Ralstonia sp. P-10以甲苯為主要基質好氧共代謝降解三氯乙烯之研究

國 立 交 通 大 學

環 境 工 程 研 究 所

碩 士 論 文

Ralstonia sp. P-10 以甲苯為主要基質好氧共代謝降解三氯

乙烯之研究

Aerobic Cometabolism of Trichloroethylene by Ralstonia

sp. P-10 using Toluene as the Primary Substrate

研 究 生：郭 彥 汝

Ralstonia sp. P-10 以甲苯為主要基質好氧共代謝降解三氯

乙烯之研究

Aerobic Cometabolism of Trichloroethylene by Ralstonia

sp. P-10 using Toluene as the Primary Substrate

研 究 生：郭彥汝 Student：Yen-Ru Kuo 指導教授：林志高 博士 Adviser：Dr. Jih-Gaw Lin 郭明錦 博士 Dr. M.C. Tom Kuo

國 立 交 通 大 學

環境工程研究所

碩士論文

A Thesis

Submitted to Institute of Environmental Engineering College of Engineering

National Chiao Tung University In Partial Fulfillment of the Requirements

Ralstonia sp. P-10 以甲苯為主要基質好氧共代謝降解三氯乙烯之

研究

研究生：郭彥汝 指導教授：林志高 博士 郭明錦 博士 國立交通大學環境工程研究所 摘 要 本研究針對 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 進行批次試驗，主要目的為 驗證 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 以甲苯為主要基質好氧共代謝三氯乙烯 之功能性，及求取生物降解三氯乙烯的一階反應動力參數。經過七天的培 養，微生態系中 7.7 mg/L 甲苯的移除率達 100%；同時，由添加甲苯試驗組 與未添加甲苯試驗組三氯乙烯移除率 13% 的差異證實 HYL-QT1 能以甲 苯為主要基質好氧共代謝三氯乙烯。此外，根據三氯乙烯一階反應動力試 驗結果顯示 HYL-QT1 好氧共代謝三氯乙烯的一階反應速率常數範圍在 0.16 ± 0.05/day。 經甲苯基質多次注入試驗結果證實，當甲苯存在於微生態系的有效反

Aerobic Cometabolism of Trichloroethylene by Ralstonia sp. P-10 using Toluene as the Primary Substrate

Student : Yen Ru Kuo Advisors : Dr. Jin Gaw Lin Dr. M.C. Tom Kuo Institute of Environmental Engineering

National Chiao Tung University ABSTRACT

The aims of this study were to confirm the function of aerobic co-metabolism of trichloroethylene(TCE) by Ralstonia sp. P-10 using toluene as primary substrate and to estimate the first-order rate coefficient of TCE cometabolic biodegradation. After a batch experiment, the toluene removal efficiency was up to 100%, and the TCE removal efficiency was 13%. The 13% TCE removal efficiency proved Ralstonia sp. P-10 could cometabolize biodegrade TCE in the presence of toluene. The first-order rate coefficient of TCE cometabolic biodegradation was 0.16 ± 0.05/day.

致 謝

這份論文能夠順利的完成，感謝恩師成功大學資源系 郭明錦老師給予 我最學業上最細心的指導，老師不管是在生活態度及研究精神都讓我受益 良多。同時，也要感謝指導教授 林志高老師在我身體不適需要接收治療的 時候也不放棄我，甚至在研究上給予大力的支持。口試期間，承蒙成功大 學生命科學系 曾怡禎老師，高雄第一科大 陳勝一老師撥冗指導論文，提 供寶貴意見，方能使這份論文更加完整。 學生生涯即將告一個段落，謝謝所有交大環工所的教授、學長姐、同 學及學弟妹的這一年多來陪伴及鼓勵。更要感謝的是成大資源系 郭明錦老 師實驗室的所有好朋友：氣質出眾、身材高挑可人又親切的龍龍，如果沒 有你，我ㄧ定無法順利完成碩論；桂花鄉刺青主婦鄭姐，每天跟你在實驗 室讓我心智年齡有不同的成長；資源一姐小忞，相識六年謝謝你一直照顧 我；娘砲團團長湯姆衛，謝謝你替大家出頭；陽光男兒閎森學長、胸圍傲 人愷軍學長及末代好人哥逸群學長，謝謝你們給予的幫忙及支持。

目 錄

中文摘要---I 英文摘要---II 致謝---III 目錄---IV 表目錄---VIII 圖目錄---IX 第一章 前言---1 1-1 研究目的---1 1-2 研究流程---3 第二章 文獻回顧---4 2-1 地下水及土壤主要污染物物---4 2-1-1 地下水污染---4 2-1-2 土壤污染---7 2-2 甲苯及三氯乙烯之污染特性---10

2-2-5 國內外相關法規規範---19 2-3 生物復育技術---21 2-4 三氯乙烯之生物降解---23 2-4-1 三氯乙烯生物厭氧處理---23 2-4-2 三氯乙烯生物好氧處理---25 2-5 基質競爭效應---28 2-6 三氯乙烯對微生物之毒性---31 2-7 甲苯分解菌共代謝三氯乙烯機制---33 第三章 實驗材料與分析方法---37 3-1 實驗材料---37 3-1-1 實驗用水---37 3-1-2 主要基質---37 3-1-3 目標污染物---37 3-1-4 無機營養鹽---38

3-2-4 OD 605測定---42 3-2-5 菌落數分析---42 3-3 試驗菌種---44 3-3-1 菌種來源及保存---44 3-3-2 菌種活化及增殖馴養---44 3-4 甲苯分解菌好氧共代謝三氯乙烯批次培養試驗---46 3-5 甲苯基質多次注入試驗---49 第四章 結果與討論---55 4-1 甲苯生物降解需氧量---55 4-2 純菌 HYL-QT1 共代謝三氯乙烯批次試驗---57 4-3 批次試驗生物降解動力探討---59 4-3-1 三氯乙烯生物降解效率---59 4-3-2 溶氧量及 OD 605變化---65 4-3-3 菌落數及菌相變化---67 4-3-4 酸鹼值變化---67

4-5-3 酸鹼值變化比較---78 4-5-4 OD 605及菌落數變化比較---79 第五章 結論與建議---82 5-1 結論---82 5-2 建議---84 參考文獻

表 目 錄

表 2-1 國內有機污染物污染案件---6 表 2-2 甲苯之基本特性---11 表 2-3 甲苯對人體健康的危害效應---13 表 2-4 三氯乙烯之基本特性---15 表 2-5 三氯乙烯之產生源及污染途徑---16 表 2-6 三氯乙烯對人體健康的危害效應---18 表 2-7 國內環保署公告地下水管制標準---20 表 2-8 甲苯分解菌生物降解三氯乙烯反應動力參數整理---30 表 2-9 甲苯好氧分解菌代謝途徑及產物整理---36 表 3-1 無機營養鹽成分及濃度---39 表 3-2 Nutrient Broth 營養鹽成分---39 表 3-3 批次試驗實驗操作設計---47 表 3-4 甲苯基質多次注入實驗操作設計---51 表 4-1 甲苯分解菌 HYL-QT1 好氧共代謝三氯乙烯批次試驗結果---58

圖 目 錄

圖 1-1 研究流程圖---3 圖 2-1 土壤污染來源---9 圖 2-2 四氯乙烯還原性脫氯反應轉換成二氧化碳的可能途徑---24 圖 2-3 不同甲苯分解菌的好氧代謝途徑---35 圖 3-1 純菌 HYL-QT1 活化及馴養步驟---45 圖 3-2 純菌 HYL-QT1 以甲苯為主要基質好氧共代謝三氯乙烯流程圖 ---48 圖 3-3 甲苯基質多次注入 A 組及 B 組實驗設計流程圖---52 圖 3-4 甲苯基質多次注入 C 組實驗設計流程圖---53 圖 3-5 甲苯基質多次注入 D 組實驗設計流程圖---54 圖 4-1 批次試驗中 HYL-QT1 微生態系內甲苯及三氯乙烯殘餘濃度隨時間的 變化---61 圖 4-2 擬合之三氯乙烯一階反應速率常數---64 圖 4-3 批次試驗中 HYL-QT1 微生態系中的甲苯殘餘濃度、溶氧量及 OD 605

化---75

圖 4-8 甲苯基質多次注入試驗中溶氧消耗量的比較---77

圖 4-9 甲苯基質多次注入試驗中酸鹼值變化的比較---78

圖 4-10 甲苯基質多次注入試驗中 OD 605變化的比較---80

第一章 前言

1-1 研究目的

含氯脂肪族碳氫化合物(如三氯乙烯、四氯乙烯等)具有低可燃性、低沸 點、高溶解力、高蒸氣壓密度、可爆性及化學安定性等特殊的物化特性， 並廣泛應用在電子清洗業、工業上脫脂程序及乾洗業等製程當中，常因不 當的處置、意外洩漏或惡意的排放，造成土壤及地下水的嚴重持久性污染

(Yang and McCarty, 2000; Rivett et al., 2001)。台灣工業區土壤及地下水質污 染調查工作顯示三氯乙烯為常見地下水有機污染物 (Kuo et al., 2000)。

受三氯乙烯污染的地下水整治技術有許多，如氣提法 (air sparging)

(Rabideau et al., 1999)、化學氧化法 (chemical oxidation) (Schroth et al., 2001)、及生物降解法 (biodegradation) (McCarty et al., 1998; Kuo et al., 2004)。由於以物理或化學方法處理，通常只是污染相的轉移，並非對 污染物完全的破壞，且成本較高。因此具有將污染物減毒或去毒，整治 後尚能維持污染場址原有用途，以及經濟效益較佳等優點的生物處理法，

