3-1 實驗材料
3-1-1 實驗用水
為減少實驗干擾，本研究實驗藥品的配製以及實驗中所使用的去離子 水皆先經逆滲透、活性碳吸附及 UV 照射系統處理過 (ELGA, Ultra-pure water system)，再經滅菌釜 (REXALL, LS-2D) 於 121ºC、20 psi 條件下溼熱 滅菌 20 分鐘。
3-1-2 主要基質
本研究以甲苯 (MERCK, GR grade) 作為 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 之主要生長基質，以好氧共代謝的方式探討對於目標污染物三氯乙烯的降 解效率影響。使用前先以無菌水配製成約 400 mg/L 之儲備溶液，並置於 4ºC 冰箱冷藏備用。
3-1-4 無機營養鹽
微生物生長除需水、適當的電子提供者及能量碳源外，尚需氮、磷及 微量元素以供微生物細胞之合成及酵素作用。添加適當營養鹽能刺激微生 物族群生長和提升代謝作用，進而提高復育效果。一般而言，氮、磷為微 生物在自然狀況下容易缺乏的營養元素，通常建議生物生長所需之 C:N:P 為 100:10:1。本研究使用之無機營養鹽成分及濃度如表 3-1。其中硫酸銨 ((NH4)2SO4)、硫酸鎂 (MgSO4･7H2O)、硫酸鈣 (CaSO4･2H2O)、硫酸鐵 (FeSO4･7H2O)、硫酸鋅 (ZnSO4･7H2O)、硫酸錳(MnSO4･H2O)及硫酸銅 (CuSO4･5H2O)等供作微量元素，磷酸氫二鉀 (K2HPO4) 及磷酸氫二鈉 (Na2HPO4) 除提供微生物生長所需之磷、鉀及鈉外，亦對培養液具緩衝作 用。以上化學試藥皆為德國 MERCK 公司的產品。
3-1-5 瓊脂平板培養基
本研究使用Nutrient Broth 瓊脂平板培養基進行 HYL-QT1(Ralstonia sp.
P-10) 菌數之測定及繼代培養。NB 瓊脂平板培養基配製方式為：取 6.5 g Nutrient Broth(HIMEDIA, 成份如表 3-2) 和 7.0 g Agar powder(HIMEDIA,
表 3-1 無機營養鹽成分及濃度
Component Concentration（mg/L）
(NH4)2SO4 4.7
K2HPO4 1.23
Na2HPO4 3.57
MgSO4･7H2O 0.62 CaSO4･2H2O 0.0031 FeSO4･7H2O 0.0062 ZnSO4･7H2O 0.0062 MnSO4･H2O 0.0031 CuSO4･5H2O 0.0062 Na2MoO4･2H2O 0.0062
表 3-2 Nutrient Broth 營養鹽成分
Ingredients Concentration(g/L) Peptic digest of animal tissue 5.00
Yeast extract 1.50
3-2 分析方法與設備
3-2-1 甲苯及三氯乙烯的分析
本研究參考行政院環境保護署所公告之水 中 揮 發 性 有 機 化 合 物 檢測 方 法 (NIEA W785.53B, 2003)，利用氣相層析質譜儀 (Gas Chromatograph Mass)，配合吹氣捕捉濃縮系統 (Purge and Trap Concentration) 分析水樣中 甲苯及三氯乙烯等揮發性有機物濃度。根據甲苯及三氯乙烯初始及殘留濃 度的變化量可了解生物共代謝情形。吹氣捕捉濃縮裝置及氣相層析質譜儀 之操作條件分述如下：
一. 吹氣捕捉濃縮系統 (Purge and Trap Concentration, TECKMAR) (1) 吹氣捕捉濃縮系統型號：Teckmar Velocity XPT
(2) 氣體捕捉管型號：Teckmar Purge Trap K (3) 使用氣體及壓力：高純氮 (Nitrogen)，70 psi (4) 吹氣時間及流量：11 min，36 mL/min
(5) 脫附時間、溫度及流量：4 min，260ºC，300 mL/min (6) 傳輸管溫度：150ºC
(3) 使用氣體：高純氦 (Helium)
(4) 氦氣壓力及流量：4.24 psi，25 mL/min (5) 注射口溫度及分流比：265ºC，25:1
(6) 氣象層析管柱型號：Hp 624(60 m × 0.32 mm × 1.8 µm) (7) 管柱升溫程式
