實驗架構

本實驗架構如圖六所示，透過超臨界二氧化碳流體萃取法，以不同溫度、壓 力與共溶劑條件萃取陰乾儲存之臺灣真柏針葉粉末，將獲得之不同條件萃取物以 高效液相層析儀進行分析，比較各萃取物成分及含量之差異，並進行抗氧化及抗 菌活性之測試，比較不同條件萃取物之萃取率、抗氧化與抗菌活性後獲得最適萃 取條件，再以最適條件萃取不同乳酸菌發酵後之新鮮針葉，測試其發酵後抗氧化 與抗菌活性是否提升。

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圖五、實驗架構圖

Figure 5. Outline of experiment.

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第三章、材料與方法

第一節、 實驗材料 一、儀器設備

1. 電子分析天平 ( High precision electronic balance ) TB-2150D DENVER, USA 2. 實驗室級超臨界流體萃取系統 ( Supercritical Fluid Extraction System ) Applied

Separations, USA

3. 空氣壓縮機 ( Air compressor ) JW-2025，竣幃企業有限公司, Taiwan 4. 冷卻水循環裝置 ( Cooling Water Circulators ) CA2000, EYELA, Japan

5. 真空減壓濃縮機 ( Rotary evaporatoes ) Rotary Vacuum EvaporatorN-1000V, EYELA, Japan

6. 恆溫水浴槽 ( Water bath ) FirstTek scientific, Taipei, Taiwan

7. 純水製造機 ( Ultrapure water system ) RO-1070, PA-E Machinery Industrial CO., Taichung, Taiwan

8. 針頭式過濾器 ( 0.22 µm syringe filter, nylon membrane ) ChromTech Co.

9. 抽氣過濾器 ( Exhaust filter ) ASPIRATOR A-3S, EYELA, Japan

10. 高效能液相層析儀 ( High performance liquid chromatography, HPLC ) Model L-2130, Hitachi Co., Tokyo, Japan

11. HPLC 自動取樣器 ( Autosampler ) Model L-2200, Hitachi Co., Tokyo, Japan 12. HPLC 偵測器 ( Diode Array Detector ) Model L-2455 DAD, Hitachi Co.,

Tokyo, Japan

13. HPLC 層析管柱 ( column ) RP-18 GP 250-4.6 ( 5 μm ), Kanto Chemical Co., Tokyo, Japan

14. 盤式全光譜分析儀 (Microplate Spectrophotometer ) Multiskan™ GO, Thermo Fisher Scientific Co., (Waltham, MA, USA)

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15. 超音波震盪洗淨機 ( Ultrasonic steri-cleaner ) 敦華電子材料有限公司，

LEO-S1424, Taiwan

16. 滅菌釜 ( Autoclave ) Model ss-320, Tomy Co., Tokyo, Japan 17. 熱風烘箱 ( Forced convection oven ) DK63, Yamato, Japan 18. 震盪培養箱 ( Shaking Incubators ) LM-570R

19. 分光光度計 ( Model U-1900 Spectrophotomer ) Hitachi Co., Tokyo, Japan

二、藥品試劑

1. CO2 購自 臺東蒙恩氣體行

2. 乙腈 ( Acetonitrile ) Honeywell Co., USA

3. Hexane、 Methanol、 Ethyl acetate、 Acetone 由 Merck Co., Germany 4. Dimethyl sulfoxide ( DMSO ) 由 Sigma Chemical Co., USA

5. 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl ( DPPH ) 由 Sigma Chemical Co., USA

三、培養基

1. Agar powder 由 HiMedia Co., India

2. Mueller-Hinton broth 由 Sigma Chemical Co., USA 3. MRS broth 由 Merck Co., Germany

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第二節、實驗方法 一、臺灣真柏採集

本次實驗所使用之臺灣真柏採集自嘉義市，由蘇東方先生提供。將採集之臺 灣真柏經過鋪平陰乾後，分離樹枝、針葉與果實，取其針葉磨成粉末，並以袋裝 保存於室溫環境，臺灣真柏針葉磨粉後共重 20.38 公斤。

圖六、臺灣真柏實驗前處理。

Figure 6. Pretreatment of Juniperus chinensis var. sargentii A. Henry.

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二、超臨界萃取條件探討

本 次 實 驗 所 使 用 之 超 臨 界 流 體 裝 置 為 Applied Separations 公 司 之 Spe-ed SFE-2/4 Multi-Vessel Simultaneous Oven-based Extraction Systems，並附有 CO2 鋼瓶、冷卻水循環裝置以及空壓機。

1、超臨界二氧化碳萃取之裝置設置與萃取步驟

超臨界二氧化碳流體萃取裝置係由恆溫烘箱、加壓幫浦、空氣壓縮機、冷卻 水循環裝置與 CO₂ 鋼瓶所組成，其中恆溫烘箱上附有電熱器與流速計，加壓幫 浦上可加載共溶劑幫浦，詳細配置如圖八所示。超臨界二氧化碳流體萃取步驟是 將 10 g 臺灣真柏針葉粉末填入萃取槽中，固定萃取槽於恆溫烘箱中並接上流體 入口與萃取物出口之管線，開啟恆溫烘箱並設定溫度，待溫度穩定後開啟共溶劑 幫浦通入共溶劑，再通入二氧化碳並以加壓幫浦加壓至設定壓力，進行靜態萃取 30 分鐘後打開萃取物出口閥 ( V3 與 V4 閥 )，進行洩壓並收集萃取物，萃取結 束後關閉所有電源，打開恆溫烘箱及排放閥 ( V5 閥 ) 進行降溫及洩壓。

圖七、超臨界二氧化碳流體萃取裝置。

Figure 7. Supercritical carbon dioxide fluid extraction system.

