結果與討論 - Ralstonia sp. P-10以甲苯為主要基質好氧共代謝降解三氯乙烯之研究

4-1 甲苯生物降解需氧量

根據前人研究指出微生物族群以甲苯為主要基質好氧共代謝三氯乙烯時，生物處理系統中的溶氧量為重要的限制因子 (Jenal-Wanner and McCarty, 1997; Lu et al., 1998)，溶氧之消耗大都用於甲苯之代謝。甲苯經生物降解時 的需氧量會隨著甲苯濃度的增加而增加，當生物處理系統中溶氧量不足時，甲苯的生物降解會受到限制，進而限制了甲苯分解菌好氧共代謝三氯乙烯的活性。本研究以硫酸銨 ((NH4)2SO4) 作為氮源，其甲苯氧化及細胞合成反應的化學計量式根據 Jenal-Wanner and McCarty(1997) 所列之通式修改如下所示：

培養試驗指出甲苯生物降解的需氧量為 5.1 mole-oxygen/mole-toluene。本研 究根據純菌 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 以甲苯為基質好氧共代謝三氯乙 烯的批次試驗所測得的甲苯生物降解需氧量為 5.3 ± 0.2

在開始進行 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 批次培養試驗時，將馴養 14 天的懸菌液曝氣至溶氧飽和，微生態系內的溶氧量為 4.0 mg-O2(126 mL × 32 mg/L)。400 mg/L 甲苯儲備溶液於批次試驗期間的注入量為 3000 µL，其提供了 1.2 mg 甲苯於微生態系中供甲苯分解菌成長所需。根據甲苯生物降解時 1.84 mg-oxygen/mg-toluene 的需氧量，可求得微生態系內 1.2 mg 甲苯完全被生物降解之需氧量為 2.2 mg-O2，顯示批次試驗中微生態系內 4.0

4-2 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 共代謝三氯乙烯批次試驗

HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 以甲苯為主要基質好氧共代謝三氯乙烯 功能性批次試驗結果列於表 4-1。微生態系中甲苯及三氯乙烯初始濃度分別為 7.7 ± 0.2 mg/L 及 503 ± 13 µg/L。經過 7 天的震盪培養，7.7 ± 0.2 mg/L 甲苯在 Ralstonia sp. P-10 微生態系中被降解到低於儀器偵測極限 (1.1 µg/L)，移除率為 100%。甲苯及三氯乙烯在洩漏控制組(無菌水中僅注入與試驗組等量的甲苯與三氯乙烯)中僅移除了 1 ± 0.8% 及 1 ± 1.5%，顯示在批次試驗進行過程中，三氯乙烯並無顯著的洩露損失。

在甲苯添加試驗組三氯乙烯濃度由初始的 503 ± 13 µg/L 降至 430 ±

10 µg/L，移除率為 15 ± 2%；在未添加甲苯試驗組三氯乙烯的濃度僅降至 491 ± 1.4 µg/L，移除率為 2 ± 0.3%。微生態系中溶氧的消耗在甲苯添加試驗組及未添加甲苯試驗組分別為 21 ± 0.9 mg/L 及 6.8 ± 0.4 mg/L。在未添加 甲苯的試驗組，HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 因為缺乏主要供給微生物生長 的碳源，因此微生態系中溶氧的消耗顯著低於甲苯添加組試驗組。由甲苯

表4-1 甲苯分解菌 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 好氧共代謝三氯乙烯批次試驗結果

Toluene-fed Microcosms Non-toluene-fed

Microcosms^e Leakage Controls^g TCE Remaining Concentration (µg/L)^a 430 ± 9.9 491 ± 1.4 498 ± 3.9