Han et al. (2007) 在實驗室以半連續培養泥漿法 (Semicontinuous slurry method) 進行甲苯好氧共代謝三氯乙烯試驗，並透過微生物 16S rDNA 序列 分析鑑定穩態操做條件下半連續生物處理系統中的甲苯分解菌。根據 16S

rDNA 序 列 比 對 的 結 果 顯 示 生 物 處 理 系 統 中 的 甲 苯 分 解 菌 分 別 為 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 及 HYL-QT2 (Pseudomonas putida)。根據文獻 指 出 HYL-QT2(Pseudomonas putida) 為 具 有 分 解 甲 苯 能 力 的 菌 種 。 而

Ralstonia sp. 種的菌群在文獻上指出為具有分解酚能力的菌種，其主要以酚

為基質好氧共代謝降解三氯乙烯。(Nakamura et al., 2000; Futamata et al.,

2001)；Futamata et al, (2001) 更以菌株 Ralstonia sp. P-10 進行酚好氧共代 謝三氯乙烯動力參數的研究。 本 研 究 的 目 的 是 藉 以 甲 苯 為 主 要 基 質 ， 以 批 次 試 驗 探 討 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 好氧共代謝三氯乙烯之功能性及降解動力。根 據降解動力試驗結果，本研究更進一步執行甲苯基質多次注入試驗，探討 甲苯存在於生物處理系統的有效反應時間對三氯乙烯生物降解效率的影 響。

第二章 文獻回顧

2-1 地下水及土壤主要污染物

2-1-1 地下水污染 地下水儲蓄於地表下的含水層 (aquifer)。我國含水層總面積約 10,330 平方公里。地下水年使用量約 71 億立方公尺，佔總用水量的 40.6%。地下 水為我國農、工、民生用水重要來源，尤其為枯水期或乾旱期的補充水源。 隨著人口增加，農業轉型、工業發展、氣候變化，許多含水層已遭到不同 污染物質侵入，造成地下水質惡化，不僅減少珍貴的水資源，也形成環境 保護工作的負擔與隱憂。 含水層為透水、儲水性能佳的地層，如砂質層或砂岩層。含水層本身 沒有造水功能，它所孕藏的地下水來自地表水。地表水經由含水層的補注 源進入地層後儲於其中而成地下水。當非含水層原有的物質滲入含水層後 即有可能造成地下水污染：如農業施肥、噴灑殺蟲劑後殘留的肥料或殺蟲 劑隨雨水或灌溉水的入滲現象達到地下水源，石化、電子等工廠的有機油

多氯聯苯 (PCB) 等，而無機污染物一般多為重金屬，如汞、砷、鉛等。1997 年美國超級基金 (Superfund) 編列得眾多污染場址當中，以含氯有機污染物 為主要處理對象，而其中三氯乙烯的汙染場址有 336 個為首要處理污染物， 其次為四氯乙烯有 170 個場址，其餘的為多氯聯苯、二氯乙烯、氯乙烯分 佔 100 多個場址。由污染場址整治數目可之三氯乙烯為美國地下水最主要 之污染物，其中間產物二氯乙烯、氯乙烯，也同樣受到重視。 目前我國較為矚目的地下水污染及土壤案例如表 2-1，包括：桃園縣境 內美商無線電廠址的地下水中已發現相當濃度的含氯有機溶劑，三氯乙烯 (TCE)。三氯乙烯為電子工業、化學製造業所大量使用的除脂清洗劑。因有 致癌性，所以三氯乙烯污染問題對環境、健康的衝擊相當地大。中國石油 公司高雄煉油廠管線破裂漏出燃油，污染農地面積達十數公頃。雖已做緊 急回收漏油處理，是否對地下水造成污染有待觀察。此外高雄中油總廠燃 油污染，台南安順中石化工廠的五氯酚污染，桃園東北亞化工廠的酚類污 染都為較著名的案例。

表 2-1 國內有機污染物污染案件 (行政院環境保護署, 2007 ) 場址 縣市別 發現 時間 污染物 目前狀況 台灣美國無線電 公司 (RCA) 原桃園廠 桃園縣 八德市 83.6.3 三氯乙烯 四氯乙烯 1. 受影響地區接裝自來水 2. 土壤污染區已完成整治 3. 地下水部分正整治中 台灣美國無線電 公司 (RCA) 原竹北廠 新竹縣 竹北市 83.6.3 三氯乙烯 四氯乙烯 1. 受影響地區接裝自來水 2. 污染濃度低 台灣氯乙烯公司 頭份廠 苗栗縣 頭份鎮 82.7 二氯乙烷 氯乙烯 1.受影響地區接裝自來水 2.土壤嚴重區部份已挖除處理 3.地下水在廠區內設置井抽取處 理 中國石油化學工 業開發公司安順 廠 台南市 安南區 78 五氯酚、汞(可能 還有戴奧辛) 1. 緊鄰污染區之漁塭停養 2. 土壤污染嚴重區挖除處理 3. 地下水抽取處理，污染濃度已 下降 中國石油公司高 雄煉油廠 高雄市 左營區 82 汽油 航空燃料油 柴油 繼續抽取回收浮油 中國石油公司苓 雅區 高雄市 苓雅區 78.6 汽油 航空燃料油 1. 浮油抽取回收工作已完成 2. 進行土壤現地生物處理 東北亞公司 桃園縣 楊梅鎮 86 酚類 由桃園縣環保局委託元智大學處 理完成 統一精工小北 加油站 台南市 95 苯、甲苯、三氯 乙烯 民國95 年列為控制場址 中國石油公司 後勁月 1. 已列入控制場址

2-1-2 土壤污染 土壤是由礦物固體、有機物、水分及空氣所組成，為固相、液相及氣 相三相共存之結構。土壤除了供應植物生長所需之養份和水分外，也提供 了動物和人類活動場所，它具有過濾、吸附、氧化、還原、溶解、沉澱和 轉化外界輸入物質的能力，以維持整個生態的平衡。 土壤污染是指任何物質特別是由人類所產生的廢水、廢棄物及廢氣介 入土壤，導致土壤喪失原有的忍受力及自淨能力，以致農作物生長不良、 破壞生態環境以及危害到人類的健康之現象產生。土壤污染雖不像空氣或 水會直接影響人體，但土壤供給食用作物生長，一旦遭受污染，輕則影響農 作物的品質，重則在農作物內累積有害物質，經食物鏈被人、畜攝取，長 期食用會影響人類健康，其潛在之危害將不容忽視。 一般而言，土壤污染來源包括都市廢棄物、家庭污水、事業廢水、事 業廢棄物、畜牧廢棄物、落塵、酸雨及可溶性鹽類等，如圖 2-1 所示 (鄭 顯榮、吳文娟，1990)；其中以事業廢水及廢棄物不當處置、地下輸油管線

一、 工業污染方面 工業化學產品在生產、使用過程中均可造成土壤污染，如生產原料、 產品、廢棄物、廢水及廢氣等未經處理或處理完善，及任意傾倒或排 放造成。此外，加油站、軍事基地、工廠地下儲存槽的滲漏及輸送管 線的洩露亦是污染來源。 二、 農業使用方面 農業污染方面包括農業上大量使用肥料和農藥、畜牧的排泄廢棄物及 洗潔污水。 三、 都市和家庭生活方面 包括廚房、衛浴所排出的廢水，及餐廳和旅館等服務業之廢棄物。根 據調查都市與家庭生活廢棄的垃圾，其中有八成是有機廢棄物。

人、畜

農作物

土壤

畜殖廢棄物

農業資材

事業廢水及

市鎮污水

事業廢氣

落塵、落酸

廢棄物

可溶性鹽類

地下水

一般水體

2-2

甲苯及

三氯乙烯之污染特性

2-2-1 甲苯的物化特性及用途 本研究中所使用的主要基質甲苯是一種無色液體，溶於乙醇、苯及乙 醚，不溶於水，由焦油中分餾而獲得。被普遍應用於化學工業、橡膠業及 製藥工業等，作為染料製造、有機化合物合成、人造皮、凡士林、醫藥用 品、石蠟、樹脂等物品製程之溶劑，此外，甲苯也可用來製造油漆、橡皮、 清潔劑、黏著劑等，其基本物理化學特性詳列於表 2-2。 由表 2-2 可知，甲苯具有密度小、低溶解性與高揮發性的特性，在工 業上的應用十分廣泛，所以在製程中甲苯廢氣的洩漏是其主要的污染來 源，其次，各地加油站地下儲槽洩漏的油氣、都市污水處理廠處理過程中 揮發性有機物的逸散，以及受揮發性有機物污染的地下水及土壤，於進行 復育工作時的揮發，皆會產生甲苯廢氣，進而污染我們的生活環境及危害 人體的健康。

表 2-2 甲苯之基本特性 (行政院環保署, 1996) 名稱 甲苯 (Toluene) 同義名稱 Methylbenzene、Methylbenzol、Phenylmethane 辨識 資料 化學式 C6H5CH3 分子量 92.14 沸點 110.6oC 熔點 -95 oC 外觀 澄清無色 氣味 芳香族的特性味道 蒸氣密度(空氣=1) 3.1 蒸氣壓 22mmHg (20 oC) 比重(水=1) 0.86 (20 oC) 水中溶解度 54~58 mg / 100 mL 物理 及化 學特 性

Henry 常數(atm‧m3/mol) 6.68 × 10-3 ( at 25℃)

