (DO controlled above 10%). 0.6. SAM (g/L). 0.4. 0.2. 0.0 0. 5. 10. 15. Time (hr). 36. 20. 25. 30.

(48) (a) 100 mL Shaking flask 5L Fermentor (without DO control) 5L Fermentor (DO controlled above 10%). Cellular SAM content (%). 8. 6. 4. 2. 0 0. 5. 10. 15. Time (hr). (b). 37. 20. 25. 30.

(49) 0.6. 100 mL Shaking flask 5L Fermentor (without DO control) 5L Fermentor (DO was controlled above 10%). methionine (g/L). 0.4. 0.2. 0.0 0. 5. 10. 15. 20. 25. 30. Time (hr). (c) 圖 4-9 搖瓶、發酵槽(未控制溶氧)、發酵槽(調控溶氧值)的比較 (a) SAM 生成歷時圖(b)菌體中 SAM 含量歷時圖(c)甲硫胺酸消耗歷時圖，溫度：28℃，搖瓶轉速：200 rpm，發酵槽轉速(without DO control)：300 rpm，發酵槽轉速(DO was controlled above 10%)：300 rpm→400 rpm，發酵槽進氣量：空氣 2vvm。. 38.

(50) 4-3 饋料批次培養利用饋入葡萄糖的方式提高菌體量，並且適度添加生產 SAM 的前驅物甲硫胺酸才可提升 SAM 的產量(O'Connor, Sanchez‐Riera, and Cooney, 1992)，除了添加甲硫胺酸之外，必須持續添加碳源以供給菌體能量和生長菌體。後續的實驗將以饋料的方式進行，除了不斷的添加葡糖糖之外，並且使用批次方式添加甲硫胺酸，探討葡萄糖與甲硫胺酸持續添加對於菌體成長和代謝生產 SAM 之影響。. 4-3-1 添加葡萄糖對菌體代謝之影響菌體以葡萄糖為碳源，代謝葡萄糖後生成菌體與產物，持續饋入葡萄糖可提升發酵過程中的菌體密度。酵母菌發酵時，酒精為副產物，若葡萄糖濃度較低，則會影響菌體所需碳源不足，且會消耗酒精，並增加 NADH 的量，進而提高 NADH：NAD+比值，影響 TCA 循環中 malate 氧化反應不足，最後降低 ATP 的生成。若葡萄糖濃度較高，則會不斷累積酒精，並產生 Crabtree 效應(Cai et al., 2016)。故後續設計兩種不同葡萄糖饋料條件的實驗，單一濃度饋料方式為：在葡萄糖消耗完畢時，每小時給予系統葡萄糖 6g，交替濃度饋料方式為：在葡萄糖消耗完畢時，添加兩種不同濃度的葡萄糖分別為 6g 和 15g，並且以酒精來調控葡萄糖所添加的量，若酒精濃度有所下降即代表葡萄糖濃度不足，則給予 15g 葡萄糖；反之若酒精濃度有所上升，則給予 6g 葡萄糖，使用交替饋料之方式調控酒精濃度。兩項實驗之葡萄糖起始濃度為 20g/L，酵母萃取粉起始濃度為 5.5 g/L，甲硫胺酸的起始濃度皆為 0.42 g/L，探討此兩種不同饋入葡萄糖方式對於整個發酵系統之影響。由圖 4-10(a)可知，兩種不同的實驗方式，皆從第 6 小時開始，菌體進入對數成長期，直到第 39 小時菌體進入平穩期。從圖 4-10(b)和 4-10(c)可知， 39.