TCE Removal (%) 15 ± 2.0 2 ± 0.3 1 ± 0.8

Toluene Remaining Concentration (mg/L) ND^b NA^c 357 ± 5.4

Toluene Removal (%) 100 NA 1 ± 1.5

Dissolved Oxygen Remaining (mg/L) 13 ± 0.9 27 ± 0.4 NA

TCE-degradation Rate Coefficient (day^-1) 0.22 NA NA

OD 605d

0.025 ± 0.003 0.008 ± 0.001 NA

Bacteria Count (CFU/mL)^g 10⁶ ~ 10⁸ 10³ ~ 10⁴ NA

4-3 批次試驗生物降解動力探討

本研究在確認 HYL-OT1(Ralstonia sp. P-10) 以甲苯為主要基質好氧共 代謝三氯乙烯之功能性後，另進行為期 4 天的批次試驗，藉由在培養期程 內密集測得的甲苯及三氯乙烯殘餘濃度隨時間變化的情形評估 Ralstonia sp. P-10 好氧共代謝三氯乙烯之反應動力參數。同時亦根據微生態系中的溶

氧量變化、酸鹼值、菌數及菌相隨時間的變化，探討環境條件對 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 共代謝降解三氯乙烯的影響。

4-3-1 三氯乙烯生物降解效率

圖 4-1 為批次試驗中甲苯和三氯乙烯殘餘濃度隨時間變化的情形，圖中的每個數據點分別由單獨的微生態系於不同時間下測得。整個培養期程根據甲苯存在微生態系的時間可分為兩階段來看。三氯乙烯生物降解現象在甲苯存在的第一階段顯著高於甲苯耗盡時的第二階段；在甲苯耗盡的第二階段，只要氧化酵素尚未完全失去活性，三氯乙烯生物共代謝現象則仍 會持續發生，只是降解速率較甲苯存在的第一階段低許多。Lu et al. (1998)

有 71% 的三氯乙烯共代謝移除效率，在甲苯完全耗盡的階段，三氯乙烯生物共代謝效率僅有 29%。

在甲苯與三氯乙烯同時存在的第一階段，三氯乙烯的降解可能會受到 基質競爭氧化酵素的影響，進而抑制三氯乙烯的代謝。Lu et al. (1998) 觀察 到當甲苯初始濃度高於 5 mg/L 時，甲苯對三氯乙烯降解的抑制性才會發生。Lee and Liu (2006) 更指出當甲苯初始濃度為 30 mg/L 時，三氯乙烯的降解才會受到甲苯抑制的影響。實驗室微生態系試驗於單一批次試驗內分三次注入 7.7 ± 0.2 mg/L 的甲苯，每次注入甲苯濃度為 2.6 ± 0.1 mg/L，此 濃度相較於 Lu et al. (1998) 及 Lee and Liu (2006) 指出的甲苯濃度低許 多，因而判斷本研究三氯乙烯的降解應該不會受到甲苯競爭抑制作用。同時，本研究三氯乙烯初始濃度並不高 (503 ± 13 µg/L)，三氯乙烯對甲苯的 抑制亦應該不會發生。Fan et al. (1993) 亦指出土壤微生物需經添加主要基 質(甲苯)後才具有共代謝三氯乙烯的能力，當土壤中甲苯分解完後，三氯乙烯生物共代謝現象亦終止。根據文獻及本研究結果的相同現象再次證實了當甲苯耗盡時，無法維持三氯乙烯代謝活性，殘餘的甲苯氧化酵素無法持

Time (hour)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

TCE Remaining Conc. (ug/L)

Toluene Remaining Conc. (mg/L)

phase 1 phase 2

圖 4-1 批次試驗中 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 微生態系內甲苯及三氯 乙烯殘餘濃度隨時間的變化(箭頭代表甲苯注入時間點)

實驗室微生態系在甲苯存在(第一階段)時求得的三氯乙烯降解反應動力參數，對於數學模式及現地試驗結果的預測相當有用。Jenal-Wanner and McCarty(1997) 使用 Michaelis-Menten 方程式 (Eckenfelder, 1970) 及 Monod 方程式 (1949) 求取生物共代謝三氯乙稀反應速率參數，式子如下