安定性 空氣中穩定 在光及溼氣下會慢慢分解 反應 特性 不相容物 1.強酸：會起激烈的放熱反應 2.過氯酸鹽：形成爆炸性的混和物 3.強氧化劑：增加火災和爆炸的危險 4.二氯化硫：激烈反應，鐵和氯化鐵會加速反應

2-2-2 甲苯的環境危害性 由於甲苯的揮發性很高，一經排放即會揮發至大氣，造成空氣污染， 美國環境保護署即將其列為優先管制的 31 種揮發性有機物之一 (Den, 1998)，此外，我國環保署亦將甲苯列為優先調查之 30種有害空氣污染物名 單的第七位，此顯示其重要性。另外，美國環保署估計，美國都市污水處 理廠每年排放 11000 噸的有害空氣污染物，其中甲苯氣體排放的濃度約 26-40 ppbv (Den, 1997；Webster et al., 1996)。又研究指出 (Quigley et al., 1995)，下水道系統亦會有甲苯的排放，曾測得單一人孔的最大排放量 100 g/hr，而根據國內的研究顯示，台灣目前公民營的加油站已超過 1200 家， 推估每年從加油站逸散的揮發性有機物總量約 20000 萬噸，而甲苯是其中 主要的污染物，以上這些甲苯氣體若不能確實處理，對附近的居住環境及 自然生態即會造成不小的衝擊。 此外，甲苯是一種麻醉劑，當人體吸入之後所產生的急性症狀是有醉 意、興奮及暈眩、頭痛、噁心，若曝露於高濃度甲苯氣體的環境下，甚至 會引起昏迷、死亡。長時間曝露於含低濃度甲苯氣體的環境中，也會引起

表 2-3 甲苯對人體健康的危害效應 (行政院環保署, 1996) 吸入 1.在 50~100 ppm 下，其蒸氣會刺激鼻及咽喉和呼吸到 2.在 100~500 ppm 下，造成暈眩、頭痛、噁心及過度疲勞 3.高濃度下(約 1000 ppm)下，導致無意識和死亡；嚴重暴露可能引 起腎衰竭 皮膚接 觸 與液體接觸過久可能會造成嚴重的刺激和皮膚炎(皮膚紅、乾) 眼睛接 觸 1.其蒸氣會刺激眼睛 2.其液體會造成角膜損害但可復原 急性 食入 可能造成嘔吐、腹瀉、心臟衰竭、肺出血、神經系統損害及失明。 健 康 危 害 效 應 慢性 1.長期暴露會造成肝損害及行為問題 2.長期暴露引響聽力 3.暴露於 200 ppm 濃度以下，無明顯腎臟受損；500 ppm 以下無肝臟受損 暴露之徵兆 及症狀 鼻子、喉嚨、呼吸道、眼睛刺激、昏睡、暈眩、頭痛、噁心、失去意識、 顫抖、視覺異常、皮膚炎。精神混亂

2-2-3 三氯乙烯的物化特性及用途

本 研 究 的 目 標 污 染 物 三 氯 乙 烯 (TCE) 屬 於 含 氯 脂 肪 族 化 合 物

(Chlorinated Aliphatic Hydrocarbons, CAHs)，其基本物理化學特性如表 2-4 所示 (U.S.EPA, 2000)。三氯乙烯為一揮發性有機化合物 (VOCs)，密度為 1.46 g/cm3 (20ºC) 為比重比水重的非水相液體，因此又被定義為 DNAPLs (Dense Non-Aqueous Phase Liquids)。三氯乙烯在大氣中因光氧化作用故半 衰期甚短，約為 1 天左右，若在水體中，半衰期可長達 300 天 (Zylstra et

al., 1989; Schaumburg, 1990)。所以當其存在於土壤或地下水時，容易造成

土壤及地下水的永久性污染 (Yang and McCarty, 2000)。

由於三氯乙烯具有水溶解度低、低可燃或可爆性、高蒸氣密度、化學 安定性、低沸點及高蒸氣壓等特殊性質，所以被用來替代碳氫化合物，廣 泛地應用於工業用途，包括電子業、乾洗業、化學製造業和鋼鐵業之清洗 劑；脫脂、樹脂和塑膠類溶劑；石化工業和煉油工業之有機物萃取溶劑以 及金屬表面處理劑等 (盧滄海和賴龍山，1989；林建芬，1994)。三氯乙烯 主要的產生源及主要汙染途徑如表 2-5 所示 (行政院環保署，2000)。

表2-4 三氯乙烯之基本特性(行政院環保署，1996) 名稱 三氯乙烯(Trichloroethylene) 同義名稱 Ethylene Trichloride、Trichloroethylene 辨識 資料 化學式 Cl2=CHCl 分子量 131.4 沸點 87.2 oC 熔點 -73 oC 外觀 澄清 氣味 似氯仿的味道 蒸氣密度(空氣=1) 4.54 蒸氣壓 57.8mmHg(20 oC) 比重(水=1) 1.4649(20 oC /4 oC) 水中溶解度 100mg/L at 25 oC 物理 及化 學特 性

Henry 常數(atm‧m3/mol) 1.17×10-3( at 25℃)

安定性 空氣中穩定 在光及溼氣下會慢慢分解 反應 特性 不相容物 1 鋁粉：極小量酸存在時會劇烈反應 2.顆粒狀的鋇或鎂：劇烈反應 3.強氧化劑(如過氧化物、過氯酸鹽)：可能劇烈反 應 4.強鹼：可能形成可燃性氣體二氯乙炔

表2-5 三氯乙烯之產生源及污染途徑 (行政環境保護署土壤污染評估技術 規範之研究計畫, 2000) 事業別 產生源 污染途徑 石油化學原料業 製造二氯乙烯之蒸餾 重餾份、製造氯乙烯 單體之氯乙烯蒸餾重 餾份、製造氯乙烷之 分餾塔重餾份 管線及儲槽洩漏 其他電子零組件業 廢溶劑、IC 電路板/ 電阻/半導體清洗液 儲槽洩漏、置放洩漏 電子管業、電線及電 纜業、發輸配電機械 業 馬達清洗之廢溶劑、 錄放影機、電視、冰 箱製造之廢溶劑 儲槽洩漏、置放洩漏 三氯乙烯 合成樹脂及橡膠業 典型合成樹脂之縮合 與加成聚合殘留原料 或自槽體、管線、閥 洩漏之原料 管線及儲槽洩漏

2-2-4 三氯乙烯的環境危害性

研究指出，三氯乙烯具有致癌性與致腫瘤性，且因環境中自然轉化的 速度甚為緩慢 (Vogel et al., 1987)，故已列為環境毒性污染物質(林建芬， 1994)。三氯乙烯也無法直接被微生物所分解，需透過共代謝 (cometabolism) 機制才能進行生物降解 (Ishida and Nakamura, 2000)。且降解過程的中間產 物，如三氯乙烯環氧化物 (TCE expoxide) 等也會對微生物產生抑制，甚至 累積於環境中，造成更多且複雜的污染問題產生。表 2-6 所示，為工研院

安全衛生研究中心編印之物質安全資料中，關於三氯乙烯對人體健康危害 效應的資料。表中顯示，三氯乙烯危害人體之處即包括肺、腎、皮膚、心 臟、呼吸系統及中樞神經系統等多個重要部位。

表 2-6 三氯乙烯對人體健康的危害效應 (工研院安衛中心) 吸入 1.在 30 ppm 下，其蒸氣會刺激鼻及咽。 2.在 100~600 ppm 下，可能會抑制中樞神經系統，造成暈眩、頭痛、 噁心及過度疲勞。 3.高濃度下(1000 ppm 以下)會造成意識喪失、顫抖、肌肉協調能力 喪失及視覺異常 皮膚接 觸 與液體接觸過久可能會造成嚴重的刺激和皮膚炎 眼睛接 觸 1.其蒸氣會刺激眼睛 2.其液體會造成角膜損害但可復原 急性 食入 可能造成嘔吐、腹瀉、心臟衰竭、肺出血、神經系統損害及失明。 健 康 危 害 效 應 慢性 1.長期暴露會造成肝損害及行為問題 2.可能造成神經系統傷害，其特徵為顫抖、暈眩、焦慮、心跳速率減慢、手 的知覺減弱和失眠。 3.暴露於 100~630 ppm 高濃度下，會使男性性能力降低，女性月經的不規 則，也會引起神經系統混亂。 暴露之徵兆 及症狀 刺激感、暈眩、頭痛、噁心、失去意識、顫抖、視覺異常、皮膚炎。

2-2-5 國內外相關法規規範 甲苯和三氯乙烯同屬於致癌物質，且為我國環保署公告之毒性化合物 之。根據民國 90 年環保署公告之地下水管制標準，甲苯的第一類與第二 類管制值，分別為 1.00 與 10.00 mg/L。三氯乙烯的第一類與第二類管制 值，分別為 0.005 與 0.050 mg/L，如表 2-7 所示。 因為三氯乙烯據化學安定性，在環境中轉化過程很慢，加上具潛在致 基因突變性、致癌性等毒性特徵，美國國家職業安全衛生研究院 (NIOSH) 建議將三氯乙烯列為毒性化學物質。美國在 1990 年通過的「清淨空氣法

修正案」 (CAAA) Title Ш 中，亦將其列為毒性空氣汙染物 (air toxics)。據 「勞工安全衛生法」第三條第一項規定，依其有機溶劑對人體健康危害程 度大小而區分成三大類有機溶劑，三氯乙烯屬於對人體健康危害程度最大 之第一類之ㄧ。故聯合國世界衛生組織 (WTO) 將引用水中三氯乙烯之限 制濃度定為 0.03 mg/L，美國環境保護署定定最大汙染濃度 (MCL) 為 0.005 mg/L，最低建議值為零 (Barkach et al., 1990)。於日本方面，規定地 下水及土壤檢驗需小於 0.03 mg/L (日本環境六法，1998)。