(51) 兩種不同的條件下，在第 6 小時菌體將葡萄糖消耗完畢，故在此時開始饋料，在單一饋料實驗中，菌體進入對數成長期中的 33 小時，葡萄糖的量皆為不足，不斷消耗酒精，其遞減速率為 0.17 g/L-hr；直到第 39 小時菌體進入平穩期，酒精濃度逐漸上升。從單一饋料的實驗得知，在對數成長期，每小時葡萄糖 6g 對於菌體生長是不夠的，故交替饋料的實驗中以葡糖糖 15g 為起始饋入的量，酒精在第 9 小時持續累積至 15 小時，菌體在對數成長期時，每小時給予系統葡萄糖 15g 的量過多，所以減少每小時給予系統葡萄糖的量，改為每小時給予 6g，酒精直到第 18 小時至 21 小時大量消耗，故增加每小時給予系統葡萄糖的量，改為每小時給予 15g，以此方式交替饋料直到實驗結束。從兩種不同的葡萄糖方式饋料，可得知當菌體進入對數成長期，每小時給予系統葡萄糖 6g 是不足，而每小時給予系統葡萄糖 15g 是過量，當菌體進入平穩期後，對於每個小時給予葡萄糖 6g 是過量。本次實驗中單一饋料的菌體量為 59.6 g/L，交替饋料中的菌體量達 49.1 g/L，與對照組的菌體量 7.3 g/L 整體有大幅度的提升，單一饋料菌體量提升 7.16 倍，交替饋料菌體量提升 5.72 倍，而使用單一饋料方式又比交替饋料方式提高 21 %，故後續實驗將以單一饋料方式且葡萄糖饋入的量介於 6g 至 15g 之間。從圖 4-11(a)得知，在這兩組實驗中甲硫胺酸皆在第 12 小時完全消耗完畢，與對照組相比，皆提前 3 小時消耗完畢。圖 4-11(b)和 4-11(c)可知，SAM 的濃度皆沒有上升，單一饋料 SAM 最大值生成量為 0.267 g/L，而交替饋料為 0.391 g/L，而使用發酵槽培養(未調控 DO)為 0.496 g/L(如圖 4-12 所示)，兩者分別皆下降 46 %和 21 %，由於甲硫胺酸在第 12 小時完全消耗完畢，故兩種不同的饋料方式皆比對照組 SAM 濃度還要低。兩種不同的饋料方式提升菌體量，同時 SAM 的生成速率也提升，對照組 SAM 累積至最大值為第 15 個 40.

(52) 小時，但這兩種不同的饋料方式，SAM 累積至最大值皆為第 12 小時，後續將會饋入葡萄糖和適量的甲硫胺酸，藉由達到提升菌體量並且提升 SAM 的產量。. 41.

(53) Hourly addition by fixed amount of 6g/hr Hourly addition by feeding amount of 6g/hr or 15g/hr. DCW (g/L). 60. 40. 20. 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. Time (hr). (a) 22. Hourly addition by fixed amount of 6g/hr Hourly addition by feeding amount of 6g/hr or 15g/hr. 20 18 16. Glucose (g/L). 14 12 10 8 6 4 2 0 0. 10. 20. 30. Time (hr). (b). 42. 40. 50. 60.

(54) Hourly addition by fixed amount of 6g/hr Hourly addition by feeding amount of 6g/hr or 15g/hr 14 12. Ethanol (g/L). 10 8 6 4 2 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. Time (hr). (c) 圖 4-10 單一饋料和交替饋料的比較 (a)菌體歷時圖(b)葡萄糖消耗歷時圖 (c) 酒精歷時圖，溫度：28℃，發酵槽轉速：300 rpm，發酵槽進氣量：空氣 2vvm。. 43.

(55) 0.6. Hourly addition by fixed amount of 6g/hr Hourly addition by feeding amount of 6g/hr or 15g/hr. methionine (g/L). 0.4. 0.2. 0.0 0. 5. 10. 15. 20. 25. 30. Time (hr). (a) Hourly addition by fixed amount of 6g/hr Hourly addition by feeding amount of 6g/hr or 15g/hr. 0.5. 0.4. SAM (g/L). 0.3. 0.2. 0.1. 0.0 0. 10. 20. Time (hr). (b). 44. 30.

(56) Hourly addition by fixed amount of 6g/hr Hourly addition by feeding amount of 6g/hr or 15g/hr. 5. Cellular SAM content (%). 4. 3. 2. 1. 0 0. 10. 20. 30. Time (hr). (c) 圖 4-11 單一饋料和交替饋料的比較(a)甲硫胺酸消耗歷時圖(b) SAM 生成歷時圖 (c)菌體中 SAM 含量歷時圖，溫度：28℃，發酵槽轉速：300 rpm，發酵槽進氣量：空氣 2vvm. 0.6. 0.496. 0.5. 0.391. SAM (g/L). 0.4. 0.3. 0.267. 0.2. 0.1. 0.0. Hourly addition Hourly addition by 5L Fermentor feeding (without DO control) by fixed amount of amount 6g/hr or 15g/hr of 6g/hr. 圖 4-12 單一饋料：使用單一濃度葡萄糖饋料；交替饋料：使用兩種不同濃度葡萄糖交替饋料；對照組 SAM 最大值含量長條圖 45.