(µg/L)；t為反應時間 (hour)。HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 微生態系統中可 利用方程式 (4-6) 來評估三氯乙烯生物降解反應動力參數。

Han et al., (2007) 針對現地污染場址、實驗室半連續培養泥漿法及純菌 HYL-QT2(Pseudomonas putida) 求得之三氯乙烯一階反應動力參數分別為 2.0/day、0.6/day 及 0.5/day。圖 4-2 為本研究中擬合之三氯乙烯一階反應速率常數，圖中顯示甲苯存在微生態系的時間非常短，在為期 4 天 (100 小時) 的單一培養期程內，甲苯存在的第一階段只有 1 天。根據方程式 (4-6)，

以最小平方法擬合的第一階段三氯乙烯生物共代謝降解一階反應速率回歸方程式如下：

0.0094

468.62 C = e

⁻ _(4-7)

由相關係數平方值 (R² = 0.77) 得知一階反應動力模式適用於生物共代謝降解速率方程式。當微生態系菌落數為 10⁸ CFU/mL 時，三氯乙烯生物共代謝一階反應速率參數 ( k X' _a ) 在甲苯存在的第一階段為

Time (hour)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

TCE Remaining Conc. (ug/L)

Toluene Remaining Conc. (mg/L)

phase 1 phase 2

R2 = 0.77

C = 468.62 e- 0.0094 t

圖 4-2 擬合之三氯乙烯一階反應速率常數(箭頭代表甲苯注入時間點)

4-3-2 溶氧量及 OD605變化

由三氯乙烯生物降解試驗得知，除了三氯乙烯的降解效率與甲苯存在的有效反應時間有著密切關係外，微生態系中的溶氧量與 OD605 亦隨著甲苯存在的有效時間區分成兩個階段。由圖 4-3 所示，甲苯基質仍存在的第一階段，微生態系的溶氧量隨著反應時間的增加而減少，溶氧量由一開始的 34.3 mg/L 降到 17.4 mg/L，當甲苯完全耗盡時(第二階段)微生態系中的溶氧量幾乎穩定維持在一定值。同時，微生態系的 OD₆₀₅在甲苯存在的第一階段呈現顯著的增長，OD605 在 24 小時的反應時間內由初始的 0.004 急遽攀升至 0.026；而甲苯不存在時，OD605 僅有些許的變化。

根據試驗期間溶氧量及 OD605 隨甲苯存在於微生態系內有效反應時 間變化的趨勢，再次證實純菌 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 能在好氧環境 下分解甲苯，並藉由分解甲苯時所產生的 ATP(adenosine triphosphate) 進行細胞合成，促進菌體的增長。

Time (Hour)

0 20 40 60 80 100

Dissolved Oxygen (mg/L)

Toluene Remaining Conc. (mg/L)

phase 1 phase 2

圖 4-3 批次試驗中 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 微生態系中的甲苯殘餘 濃度、溶氧量及吸光度(OD ₆₀₅) 隨時間的變化(箭頭代表甲苯注入時 間點)

4-3-3 菌落數及菌相變化

微生態系中菌體的增長除了可由 OD605 作為依據外，亦可由菌落數變化的情形來證實。反應初期，菌落數在 24 小時的反應時間內(第一階段) 由 10⁵ CFU/mL 迅速增長到 10⁸ CFU/mL；在第二個試驗階段，因為甲苯已消耗殆盡，加上三氯乙烯的毒性抑制進而降低的微生物的代謝行為，菌落數也從 10⁸ CFU/mL 緩慢降到 10⁶ ~ 10⁷ CFU/mL。根據批次試驗前後 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 的菌相圖(圖 4-5(a) 及圖 4-5(b)) 可看出在批 次試驗進行期間，微生態系沒有受到外來菌種的污染且菌種型態呈現一 致，此結果可再次證實純菌 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 確實能以甲苯為 主要基質，利用分解甲苯產生的氧化酵素，以好氧共代謝的作用將微生態系中的三氯乙烯移除。