表 2-7 國內環保署公告地下水管制標準 管 制 值 (mg / L) 污 染 物 項 目 第一類 第二類 單 環 芳 香 族 碳 氫 化 合 物 苯（Benzene） 0.005 0.050 甲苯（Toluene） 1 10 多 環 芳 香 族 碳 氫 化 合 物 奈（Naphthalene） 0.04 0.40 氯 化 碳 氫 化 合 物 四氯化碳（Carbon tetrachloride） 0.005 0.050 氯苯（Chlorobenzene） 0.1 1.0 氯仿（Chloroform） 0.1 1.0 氯甲烷（Chloromethane） 0.03 0.30 1,4-二氯苯（1,4-Dichlorobenzene） 0.075 0.750 1,1-二氯乙烷（1,1-Dichloroethane） 0.85 8.50 1,2-二氯乙烷（1,2-Dichloroethane） 0.005 0.050 1,1-二氯乙烯（1,1-Dichloroethylene） 0.007 0.070 順-1,2-二氯乙烯（cis-1,2-Dichloroethylene） 0.07 0.70 反-1,2-二氯乙烯（trans-1,2-Dichloroethylene） 0.1 1.0 總酚（phenols） 0.014 0.140 四氯乙烯（Tetrachloroethylene） 0.005 0.050 三氯乙烯（Trichloroethylene） 0.005 0.050 氯乙烯（Vinyl chloride） 0.002 0.020 農 藥 2,4-地（2,4-D） 0.07 0.70 加保扶（Carbofuran） 0.04 0.40 可氯丹（Chlordane） 0.002 0.020 大利松（Diazinon） 0.005 0.050 達馬松（Methamidophos） 0.02 0.20 巴拉刈（Paraquat） 0.03 0.30 巴拉松（Parathion） 0.022 0.220 毒殺芬（Toxaphene） 0.003 0.030 重 金 屬 砷（As） 0.05 0.50 鎘（Cd） 0.005 0.050 鉻（Cr） 0.05 0.50

2-3

生物復育技術

生物復育技術 (bioremediation) 的定義是利用微生物或微生物程序，將 受污染的土壤、污泥或殘渣中的有機化合物經異化(氧化)、同化(還原)或共 代謝作用，分解或轉化成較簡單的有機物或是二氧化碳及水等無害產物， 以達到整治之目標。採用生物技術的優點包括可現址處理、處理費用較低、 生態相容、確實分解破壞污染物、具有持續性效果等，但也有其缺點如技 術選擇困難、處理時間較長、可能產生副產物等。就有機污染物而言，經 生物復育技術整治後的污染場址其性質未有重大改變，有利後續使用或維 持原有用途 (盧至人，1997)。 相較其他技術而言，生物復育的優點是能將污染物去除而非僅是相的 轉移、無額外污染性副產物產生及經濟成本較低。以土壤污染整治來說， 用生物復育的方式進行整治受污染的土壤，經處理過後的土壤性質不會有 重大的改變，有利於後續使用或是維持原有用途。 現地 (in-situ) 生物復育重點工作為提供適當的環境因子，以提高現地

2. 生物添加法 (bioaugmentation)：利用基因工程技術直接添加對污染物具

有分解能力的特殊菌種於污染場址。由於基因重組微生物添加至自然生 態環境中，必需考量其毒性及對生態系之影響，因此必須經過嚴密而謹 慎的審查後才可實施。

3. 生物處理法 (biological treatment)：將污染物經通氣 (bioventing)或土壤 洗滌 (soil flushing) 後送至特殊生物反應器或是生物濾床、生物洗滌塔 去除污染物，或是採用地耕法 (landfarming)、堆肥處理 (composting)。

2-4 三氯乙烯之生物降解

2-4-1 三氯乙烯生物厭氧處理 在厭氧條件下，三氯乙烯利用污染場址中原有的微生物族群，將氯原 子脫除置換上氫原子，獲得能量提供細胞代謝和生長。三氯乙烯經由厭氧 還 原 性 脫 氯 (reductive dehalogenation) 的 過 程 形 成 順 -1,2- 二 氯 乙 烯 (cis-1,2-dichloroethene)、反-1,2-二氯乙烯 (trans-1,2-dichloroethene)及 1,1-二 氯乙烯 (1,1-dichloroethene)，繼之形成氯乙烯 (vinyl chloride) 及二氧化 碳，其代謝途徑如圖 2-2 所示 (Vogel and McCarty, 1985)。厭氧脫氯過程 中，若脫氯不完全，會產生毒性比三氯乙烯更高的二氯乙烯及氯乙烯累積 (Kleopfer et al., 1985; Vogel et. al, 1987; Zylstra et al., 1989)。美國 EPA 已將

氯乙烯列為致癌性物質，故目前大多採用生物好氧的方式處理受三氯乙烯 污染的場址。

Cl Cl C H H C Cl Cl C Cl Cl C Cl Cl C H Cl C H Cl C H Cl C Cl H C H Cl C H H C H Cl C CO₂ H₂ HCl H₂ HCl H₂ HCl PCE TCE DCE VC 圖 2-2 四氯乙烯經還原性脫氯反應轉換成二氧化碳的可能途徑

2-4-2 三氯乙烯生物好氧處理 在好氧狀況下，由於微生物無法直接以三氯乙烯作為生長基質進行生 物降解 (Bouwer et al., 1981)，但可經由分解結構與三氯乙烯相似或易分解 的基質作為主要生長基質而獲得能量。當微生物獲得主要生長基質做為碳 源及能量來源時，會被誘導產生氧化酵素 (oxygenase) 來分解主要生長基 質，促使菌體增長。由於氧化酵素的專一性較低，不僅能分解生長基質， 同時具有分解三氯乙烯的能力，將三氯乙烯分解成無毒害性的二氧化碳和 水等 (Criddle et al, 1993)。此種藉由主要生長基質所誘導產生的氧化酵素將 三氯乙烯分解的處理方式，稱為好氧共代謝 (aerobic cometabolism)。

Wilson and Wilson(1985) 首先在實驗室發現將天然氣(甲烷)及氧氣曝

於裝有受三氯乙烯污染的土壤管柱中可順利馴養現地微生物族群，經由生 物好氧共代謝作用將三氯乙烯移除。

目前發現具有共代謝三氯乙烯能力之微生物：

1. 甲烷 (methane) 氧化菌 (Wilson and Wilson, 1985; Vogel and McCarty, 1985; Fogel et al., 1986; Little et al., 1988; Semprini, 1990; Eguchi et al.,

3. 丙烷 (propane) 分解菌 (Wackett et al., 1989 )

4. 氨 (ammonia) 氧化菌或硝化菌 (Vannelli et al., 1990) 5. 丙烯 (propene) 分解菌 (Ensign et al., 1992)

6. 異戊二烯 (isoprene) 分解菌 (Ewers et al., 1991)

7. 異丙基苯 (isopropyl benzene) 分解菌 (Dabrock et al., 1992)

其中甲烷氧化菌及苯環類分解菌中的甲苯分解菌、酚分解菌，更是目 前應用於三氯乙烯共代謝研究之三大族群。

Wackett and Gibson(1988) 分別以甲苯分解菌 Pseudomonas putida F1 及甲烷氧化菌 Methylosinus trichosporium OB3b 共代謝三氯乙烯，結果顯示 甲苯分解菌對三氯乙烯的初始移除率明顯大於甲烷氧化菌。

至於在現地復育之應用上，則應分別考慮不同菌種在不同污染環境中 所表現之代謝活性，就污染之性質及污染區是否同時受到酵素誘導物(甲 苯、酚、甲烷)之污染等化學因子選擇適當的代謝族群。針對三氯乙烯地下

污染場址，現地生物復育技術可利用不同生長基質如酚、甲苯、甲烷及氨 成功馴養現地具共代謝三氯乙烯能力之菌株 (Semprini, 1990; Hopkins et al.,

g-DO/g-phenol 、 3.1 g-DO/g-toluene 、 4.0 g-DO/g-methane 及 3.8 g-DO/g-ammonia，同時指出以甲苯或酚為主要基質時，微生物易於馴養， 且三氯乙烯移除率較佳 (≈ 90%)。

2-5 基質競爭效應

共代謝機制中，微生物需要生長基質維持酵素活性來共代謝三氯乙 烯，由於氧化酵素專一性較低，除分解主要生長基質外，亦具有分解三氯 乙烯之能力，故生長基質會與三氯乙烯共同競爭相同的酵素，進而影響微 生物分解基質與共代謝三氯乙烯的效率，此現象即所謂的基質競爭效應 (competition)。Hubert et al., (2005) 指出甲苯對於三氯乙烯的抑制大於三氯 乙烯對甲苯的抑制。酵素競爭結果主要視氧化酵素與化合物的親和性而 定，親和性可由 Monod 方程式中之半飽和常數 (half-saturation coefficient) 來判定，半飽和常數表示微生物與生長基質之親合力 (Alexander, 1994)，當

分解基質的半飽和常數愈小，基質競爭效應愈顯著 (Speitel and McLay, 1993)。表 2-8 列出在文獻上曾證實為甲苯分解菌的菌種進行共代謝三氯乙 烯的動力參數。