(57) 4-3-2 葡萄糖與甲硫胺酸同時饋入對 SAM 影響在 4-2 的實驗中得知，在發酵期間調整轉速可提升菌體代謝甲硫胺酸的速率，並且提高 SAM 的累積速率，再從 4-3-1 的實驗中得知，當菌體進入對數生長期時葡萄糖給予的量必須比 6g 高，故選擇使用葡萄糖每小時給予 9g，並且使用連續饋料之方式進行饋料。故後續實驗分為兩種方式，(1)當葡萄糖消耗完畢時，葡萄糖每小時給予 9g；甲硫胺酸消耗完畢時，甲硫胺酸以饋料方式添加 1.5g，轉速恆定為 300 rpm；(2) 當葡萄糖消耗完畢時，葡萄糖每小時給予 9g；甲硫胺酸消耗完畢時，甲硫胺酸以饋料之方式添加 1.5g，轉速在第 8 小時調整為 400 rpm。這兩種不同的操作方式，葡萄糖起始濃度皆為 20 g/L，酵母萃取粉為 5.5 g/L，甲硫胺酸濃度為 0.42 g/L，期望達到可同時提升菌體量和 SAM 之探討。由圖 4-13(a)可知，使用兩種不同方式做培養，轉速為 400 rpm，在第 28 小時至第 44 小時菌體量並無明顯變化，菌體量濃度為 39.4 g/L;而轉速 300 rpm，菌體量在第 27 小時菌體量不再上升，菌體量濃度約為 40.2 g/L。從圖 413(b)、4-13(c)、4-13(d)三張圖互相比較下，在兩種不同條件下，葡萄糖從第 9 小時開始每小時給予 9g 葡萄糖，則甲硫胺酸在消耗完畢時每次添加 1.5g，轉速 300 rpm，從第 6 小時緩慢累積酒精至第 54 小時，累積速率為 0.05 g/L-hr，菌體並沒有消耗酒精，菌體內的 ATP 不被消耗，故可得知每小時葡萄糖給予 9g ，對於菌體在對數成長期中是足夠且又不會過量，此時 SAM 累積速率為 0.06 g/L-hr (如圖 4-13(e)所示)。直到第 57 小時，菌體進入平穩期後，才開始累積酒精，此時 SAM 累積速率為 0.025 g/L-hr，與對數成長期時相比，累積速率下降 58.3%，甲硫胺酸直到第 72 小時，不再消耗完畢，故此時 SAM 的濃度也呈現平穩，不再持續累積；轉速為 400 rpm 的條件下，發酵槽系統中的酒精會在第 8 小時先被消耗而後在第 24 小時酒精持續累積，第 0 小時至第 20 46.

(58) 小時 SAM 累積速率為 0.63 g/L-hr，第 20 小時至第 32 小時 SAM 累積速率下降至 0.039 g/L-hr，與此時轉速 300 rpm 條件下，發酵系統中 SAM 的累積速率相比，下降 52%，第 32 小時之後 SAM 累積的濃度維持於 1.7 g/L，與此時條件為轉速 300 rpm，系統中 SAM 相比較(2.23 g/L)，SAM 濃度下降 25 %，若與條件為轉速 300 rpm，發酵槽中 SAM 最大值相比較(3.6 g/L)，SAM 濃度下降 38 %。菌體中 SAM 含量相比(圖 4-13(f)) 條件為轉速 300 rpm 最終達到 9.27 %，而轉速 400 rpm 條件下最終達 4.76 %，在轉速 300 rpm 的條件下提升 94.7 %。要得到最大 SAM 的濃度與菌體量、葡萄糖、酒精、甲硫胺酸這四個因素有關。若持續添加甲硫胺酸會造成菌體的抑制，所以需藉由提升菌體量的方式方可持續添加甲硫胺酸，而在提升菌體量中葡萄糖為主要碳源，添加葡萄糖的過程中不可使得酒精造成消耗，若造成酒精的消耗則會使 ATP 不足，造成 SAM 的生產下降。. 50. 300 rpm 400 rpm. DCW (g/L). 40. 30. 20. 10. 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. Time (hr). 47. 60. 70. 80.

(59) (a) 20. 300 rpm 400 rpm. 18 16. Glucose (g/L). 14 12 10 8 6 4 2 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. 70. 80. Time (hr). (b) 300 rpm 400 rpm. 18 16 14. Ethanol (g/L). 12 10 8 6 4 2 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. Time (hr). (c). 48. 60.