4-3-4 酸鹼值變化

環境中酸鹼值是影響微生物生長的一個主要因素，在進行批次試驗時，隨著時間點監測酸鹼值的變化，以確定微生物是在合適的環境中生長。

Time (Hour)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Bacteria l Count (CFU/mL)

1e+3 1e+4 1e+5 1e+6 1e+7 1e+8 1e+9 1e+10

phase 1 phase 2

圖 4-4 批次試驗中 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 微生態系中的菌落數隨 時間的變化

(a)

(b)

Time (Hour)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

pH Value

5 6 7 8 9 10

phase 1 phase 2

圖 4-6 批次試驗中 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 微生態系中的酸鹼值隨 時間的變化

4-4 甲苯基質多次注入試驗

為了證實甲苯存在生物處理系統中的有效反應時間對三氯乙烯生物降解效率影響的假設，甲苯基質多次注入試驗以四組 (A 組 ~ D 組) 不同的 甲苯注入次數及注入體積，將等質量的甲苯注入 HYL-QT1(Ralstonia sp.

P-10) 微生態系中，各組甲苯注入次數及注入體積見表 3-3。甲苯注入的頻率以 D 組最密集 (3 天內分 9 次注入)，A 組則相反(一針注入)。

在為期 4 天的單一培養期程，A 組 ~ D 組三氯乙烯濃度由 465 ± 25 µg/L 分別降至 370 ± 10 µg/L(A 組)、349 ± 3 µg/L(B 組)、345 ± 9 µg/L(C 組) 及 312 ± 21 µg/L(D 組)；三氯乙烯生物共代謝效率依序為 21 ± 2%，25 ± 1%，26 ± 2% 及 33 ± 4%，甲苯基質多次注入的結果列於表 4-2。根據甲苯基質多次注入試驗結果證實三氯乙烯生物共代謝效率與甲苯注入頻率成正 比，甲苯存在於 HYL-QT1(Ralstonia sp. P-10) 微生態系的有效時間愈長，

共代謝生物降解三氯乙烯效率愈高。因此，藉由增加基質甲苯存在生物處理系統中的有效時間，可有效提升三氯乙烯生物共代謝效率。

表 4-2 甲苯基質多次注入試驗結果 ^a

Toluene injection schedule

A B C D

TCE Remaining (µg/L) 370 ± 10 349 ± 3 345 ± 9 312 ± 21

TCE Removal (%) 21 ± 2 25 ± 1 26 ± 2 33 ± 4

Toluene Remaining (mg/L) ND^b ND^b ND ND

Toluene Removal (%) 100 100 100 100

Dissolved Oxygen Remaining

(mg/L) 17 ± 0.5 16 ± 0.5 16 ± 0.5 14 ± 0.7

Oxygen Consumption

(mol-DO/mol-toluene) 5.7 ± 0.2 5.8 ± 0.2 5.8 ± 0.2 6.6 ± 0.2

4-5 比較甲苯基質多次注入試驗

在本研究中，為了更深入探討甲苯基質多次注入對 HYL-QT1

(Ralstonia sp. P-10) 好氧共代謝降解三氯乙烯的影響。將 B 組(甲苯分三針 注入)及 D 組(甲苯分九針注入)試驗組在為期 4 天(100 小時)內密集採樣分析甲苯、三氯乙烯濃度及環境因子的變化。並以最小平方法擬合的第一階段三氯乙烯生物共代謝一階反應速率回歸方程式，期望可以更深入了解多次注入對於提升三氯乙烯生物降解的因素。在本次試驗中每一個數據點都是由個別微生態系在不同時間所取得。試驗結果如表 4-3。

在文檔中 Ralstonia sp. P-10以甲苯為主要基質好氧共代謝降解三氯乙烯之研究 (頁 68-95)