Folsom et al. (1990) 以酚作為 Pseudomonas cepacia G4 菌株唯一碳源

共代謝三氯乙烯，試驗過程中酚的降解速率顯著的比三氯乙烯快許多；但 當三氯乙烯濃度增加時，三氯乙烯會抑制酚的降解，使酚的降解速率減慢。

獨存在下，由菌相的型態證實微生物族不會有明顯的改變，但是甲苯及三 氯乙烯共同存在時，微生物族群的菌相會有明顯的改變，三氯乙烯的移除 也會提高，但是在甲苯濃度高於 60 µg/mL 會抑制現地微生物族群分解碳 源的能力。 黃如玉等人 (1999) 利用氣泡床生物反應器與三相活性碳生物濾床反 應器來處理三氯乙烯及甲苯廢氣，當進流甲苯濃度提高時，三氯乙烯移除 率也隨之上升，一旦進流甲苯濃度超過 8.96 g/m3，三氯乙烯移除率便下降。 由此可知，在微生物可負載的情況下，提高進流甲苯濃度有助於微生物誘 導較多的甲苯氧化酵素，提高微生物對三氯乙烯的降解，一旦進流甲苯濃 度超過微生物可負載量時，便會產生基質競爭抑制的現象，造成三氯乙烯 移除率明顯降低。同時，當三氯乙烯濃度過高時，亦會影響其本身及甲苯 的去除效率和去除能力。

表2-8 甲苯分解菌生物降解三氯乙烯擬合 Monod 反應動力式的參數 Strain Batch/Continuous/ Semicontinuous Ks, TOL (mg/L) kTCE (h-1) Ks, TCE (mg/L) Reference: P. cepacia G4 Chemostat 0.79 0.040 0.79 Landa et al., 1994 Mixed culture Batch 1.02 0.00708 8.64 Chang and

Alvarex-Cohen., 1995 P. cepacia G4 Fed-batch - 0.0035 - Mars et al,. 1996

P mendocina

KR1 Batch - 0.066 0.96 Sun and Wood, 1996

Mixed Culture Biofilm 0.027 0.016 0.173 Arcangeli and Arvin, 1997 In situ

community - 1.0 0.029 10 McCarty et al., 1998

P. putida B2 Batch 2.7 0.054 6.4 Kelly et al., 2000 P. putida TVA8 CSTR 2.7 0.054 6.4 Kelly et al., 2000 Mixed Culture Batch 0.80 0.095 14 Lee and Liu, 2006

In situ

2-6 三氯乙烯對微生物之毒性

許多研究指出當環境或生物處理系統中三氯乙烯濃度過高時，會對微 生物造成毒害性，抑制微生物族群代謝三氯乙烯的活性 (Mu and Scow, 1994)。Oldenhuis et al. (1989) 將不同濃度三氯乙烯注入 0.42 mg-cells/mL

菌懸液中進行三氯乙烯生物降解試驗，結果顯示當水溶液中三氯乙烯濃度 大於 0.2 mM 時，菌株 Methylosinus trichosporium OB3b 共代謝三氯乙烯的 效率會受到影響。此外，Wackett and Householder(1989) 指出三氯乙烯藉由

Pseudomonas putida F1 產生的甲苯雙氧氧化酵素 (TDO) 進行生物共代謝

時，代謝過程產生的有毒物質會抑制 Pseudomonas putida F1 的生長，使得 三氯乙烯之代謝速率漸緩。Lu and Lee(2003) 指出當三氯乙烯初始濃度由 11.1 µg-TCE/g-soil 增加到 105 µg-TCE/g-soil 時，三氯乙烯的生物共代謝效

率 由 65% 降 至 20% ， 若 進 一 步 將 三 氯 乙 烯 的 初 始 濃 度 增 加 到 169 µg-TCE/g-soil 時，三氯乙烯無法經由共代謝作用被去除。

低了 9 倍，顯示三氯乙烯會抑制微生物對基質的分解。為控制三氯乙烯毒

性的影響，可藉由菌株的重複添加來維持微生物共代謝三氯乙烯的能力， 或停止菌株與三氯乙烯的接觸，使菌株活性恢復 (呂淑惠等人，1999)。

2-7 甲苯分解菌共代謝三氯乙烯機制

甲苯分解菌共代謝三氯乙烯的機制，是利用基質氧化時所產生的甲苯 單氧氧化酵素 (monooxygenase) 或甲苯雙氧氧化酵素 (dioxygenase) 共代

謝三氯乙烯。甲苯單氧氧化酵素之作用乃是催化一個氧原子併入甲苯分子 中形成甲酚 (cresol) 或苯甲酸 (benzoic acid)，其中催化形成甲酚之酵素可

同時促進三氯乙烯氧化，氧原子會併入三氯乙烯的碳雙鍵，使三氯乙烯被 單氧氧化酵素轉化為環氧化物 (TCE epoxide) 結構的中間產物。甲苯雙氧 氧化酵素之作用則是直接將兩個氧原子併入甲苯分子中形成 cis-toluene dihydrodiol，若以雙氧氧化酵素共代謝三氯乙烯 ， 則 藉 由 氫 氧 化 作 用 (hydroxylation)，氧原子會併入三氯乙烯的碳氫鍵，使三氯乙烯轉化為氯化 烷醇結構的中間產物。 甲苯分解菌雖然皆以甲苯為誘導基質，但不同菌株所產生的氧化酵素 會有所差異。其中，P. putida F1 可視為產生甲苯雙氧氧化酵素的代表菌種， 在甲苯雙氧氧化酵素作用下，甲苯會轉化為 cis-toluene dihydrodiol；而 P.

說明作用在芳香族苯環上的氧化酵素才是可同時催化芳香族化合物及三氯 乙烯之反應。Wackett et al. (1988) 指出甲苯雙氧氧化酵素不僅能夠進行雙 氧化作用，同時可進行單氧化作用，將一個氧原子併入苯環類化合物。推 測甲苯分解菌 P. putida F1 共代謝三氯乙烯應是雙氧氧化酵素進行單氧化 作用所致。目前已知的甲苯好氧代謝途徑起始氧化程序及其代謝菌種如圖 2-3 所示 (Shields et al., 1991)，其代謝途徑整理於表 2-9。

表2-9 甲苯好氧分解菌代謝途徑及產物整理 (Shields et al., 1991)

Organism Enzyme Enzyme attack position Intermediate

P. putida F1 toluene dioxygenase benzenyl cis-toluene dihydrodiol

P. cepacia G4 toluene 4-monooxygenase ortho- o-cresol

P. pickettii PKO1 toluene 3-monooxygenase meta- m-cresol

P. mendocina KR-1 toluene 4-monooxygenase para- p-cresol

第三章 實驗材料與分析方法

3-1 實驗材料

3-1-1 實驗用水

為減少實驗干擾，本研究實驗藥品的配製以及實驗中所使用的去離子 水皆先經逆滲透、活性碳吸附及 UV 照射系統處理過 (ELGA, Ultra-pure water system)，再經滅菌釜 (REXALL, LS-2D) 於 121ºC、20 psi 條件下溼熱

滅菌 20 分鐘。

3-1-2 主要基質

本研究以甲苯 (MERCK, GR grade) 作為 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10)

之主要生長基質，以好氧共代謝的方式探討對於目標污染物三氯乙烯的降 解效率影響。使用前先以無菌水配製成約 400 mg/L 之儲備溶液，並置於 4ºC 冰箱冷藏備用。

3-1-4 無機營養鹽 微生物生長除需水、適當的電子提供者及能量碳源外，尚需氮、磷及 微量元素以供微生物細胞之合成及酵素作用。添加適當營養鹽能刺激微生 物族群生長和提升代謝作用，進而提高復育效果。一般而言，氮、磷為微 生物在自然狀況下容易缺乏的營養元素，通常建議生物生長所需之 C:N:P 為 100:10:1。本研究使用之無機營養鹽成分及濃度如表 3-1。其中硫酸銨 ((NH4)2SO4)、硫酸鎂 (MgSO4･7H2O)、硫酸鈣 (CaSO4･2H2O)、硫酸鐵

(FeSO4･7H2O)、硫酸鋅 (ZnSO4･7H2O)、硫酸錳(MnSO4･H2O)及硫酸銅

(CuSO4･5H2O)等供作微量元素，磷酸氫二鉀 (K2HPO4) 及磷酸氫二鈉

(Na2HPO4) 除提供微生物生長所需之磷、鉀及鈉外，亦對培養液具緩衝作

用。以上化學試藥皆為德國 MERCK 公司的產品。

3-1-5 瓊脂平板培養基

本研究使用Nutrient Broth 瓊脂平板培養基進行 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 菌數之測定及繼代培養。NB 瓊脂平板培養基配製方式為：取 6.5 g Nutrient Broth(HIMEDIA, 成份如表 3-2) 和 7.0 g Agar powder(HIMEDIA,

表 3-1 無機營養鹽成分及濃度 Component _{Concentration（mg/L）} (NH4)2SO4 4.7 K2HPO4 1.23 Na2HPO4 3.57 MgSO4･7H2O 0.62 CaSO4･2H2O 0.0031 FeSO4･7H2O 0.0062 ZnSO4･7H2O 0.0062 MnSO4･H2O 0.0031 CuSO4･5H2O 0.0062 Na2MoO4･2H2O 0.0062 表 3-2 Nutrient Broth 營養鹽成分 Ingredients Concentration(g/L) Peptic digest of animal tissue 5.00

3-2 分析方法與設備

3-2-1 甲苯及三氯乙烯的分析

本研究參考行政院環境保護署所公告之水 中 揮 發 性 有 機 化 合 物 檢測 方 法 (NIEA W785.53B, 2003)，利用氣相層析質譜儀 (Gas Chromatograph Mass)，配合吹氣捕捉濃縮系統 (Purge and Trap Concentration) 分析水樣中