初溫及持溫時間：40ºC，5 min 升溫速度：8ºC/min
末溫及持溫時間：180ºC，11 min 總共所需時間：33.5 min
(8) 揮 發性有 機物 滯留時間及儀器偵測極限 甲苯：17.02 min，1.1 μg/L
三氯乙烯：14.78 min，2.6 μg/L
3-2-2 溶氧測定
本 研 究 使 用 溶 氧 電 極 量 測 甲 苯 共 代 謝 三 氯 乙 烯 過 程 中 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 的耗氧量，藉以評估甲苯經生物降解的需氧 量。儀器機型為 YSI, 5100。
3-2-3 酸鹼值測定
本 研 究 使 用 酸 鹼 值 測 定 儀 量 測 樣 品 溶 液 之 酸 鹼 度 ， 藉 以 確 認 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 於 中 性 環 境 下 成 長 。 儀 器 機 型 為 WTW, pH/Codi 340i。
3-2-4 OD 605測定
本研究使用分光光度計量測 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 在單一可見 光波長 605 nm 下菌液的吸光度，藉由菌液及空白水樣所吸收光度差異，可 測定出實驗過程中微生態系內細胞量之吸光值變化。儀器機型為 MERCK, Spectroquant NOVA 60。
50 µL 稀釋濃度水樣以無菌三角彎棒均勻塗抹於 NB 瓊脂平板培養基表 面。倒置瓊脂平板培養基於 36ºC 恆溫培養箱中，48 小時後計數瓊脂平板 培養基中所產生的菌落數。將稀釋倍數乘以菌落數介於 30 ~ 300 之間者，
以推算水中總菌落數。菌落數以 CFU/mL(Colony Forming Units/mL) 表示 之。
3-3 試驗菌種
3-3-1 菌種來源及保存
本研究使用成大資源工程系 郭明錦老師實驗室由甲苯生物處理系統 純化分離出的菌株 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 為實驗菌種來源 (Han et al., 2007)。分離菌株 Ralstonia sp. P-10 保存於 20% 的甘油中，並於 -20oC 下進行冷凍保存。
3-3-2 菌種活化及增殖馴養
在實驗進行前以接種環沾取儲存於 20% 甘油中的菌株，利用劃碟法於 NB 瓊脂平板培養基上進行單一菌株的再純化及活化。菌株活化之後，為了 避免菌株養分不足、阻礙生長，每隔 3 ~ 4 天於新鮮的瓊脂平板培養基上 以劃碟的方式進行菌種繼代培養。
為了取得大量菌體供純菌批次試驗的進行，以接種環將活化後的菌落 加入以高度純氧曝氣至溶氧飽和 (DO ≈ 32 mg/L) 的無機營養鹽中，室溫下 以甲苯 (≈ 10 mg/L) 作為唯一碳源，進行甲苯分解菌的增殖培養。在裝有 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 菌懸液的血清瓶底部以攪拌裝置使菌體維持
O2
2.3 L血清瓶
無機營養鹽
甲苯 (≈10 mg/L)
室溫震盪 馴養7天
洋菜培養基
(≈ 25 ºC,150 rpm)
置換新鮮無機營養鹽 再曝氣至飽和 (DO ≈ 32 mg/L)
O2 甲苯
室溫震盪 馴養7天 (≈ 25 ºC,150 rpm)
3-4 甲苯分解菌好氧共代謝三氯乙烯批次培養試驗
為了評估 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 以甲苯為主要基質好氧共代謝 降解三氯乙烯的功能性。將增殖培養 14 天的 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 菌懸液以純氧曝氣至溶氧飽和 (≈ 32 mg/L)後，分裝至 126 mL 的褐色樣品 瓶中，並以含鐵氟龍墊片之瓶蓋將樣品瓶鎖緊。為避免甲苯基質毒性的產 生，3000 μL 的甲苯儲備溶液 (400 mg/L) 於 12 小時內分三次注入。換言 之。有 3 × 1000 μL 的 400 mg/L 甲苯儲備溶液注入每罐微生態系，每次 注入後，微生態系內的甲苯濃度約為 3.3 mg/L。450 μL 的三氯乙烯儲備溶 液 (131.79 mg/L) 與注入第一針甲苯時一同注入。實驗設計如表 3-3 所 示。為確保菌種存在的單一性，避免外界雜菌的汙染，所有的試驗器材皆 經過滅菌，且在無菌操作檯上進行。視樣品瓶為微生態系 (microcosm)。批 次培養試驗中甲苯添加試驗組詳細操作步驟見圖 3-2。