(60) 3.0. 300 rpm 400 rpm. 2.5. Methionine (g/L). 2.0. 1.5. 1.0. 0.5. 0.0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. Time (hr). (d) 300 rpm 400 rpm. 4. SAM (g/L). 3. 2. 1. 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. Time (hr). (e). 49. 60. 70. 80.

(61) Specific cellular SAM content (%). 10. 300 rpm 400 rpm. 8. 6. 4. 2. 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. Time (hr). (f) 圖 4-13 同時饋入葡萄糖和甲硫胺酸在不同的轉速下做培養的比較 (a)菌體歷時圖(b)葡萄糖消耗歷時圖(c)酒精歷時圖(d)甲硫胺酸消耗歷時圖(e) SAM 生成歷時圖(f)菌體中 SAM 含量歷時圖，溫度：28℃，300 rpm：全程轉速皆 300 rpm，400 rpm：起始轉速 300 rpm，第 8 小時將轉速調整為 400 rpm 直到結束，發酵槽進氣量：空氣 2vvm。. 50.

(62) 第五章結論經由上述所有實驗整理後所得表 5-1，在使用同時饋入葡萄糖和甲硫胺酸並且轉速恆定於 300 rpm 條件下，不論是 SAM 的累積濃度和菌體中 SAM 含量皆擁有最高的累積量，SAM 的累積濃度與對批次發酵槽中培養比提升 6.2 倍，菌體中 SAM 含量提升 33.6%，而 SAM 的累積數率達 0.06 g/L-hr，也是所有條件中最快，而此發酵過程中主要副產物酒精的代謝，並沒有造成整個發酵系統之影響。由以上可知，同時饋入葡萄糖和甲硫胺酸並且轉速恆定於 300 rpm，對於菌體代謝生產 SAM 是最為有效的饋料方式。表 5-1 不同條件下擁有最大值 DCW、SAM、菌體中 SAM 含量、消耗甲硫胺酸各項比較 DCW. SAM. Cellular SAM. methionine. (g/L). (g/L). content (%). (g). Shaking flask. 6.6. 0.37. 5.49. 0.042. 5L Fermentor. 7.2. 0.5. 6.53. 1.26. 56.6. 0.27. 3.65. 1.26. 49.1. 0.37. 3.55. 1.26. 39.4. 1.74. 4.76. 14.76. 40.2. 3.6. 8.72. 34.26. Hourly addition by fixed amount of 6g/hr Hourly addition by feeding amount of 6g/hr or 15g/hr Feeding glucose and methionine (400 rpm) Feeding glucose and methionine (300 rpm) 利用菌株突變後，再加上饋料批次程序的操作能有效提高發酵程序的產率和產物濃度。以 NO.40 菌株生產 SAM，有三種重要的影響因素：葡萄糖、 51.

(63) 甲硫胺酸和酒精。葡萄糖的初始濃度和饋料濃度與酒精有密不可分的關係，葡萄糖初始濃度為 20 g/L，若大於此濃度(40 g/L)，則 SAM 的產率會下降。饋料方式為，每小時給予系統 9 g，避免酒精的消耗，當酒精消耗則會降低 ATP 的生成量，而影響甲硫胺酸與 ATP 合成 SAM。甲硫胺酸為主要生產 SAM 的前驅物，而葡萄糖為主要菌體的代謝物，這兩樣物質適量的持續添加有助於得到最大 SAM 的產量。 SAM 的產量與適量的甲硫胺酸為正相關，當過量的甲硫胺酸會造成菌體的抑制，若對系統持續添加葡萄糖提升菌體量，可提升甲硫胺酸所添加的量。利用持續添加葡萄糖，並且控制酒精維持定濃度，使得酒精不被消耗，而持續添加甲硫胺酸，最終可得到最高 SAM 濃度為 3.6 g/L，與發酵槽(0.5 g/L)相比較提升 6.2 倍。. 52.

(64) 第六章未來展望利用發酵生產 SAM，在未來仍然還有很多問題繼續研究與討論： 1. 將所有基質使用連續式的饋料方式，並且克服酒精維持於一定的濃度，方能使得發酵更加有效率。 2. 如何有效控制系統中的酒精，提升 SAM 的生產力。 3. 在萃取菌體中 SAM 的方式中使用的是非食用酸，將來是否可換成可食用酸萃取菌體中 SAM，在未來工業上使用不同的酸萃取方式，將會關係於此產品在市面上的價格。. 53.

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