甲苯及三氯乙烯等揮發性有機物濃度。根據甲苯及三氯乙烯初始及殘留濃 度的變化量可了解生物共代謝情形。吹氣捕捉濃縮裝置及氣相層析質譜儀 之操作條件分述如下：

一. 吹氣捕捉濃縮系統 (Purge and Trap Concentration, TECKMAR) (1) 吹氣捕捉濃縮系統型號：Teckmar Velocity XPT

(2) 氣體捕捉管型號：Teckmar Purge Trap K (3) 使用氣體及壓力：高純氮 (Nitrogen)，70 psi (4) 吹氣時間及流量：11 min，36 mL/min

(5) 脫附時間、溫度及流量：4 min，260ºC，300 mL/min (6) 傳輸管溫度：150ºC

(3) 使用氣體：高純氦 (Helium) (4) 氦氣壓力及流量：4.24 psi，25 mL/min (5) 注射口溫度及分流比：265ºC，25:1 (6) 氣象層析管柱型號：Hp 624(60 m × 0.32 mm × 1.8 µm) (7) 管柱升溫程式 初溫及持溫時間：40ºC，5 min 升溫速度：8ºC/min 末溫及持溫時間：180ºC，11 min 總共所需時間：33.5 min (8) 揮 發性有 機物 滯留時間及儀器偵測極限 甲苯：17.02 min，1.1 μg/L 三氯乙烯：14.78 min，2.6 μg/L

3-2-2 溶氧測定 本 研 究 使 用 溶 氧 電 極 量 測 甲 苯 共 代 謝 三 氯 乙 烯 過 程 中 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 的耗氧量，藉以評估甲苯經生物降解的需氧 量。儀器機型為 YSI, 5100。 3-2-3 酸鹼值測定 本 研 究 使 用 酸 鹼 值 測 定 儀 量 測 樣 品 溶 液 之 酸 鹼 度 ， 藉 以 確 認 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 於 中 性 環 境 下 成 長 。 儀 器 機 型 為 WTW, pH/Codi 340i。 3-2-4 OD 605測定 本研究使用分光光度計量測 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 在單一可見 光波長 605 nm 下菌液的吸光度，藉由菌液及空白水樣所吸收光度差異，可 測定出實驗過程中微生態系內細胞量之吸光值變化。儀器機型為 MERCK, Spectroquant NOVA 60。

50 µL 稀釋濃度水樣以無菌三角彎棒均勻塗抹於 NB 瓊脂平板培養基表 面。倒置瓊脂平板培養基於 36ºC 恆溫培養箱中，48 小時後計數瓊脂平板

培養基中所產生的菌落數。將稀釋倍數乘以菌落數介於 30 ~ 300 之間者， 以推算水中總菌落數。菌落數以 CFU/mL(Colony Forming Units/mL) 表示 之。

3-3 試驗菌種

3-3-1 菌種來源及保存 本研究使用成大資源工程系 郭明錦老師實驗室由甲苯生物處理系統 純化分離出的菌株 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 為實驗菌種來源 (Han et al., 2007)。分離菌株 Ralstonia sp. P-10 保存於 20% 的甘油中，並於 -20oC 下進行冷凍保存。 3-3-2 菌種活化及增殖馴養 在實驗進行前以接種環沾取儲存於 20% 甘油中的菌株，利用劃碟法於 NB 瓊脂平板培養基上進行單一菌株的再純化及活化。菌株活化之後，為了 避免菌株養分不足、阻礙生長，每隔 3 ~ 4 天於新鮮的瓊脂平板培養基上 以劃碟的方式進行菌種繼代培養。 為了取得大量菌體供純菌批次試驗的進行，以接種環將活化後的菌落 加入以高度純氧曝氣至溶氧飽和 (DO ≈ 32 mg/L) 的無機營養鹽中，室溫下 以甲苯 (≈ 10 mg/L) 作為唯一碳源，進行甲苯分解菌的增殖培養。在裝有 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 菌懸液的血清瓶底部以攪拌裝置使菌體維持

O2 2.3 L血清瓶 無機營養鹽 甲苯 (≈10 mg/L) 室溫震盪 馴養7天 洋菜培養基 (≈ 25 ºC,150 rpm) 置換新鮮無機營養鹽 再曝氣至飽和 (DO ≈ 32 mg/L) O2 _甲苯 室溫震盪 馴養7天 (≈ 25 ºC,150 rpm)

3-4 甲苯分解菌好氧共代謝三氯乙烯批次培養試驗

為了評估 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 以甲苯為主要基質好氧共代謝 降解三氯乙烯的功能性。將增殖培養 14 天的 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 菌懸液以純氧曝氣至溶氧飽和 (≈ 32 mg/L)後，分裝至 126 mL 的褐色樣品 瓶中，並以含鐵氟龍墊片之瓶蓋將樣品瓶鎖緊。為避免甲苯基質毒性的產 生，3000 μL 的甲苯儲備溶液 (400 mg/L) 於 12 小時內分三次注入。換言 之。有 3 × 1000 μL 的 400 mg/L 甲苯儲備溶液注入每罐微生態系，每次 注入後，微生態系內的甲苯濃度約為 3.3 mg/L。450 μL 的三氯乙烯儲備溶 液 (131.79 mg/L) 與注入第一針甲苯時一同注入。實驗設計如表 3-3 所 示。為確保菌種存在的單一性，避免外界雜菌的汙染，所有的試驗器材皆 經過滅菌，且在無菌操作檯上進行。視樣品瓶為微生態系 (microcosm)。批 次培養試驗中甲苯添加試驗組詳細操作步驟見圖 3-2。 本部分研究以兩組不同的批次試驗於室溫下 (≈ 25ºC, 150 rpm) 進行。 其 中 一 組 批 次 試 驗 在 進 行 7 天 的 單 一 培 養 期 程 後 ， 分 析 植 入 菌 株 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 的三重複微生態系中甲苯及三氯乙烯殘餘濃

烯 的 生 物 降 解 反 應 動 力 參 數 。 為 了 確 認 微 生 態 系 三 氯 乙 烯 的 減 少 為 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 好氧共代謝所致，在進行批次試驗的同時，亦 進行不添加甲苯的控制組。另進行一組以無菌水添加濃度約 500 µg/L 的甲 苯及三氯乙烯，評估整個試驗過程中因洩漏造成的損失。洩漏組甲苯的濃 度低於試驗組是為了避免濃度超過儀器偵測極限。 表 3-3 批次試驗實驗操作設計

Batch test Microcosms Conditions

Toluene-fed microcosmes

HYL-QT1 3 × 1000 µL toluene

1 × 450 µL TCE

Non-toluene fed microcosmes HYL-QT1 1 × 450 µL TCE

Leakage Controls

Sterilized water 1 × 450 µL TCE 1 × 160 µL toluenea

O2 將菌懸液分裝至 126 mL 褐色樣品瓶 甲苯及三氯乙烯 _{甲苯 甲苯} (DO ≈ 32 mg/L) 6 小時 6 小時

3-5 甲苯基質多次注入試驗

甲苯基質多次注入試驗之目的在以不同的注入次數及注入體積，將相 等質量的甲苯注入 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 的微生態系內，探討甲苯 存在有效反應時間對三氯乙烯生物降解效率的影響。HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 增殖培養的操作步驟如 3-3-2 節所示。甲苯基質多次注入試驗共分為 四組，各組以不同的甲苯注入次數及注入體積於恆溫培養箱中 (≈ 25ºC, 150 rpm) 進行 5 天的單一培養期程。各組別的實驗設計詳見表 3-4 及流程圖如 3-3、3-4 及 3-5 所示。 於 126 mL 的微生態系內，甲苯儲備溶液 (約 400 mg/L) 總注入體積為 3000 µL，總注入質量為 1.2 mg，微生態系內甲苯濃度約為 10 mg/L。以 A 組而言，在實驗開始時，即以一針注入 3000 µL 的甲苯儲備溶液於微生態 系中 (1 × 3000 µL 的 400 mg/L 甲苯儲備溶液 )；B 組則在 12 小時內分 3 次 注入 (3 × 1000 µL 的 400 mg/L 甲苯儲備溶液 )；C 組在 2 天內分 6 次注入 (6 × 500 µL 的 400 mg/L 甲苯儲備溶液 )；D 組在 3 天內分 9 次注入 (6 × 350 µL, 3 ×300 µL 的 400 mg/L 甲苯儲備溶液 )。450 µL 的三氯乙烯儲備溶液

降解的效率影響之外，另外在 B 組及 D 組的試驗分別注入的次數為三針及 九針，在 100 小時內分析微生態系中溶氧、酸鹼值、OD605、甲苯及三氯乙

烯濃度變化，評估 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 好氧共代謝三氯乙烯生物

表 3-4 甲苯基質多次注入實驗操作設計 Toluene-injection schedules A B C D Day 1 1 × 3000 µL 3 × 1000 µL 3 × 500 µL 3 × 350 µL Day 2 3 ×500 µL 3 × 350 µL Day 3 3 × 300 µL

第四章 結果與討論

4-1 甲苯生物降解需氧量

根據前人研究指出微生物族群以甲苯為主要基質好氧共代謝三氯乙烯 時，生物處理系統中的溶氧量為重要的限制因子 (Jenal-Wanner and McCarty,

1997; Lu et al., 1998)，溶氧之消耗大都用於甲苯之代謝。甲苯經生物降解時 的需氧量會隨著甲苯濃度的增加而增加，當生物處理系統中溶氧量不足 時，甲苯的生物降解會受到限制，進而限制了甲苯分解菌好氧共代謝三氯 乙烯的活性。本研究以硫酸銨 ((NH4)2SO4) 作為氮源，其甲苯氧化及細胞