本部分研究以兩組不同的批次試驗於室溫下 (≈ 25ºC, 150 rpm) 進行。
其 中 一 組 批 次 試 驗 在 進 行 7 天 的 單 一 培 養 期 程 後 ， 分 析 植 入 菌 株 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 的三重複微生態系中甲苯及三氯乙烯殘餘濃
烯 的 生 物 降 解 反 應 動 力 參 數 。 為 了 確 認 微 生 態 系 三 氯 乙 烯 的 減 少 為 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 好氧共代謝所致，在進行批次試驗的同時，亦 進行不添加甲苯的控制組。另進行一組以無菌水添加濃度約 500 µg/L 的甲 苯及三氯乙烯，評估整個試驗過程中因洩漏造成的損失。洩漏組甲苯的濃 度低於試驗組是為了避免濃度超過儀器偵測極限。
表 3-3 批次試驗實驗操作設計
Batch test Microcosms Conditions
Toluene-fed microcosmes
HYL-QT1 3 × 1000 µL toluene
1 × 450 µL TCE
Non-toluene fed microcosmes HYL-QT1 1 × 450 µL TCE
Leakage Controls
Sterilized water 1 × 450 µL TCE 1 × 160 µL toluenea
O2
將菌懸液分裝至 126 mL 褐色樣品瓶
甲苯及三氯乙烯 甲苯 甲苯
(DO ≈ 32 mg/L)
6 小時 6 小時
3-5 甲苯基質多次注入試驗
甲苯基質多次注入試驗之目的在以不同的注入次數及注入體積，將相 等質量的甲苯注入 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 的微生態系內，探討甲苯 存在有效反應時間對三氯乙烯生物降解效率的影響。HYL-QT1(Ralstonia sp.
P-10) 增殖培養的操作步驟如 3-3-2 節所示。甲苯基質多次注入試驗共分為 四組，各組以不同的甲苯注入次數及注入體積於恆溫培養箱中 (≈ 25ºC, 150 rpm) 進行 5 天的單一培養期程。各組別的實驗設計詳見表 3-4 及流程圖如 3-3、3-4 及 3-5 所示。
於 126 mL 的微生態系內，甲苯儲備溶液 (約 400 mg/L) 總注入體積為 3000 µL，總注入質量為 1.2 mg，微生態系內甲苯濃度約為 10 mg/L。以 A 組而言，在實驗開始時，即以一針注入 3000 µL 的甲苯儲備溶液於微生態 系中 (1 × 3000 µL 的 400 mg/L 甲苯儲備溶液 )；B 組則在 12 小時內分 3 次 注入 (3 × 1000 µL 的 400 mg/L 甲苯儲備溶液 )；C 組在 2 天內分 6 次注入 (6
× 500 µL 的 400 mg/L 甲苯儲備溶液 )；D 組在 3 天內分 9 次注入 (6 × 350 µL, 3 ×300 µL 的 400 mg/L 甲苯儲備溶液 )。450 µL 的三氯乙烯儲備溶液
降解的效率影響之外，另外在 B 組及 D 組的試驗分別注入的次數為三針及 九針，在 100 小時內分析微生態系中溶氧、酸鹼值、OD605、甲苯及三氯乙 烯濃度變化，評估 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 好氧共代謝三氯乙烯生物 降解影響因子的變化及一階反應動力速率參數。
表 3-4 甲苯基質多次注入實驗操作設計
Toluene-injection schedules
A B C D
Day 1 1 × 3000 µL 3 × 1000 µL 3 × 500 µL 3 × 350 µL Day 2 3 ×500 µL 3 × 350 µL
Day 3 3 × 300 µL