合成反應的化學計量式根據 Jenal-Wanner and McCarty(1997) 所列之通式修 改如下所示：

(

+

)

6 5 3 2 3 4 5 7 2 2 2 9 C H CH 9 O HCO NH 5 9 36 81 C H O N 7 CO 18 14 H O 5 5 5 s e s s s e f f f f f f − + + + → ⎛ ⎞ ⎛ ⎞ +_⎜ − _⎟ +_⎜ + − _⎟ ⎝ ⎠ ⎝ ⎠ (4-1)

培養試驗指出甲苯生物降解的需氧量為 5.1 mole-oxygen/mole-toluene。本研 究根據純菌 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 以甲苯為基質好氧共代謝三氯乙 烯 的 批 次 試 驗 所 測 得 的 甲 苯 生 物 降 解 需 氧 量 為 5.3 ± 0.2 mole-oxygen/mole-toluene。當 9fe = 5.3 時，fe = 0.6。本研究以銨氮作為氮 源，以氧氣當作電子提供者的甲苯生物降解化學計量式如下：

(

+

)

6 5 3 2 3 4 5 7 2 2 2 C H CH 5.3O 0.72 HCO NH 0.72C H O N 4.12CO 3.28H O − + + + → + + (4-2) 根據甲苯生物降解化學計量式 (4-2) 指出甲苯生物降解的需氧量為 1.84 mg-oxygen/mg-toluene。 在開始進行 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 批次培養試驗時，將馴養 14 天的懸菌液曝氣至溶氧飽和，微生態系內的溶氧量為 4.0 mg-O2(126 mL × 32 mg/L)。400 mg/L 甲苯儲備溶液於批次試驗期間的注入量為 3000 µL，其提 供了 1.2 mg 甲苯於微生態系中供甲苯分解菌成長所需。根據甲苯生物降解 時 1.84 mg-oxygen/mg-toluene 的需氧量，可求得微生態系內 1.2 mg 甲苯完 全被生物降解之需氧量為 2.2 mg-O2，顯示批次試驗中微生態系內 4.0

4-2 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 共代謝三氯乙烯批次試驗

HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 以甲苯為主要基質好氧共代謝三氯乙烯 功能性批次試驗結果列於表 4-1。微生態系中甲苯及三氯乙烯初始濃度分別 為 7.7 ± 0.2 mg/L 及 503 ± 13 µg/L。經過 7 天的震盪培養，7.7 ± 0.2 mg/L 甲苯在 Ralstonia sp. P-10 微生態系中被降解到低於儀器偵測極限 (1.1 µg/L)，移除率為 100%。甲苯及三氯乙烯在洩漏控制組(無菌水中僅注入與 試驗組等量的甲苯與三氯乙烯)中僅移除了 1 ± 0.8% 及 1 ± 1.5%，顯示在批 次試驗進行過程中，三氯乙烯並無顯著的洩露損失。 在甲苯添加試驗組三氯乙烯濃度由初始的 503 ± 13 µg/L 降至 430 ± 10 µg/L，移除率為 15 ± 2%；在未添加甲苯試驗組三氯乙烯的濃度僅降至 491 ± 1.4 µg/L，移除率為 2 ± 0.3%。微生態系中溶氧的消耗在甲苯添加試 驗組及未添加甲苯試驗組分別為 21 ± 0.9 mg/L 及 6.8 ± 0.4 mg/L。在未添加 甲苯的試驗組，HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 因為缺乏主要供給微生物生長 的碳源，因此微生態系中溶氧的消耗顯著低於甲苯添加組試驗組。由甲苯

表4-1 甲苯分解菌 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 好氧共代謝三氯乙烯批次試驗結果

Toluene-fed Microcosms Non-toluene-fed

Microcosmse Leakage Controls

g

TCE Remaining Concentration (µg/L)a 430 ± 9.9 491 ± 1.4 498 ± 3.9

TCE Removal (%) 15 ± 2.0 2 ± 0.3 1 ± 0.8

Toluene Remaining Concentration (mg/L) NDb NAc 357 ± 5.4

Toluene Removal (%) 100 NA 1 ± 1.5

Dissolved Oxygen Remaining (mg/L) 13 ± 0.9 27 ± 0.4 NA

TCE-degradation Rate Coefficient (day-1) 0.22 NA NA

OD 605d 0.025 ± 0.003 0.008 ± 0.001 NA

4-3 批次試驗生物降解動力探討

本研究在確認 HYL-OT1(Ralstonia sp. P-10) 以甲苯為主要基質好氧共 代謝三氯乙烯之功能性後，另進行為期 4 天的批次試驗，藉由在培養期程 內密集測得的甲苯及三氯乙烯殘餘濃度隨時間變化的情形評估 Ralstonia sp. P-10 好氧共代謝三氯乙烯之反應動力參數。同時亦根據微生態系中的溶 氧 量 變 化 、 酸 鹼 值 、 菌 數 及 菌 相 隨 時 間 的 變 化 ， 探 討 環 境 條 件 對 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 共代謝降解三氯乙烯的影響。 4-3-1 三氯乙烯生物降解效率 圖 4-1 為批次試驗中甲苯和三氯乙烯殘餘濃度隨時間變化的情形，圖 中的每個數據點分別由單獨的微生態系於不同時間下測得。整個培養期程 根據甲苯存在微生態系的時間可分為兩階段來看。三氯乙烯生物降解現象 在甲苯存在的第一階段顯著高於甲苯耗盡時的第二階段；在甲苯耗盡的第 二階段，只要氧化酵素尚未完全失去活性，三氯乙烯生物共代謝現象則仍 會持續發生，只是降解速率較甲苯存在的第一階段低許多。Lu et al. (1998)

有 71% 的三氯乙烯共代謝移除效率，在甲苯完全耗盡的階段，三氯乙烯生 物共代謝效率僅有 29%。

在甲苯與三氯乙烯同時存在的第一階段，三氯乙烯的降解可能會受到 基質競爭氧化酵素的影響，進而抑制三氯乙烯的代謝。Lu et al. (1998) 觀察 到當甲苯初始濃度高於 5 mg/L 時，甲苯對三氯乙烯降解的抑制性才會發 生。Lee and Liu (2006) 更指出當甲苯初始濃度為 30 mg/L 時，三氯乙烯的 降解才會受到甲苯抑制的影響。實驗室微生態系試驗於單一批次試驗內分 三次注入 7.7 ± 0.2 mg/L 的甲苯，每次注入甲苯濃度為 2.6 ± 0.1 mg/L，此 濃度相較於 Lu et al. (1998) 及 Lee and Liu (2006) 指出的甲苯濃度低許 多，因而判斷本研究三氯乙烯的降解應該不會受到甲苯競爭抑制作用。同 時，本研究三氯乙烯初始濃度並不高 (503 ± 13 µg/L)，三氯乙烯對甲苯的 抑制亦應該不會發生。Fan et al. (1993) 亦指出土壤微生物需經添加主要基 質(甲苯)後才具有共代謝三氯乙烯的能力，當土壤中甲苯分解完後，三氯乙 烯生物共代謝現象亦終止。根據文獻及本研究結果的相同現象再次證實了 當甲苯耗盡時，無法維持三氯乙烯代謝活性，殘餘的甲苯氧化酵素無法持

Time (hour) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 TCE R em aining C o nc. (ug/L) 0 100 200 300 400 500 600

Toluene Remaining Conc.

(mg/L) 0 2 4 6 8 10 TCE Toluene phase 1 phase 2 圖 4-1 批次試驗中 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 微生態系內甲苯及三氯 乙烯殘餘濃度隨時間的變化(箭頭代表甲苯注入時間點)

實驗室微生態系在甲苯存在(第一階段)時求得的三氯乙烯降解反應動 力參數，對於數學模式及現地試驗結果的預測相當有用。Jenal-Wanner and

McCarty(1997) 使用 Michaelis-Menten 方程式 (Eckenfelder, 1970) 及 Monod 方程式 (1949) 求取生物共代謝三氯乙稀反應速率參數，式子如下 所示： s a s k S dS X dt K S − = + (4-3) c a sc k C dC X dt K C − = + (4-4) 其中S和C為主要基質 (甲苯) 以及目標污染物 (三氯乙烯) 濃度(µg/L)；X_a 為活性細胞濃度 (mg/L)；k_s和k_c為甲苯每小時消耗速率以及三氯乙烯每小 時被共代謝降解之最大速率 (hour-1 )；Ks和Ksc分別為甲苯和三氯乙烯的親 和常數 (µg/L)。當三氯乙烯濃度遠小於親和常數 Ksc (C  Ksc)，方程式 (4-4) 可改寫成下式：

(µg/L)；t為反應時間 (hour)。HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 微生態系統中可 利用方程式 (4-6) 來評估三氯乙烯生物降解反應動力參數。 Han et al., (2007) 針對現地污染場址、實驗室半連續培養泥漿法及純菌 HYL-QT2(Pseudomonas putida) 求得之三氯乙烯一階反應動力參數分別為 2.0/day、0.6/day 及 0.5/day。圖 4-2 為本研究中擬合之三氯乙烯一階反應 速率常數，圖中顯示甲苯存在微生態系的時間非常短，在為期 4 天 (100 小 時) 的單一培養期程內，甲苯存在的第一階段只有 1 天。根據方程式 (4-6)， 以最小平方法擬合的第一階段三氯乙烯生物共代謝降解一階反應速率回歸 方程式如下： 0.0094

468.62

t

C

=

e

− (4-7) 由相關係數平方值 (R2 = 0.77) 得知一階反應動力模式適用於生物共代謝 降解速率方程式。當微生態系菌落數為 108 CFU/mL 時，三氯乙烯生物共 代 謝 一 階 反 應 速 率 參 數 ( k X' a ) 在 甲 苯 存 在 的 第 一 階 段 為

Time (hour) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 TCE R emaining C onc. (ug/L) 0 100 200 300 400 500 Toluene R emaining C onc. ( m g/L) 0 2 4 6 8 10 phase 1 phase 2 R2 = 0.77 C = 468.62 e- 0.0094 t 圖 4-2 擬合之三氯乙烯一階反應速率常數(箭頭代表甲苯注入時間點)

4-3-2 溶氧量及 OD605變化 由三氯乙烯生物降解試驗得知，除了三氯乙烯的降解效率與甲苯存在 的有效反應時間有著密切關係外，微生態系中的溶氧量與 OD605 亦隨著甲 苯存在的有效時間區分成兩個階段。由圖 4-3 所示，甲苯基質仍存在的第 一階段，微生態系的溶氧量隨著反應時間的增加而減少，溶氧量由一開始 的 34.3 mg/L 降到 17.4 mg/L，當甲苯完全耗盡時(第二階段)微生態系中的 溶氧量幾乎穩定維持在一定值。同時，微生態系的 OD605 在甲苯存在的第 一階段呈現顯著的增長，OD605 在 24 小時的反應時間內由初始的 0.004 急遽攀升至 0.026；而甲苯不存在時，OD605 僅有些許的變化。 根據試驗期間溶氧量及 OD605 隨甲苯存在於微生態系內有效反應時 間變化的趨勢，再次證實純菌 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 能在好氧環境 下分解甲苯，並藉由分解甲苯時所產生的 ATP(adenosine triphosphate) 進行 細胞合成，促進菌體的增長。

Time (Hour) 0 20 40 60 80 100 Dissolved Oxy g en (mg/L) 0 10 20 30 40 OD 605 0.00 0.01 0.02 0.03

Toluene Remaining Conc.

(m g/L) 0 2 4 6 8 10 12 14 DO OD 605 Toluene phase 1 phase 2 圖 4-3 批次試驗中 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 微生態系中的甲苯殘餘 濃度、溶氧量及吸光度(OD 605) 隨時間的變化(箭頭代表甲苯注入時 間點)

4-3-3 菌落數及菌相變化 微生態系中菌體的增長除了可由 OD605 作為依據外，亦可由菌落數變 化的情形來證實。反應初期，菌落數在 24 小時的反應時間內(第一階段) 由 105 CFU/mL 迅速增長到 108 CFU/mL；在第二個試驗階段，因為甲苯已 消耗殆盡，加上三氯乙烯的毒性抑制進而降低的微生物的代謝行為，菌落 數也從 108 CFU/mL 緩慢降到 106 ~ 107 CFU/mL。根據批次試驗前後 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 的菌相圖(圖 4-5(a) 及圖 4-5(b)) 可看出在批 次試驗進行期間，微生態系沒有受到外來菌種的污染且菌種型態呈現一 致，此結果可再次證實純菌 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 確實能以甲苯為 主要基質，利用分解甲苯產生的氧化酵素，以好氧共代謝的作用將微生態 系中的三氯乙烯移除。 4-3-4 酸鹼值變化 環境中酸鹼值是影響微生物生長的一個主要因素，在進行批次試驗 時，隨著時間點監測酸鹼值的變化，以確定微生物是在合適的環境中生長。

Time (Hour)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Bacteria

l Count (CFU/mL)

1e+3 1e+4 1e+5 1e+6 1e+7 1e+8 1e+9 1e+10 phase 1 phase 2 圖 4-4 批次試驗中 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 微生態系中的菌落數隨 時間的變化

(a)

Time (Hour) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 pH Value 5 6 7 8 9 10 phase 1 phase 2 圖 4-6 批次試驗中 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 微生態系中的酸鹼值隨 時間的變化

4-4

甲苯基質多次注入試驗

為了證實甲苯存在生物處理系統中的有效反應時間對三氯乙烯生物降 解效率影響的假設，甲苯基質多次注入試驗以四組 (A 組 ~ D 組) 不同的 甲苯注入次數及注入體積，將等質量的甲苯注入 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 微生態系中，各組甲苯注入次數及注入體積見表 3-3。甲苯注入的頻 率以 D 組最密集 (3 天內分 9 次注入)，A 組則相反(一針注入)。 在為期 4 天的單一培養期程，A 組 ~ D 組三氯乙烯濃度由 465 ± 25 µg/L 分別降至 370 ± 10 µg/L(A 組)、349 ± 3 µg/L(B 組)、345 ± 9 µg/L(C 組) 及 312 ± 21 µg/L(D 組)；三氯乙烯生物共代謝效率依序為 21 ± 2%，25 ± 1%，26 ± 2% 及 33 ± 4%，甲苯基質多次注入的結果列於表 4-2。根據甲苯 基質多次注入試驗結果證實三氯乙烯生物共代謝效率與甲苯注入頻率成正 比，甲苯存在於 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 微生態系的有效時間愈長， 共代謝生物降解三氯乙烯效率愈高。因此，藉由增加基質甲苯存在生物處 理系統中的有效時間，可有效提升三氯乙烯生物共代謝效率。

表 4-2 甲苯基質多次注入試驗結果 a

Toluene injection schedule

A B C D

TCE Remaining (µg/L) 370 ± 10 349 ± 3 345 ± 9 312 ± 21

TCE Removal (%) 21 ± 2 25 ± 1 26 ± 2 33 ± 4

Toluene Remaining (mg/L) NDb NDb ND ND

Toluene Removal (%) 100 100 100 100

Dissolved Oxygen Remaining

(mg/L) 17 ± 0.5 16 ± 0.5 16 ± 0.5 14 ± 0.7

Oxygen Consumption

4-5

比較甲苯基質多次注入試驗

在本研究中，為了更深入探討甲苯基質多次注入對 HYL-QT1 (Ralstonia sp. P-10) 好氧共代謝降解三氯乙烯的影響。將 B 組(甲苯分三針 注入)及 D 組(甲苯分九針注入)試驗組在為期 4 天(100 小時)內密集採樣 分析甲苯、三氯乙烯濃度及環境因子的變化。並以最小平方法擬合的第一 階段三氯乙烯生物共代謝一階反應速率回歸方程式，期望可以更深入了解 多次注入對於提升三氯乙烯生物降解的因素。在本次試驗中每一個數據點 都是由個別微生態系在不同時間所取得。試驗結果如表 4-3。 4-5-1 三氯乙烯生物降解效率比較 由圖 4-7(a) 及 4-7(b) 可以看到基質甲苯分三針及九針注入時，甲苯 及三氯乙烯的濃度隨著時間點而變化。甲苯注入的次數越多，代表甲苯存 在於微生物處理系統的時間越久(第一階段越長)，表示微生物作用的時間越 長，HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 有較長的時間可以分解甲苯，即分解甲苯 氧化酵素的時間越長，共代謝生物降解三氯乙烯的時間也隨之增加。本研

表 4-3 比較甲苯基質多次注入試驗結果總表

B D

Injection Frequency 3 times / 1 day 9 times / 3 days

Toluene Remaining ND ND

Toluene Removal (%) 100 100

Initial TCE (µg/L) 654.8 545.3

TCE Remaining 531.6 383.9

TCE Removal (%) 18.8 29.6

a. Time (hour) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 TCE Re ma inin g C o n c. (ug/ L) 0 100 200 300 400 500 600 700 To lue n e R em ai n in g C onc . (m g/ ) 0 2 4 6 8 10 phase 1 phase 2 R2 = 0.80 C = 641.92 e- 0.0059 t b. ng Co nc. ( ug/ L) 300 400 500 600 aining Conc. (mg/L) 3 4 5 phase 1 phase 2 R2 = 0.88 C = 554.40 e - 0.0049 t

根據方程式 (4-6)，B 組以最小平方法擬合的第一階段三氯乙烯生物共 代謝一階反應速率回歸方程式如下： 0.0059

641.92

t

C

=

e

− (4-8) R2 = 0.80 三氯乙烯生物共代謝一階反應速率參數 (k X' _a) 在甲苯存在的第一階段為 0.14/day(0.0059/hour × 24 hour/day)。 D 組以最小平方法擬合的第一階段三氯乙烯生物共代謝一階反應速率 回歸方程式如下： 0.0049 554.40 t C = e− (4-9) R2 = 0.88 三氯乙烯生物共代謝一階反應速率參數 (k X' _a) 在甲苯存在的第一階段為 0.12/day(0.0049/hour × 24 hour/day)。

4-5-2 溶氧量變化比較 由圖 4-8 比較 B 組及 D 組的甲苯存在時間(第一階段)長短，在甲苯注 入九針的 D 組裡，其甲苯存在的有效反應時間為 B 組的三倍，所以在 D 組試驗 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 的溶氧需求量較 B 組來的高。兩組的 氧氣消耗量皆在甲苯耗盡後趨於平緩。由溶氧消耗量的差異可證實，甲苯 存在於微生態系時間越長，Ralstonia sp. P-10 以甲苯為基質好氧共代謝三氯 乙烯的效率越高。 Dissolved Oxy g en (mg/L) 10 20 30 40 D B B-phase1 D-phase 1