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2、 超臨界二氧化碳萃取之單因子條件探討

本次實驗使用靜態萃取法進行萃取，將針葉粉末填入萃取槽後通入二氧化碳，

待溫度達到設定值時，將二氧化碳加壓至設定值進行靜置萃取，系統達到平衡後 打開樣品出口閥收集萃取物。實驗操作變因為溫度、壓力與共溶劑含量三項，在 溫度變化實驗中，固定壓力為 300 bar 並以 35 ℃ 、 40 ℃ 、 45 ℃ 、 50 ℃ 及 55 ℃ 進行萃取，以高效液效層析儀 ( high performance liquid chromatography, HPLC ) 分析其成分及含量，並以統計軟體比較其萃取率，篩選出最佳萃取溫度，

在壓力變化實驗中，以最佳萃取溫度，壓力 150 bar 、 200 bar 、 250 bar 、 300 bar 及 350 bar 進行萃取，以相同方式篩選出最佳萃取壓力，在共溶劑含量試驗 中，以最佳萃取溫度及壓力並加入 0 % 、 3 % 、 6 % 、 9 % 、 12 % 與 15

% 之共溶劑，共溶劑種類又分為甲醇、丙酮、乙酸以脂與正己烷四種，共溶劑 添加量以管柱容積 ( 30 mL ) 為主，分別為 0.9 mL 、 1.8 mL 、 2.7 mL 、 3.6 mL 與 4.5 mL，萃取後同樣以 HPLC 及統計軟體進行分析。

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三、高效液相層析儀分析萃取物成分及含量

將不同條件之萃取物以高效液相層析儀進行分析，使用 Hitachi model L-2130 Intelligent pump system 搭配 Hitachi model L-2200 Autosampler 和 Hitachi model L-2455 Diode Array Detector，檢測器偵測波長為 205、230、240 及 254 nm，使 用 RP-18 GP 250-4.6 ( 5 μm ) 管柱，流動相為甲醇 ( solvent A )、乙腈 ( solvent B ) 與 10 % 甲醇水溶液 ( solvent C )，流速為 1 mL/min，流洗梯度如下表五。

表一、HPLC 分析條件。

Table 1. The sample analysis conditions of HPLC.

Time (min) % A

25

四、抗氧化活性測試

萃取物之抗氧化能力以 DPPH 自由基清除能力做為指標，將不同濃度之萃 取物與 0.5 mM DPPH 甲醇溶液於 96 孔盤中進行混合，避光反應 60 分鐘後以 盤式全光譜分析儀測定吸光值，檢測波長為 517 nm，實驗以抗壞血酸 ( ascorbic acid ) 做為對照組，清除力結果以 Excel 進行統計分析，清除力計算公式為：

( scavenging effects ) = [ 1 - ( OD sample / OD control ) ] * 100 %

1. DPPH 自由基清除試驗

將 0.00985 g 之 DPPH 粉末溶於 50 mL 甲醇溶液中配製成 0.5 mM DPPH 甲醇溶液，取 100 μL DPPH 溶液與 100 μL 不同條件之萃取物 ( 濃度 5 mg/mL ) 於 96 孔盤中混合，避光反應 60 分鐘後，以波長 517 nm 測吸光值，

同一超臨界樣品進行三重複試驗。

2. DPPH 自由基清除率濃度效應測試

將 0.00985 g 之 DPPH 粉末溶於 50 mL 甲醇溶液中配製成 0.5 mM DPPH 甲醇溶液，取 100 μL DPPH 溶液與 100 μL 不同濃度之萃取物於 96 孔 盤中混合，萃取物濃度分別為 5000 μg/mL 、 1000 μg/mL 、 500 μg/mL 、 250 μg/mL 及 125 μg/mL，避光反應 60 分鐘後，以波長 517 nm 測吸光值，同一 超臨界樣品進行三重複試驗，計算其結果以確定臺灣真柏針葉萃取物之 EC₅₀。

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五、抗菌試驗 1. 菌種選擇

圓柏屬植物抗菌研究中發現，多數圓柏屬植物針葉萃取物對 Candida 與 Bacillus 屬皆有抗菌之效果，然而並不是所有圓柏屬植物皆對上述二屬病原菌具 有優秀之抗菌效果，少數圓柏屬植物對 Klebsiellae 屬及 Escherichia coli 有優秀 之抗菌能力，為了瞭解臺灣真柏針葉萃取物是否與其他種圓柏屬植物具有相似抗 菌功效，本次實驗將選擇白色念珠菌 ( Candida albicans )、克雷伯氏肺炎菌 ( Klebsiellae pneumoniae )、枯草芽孢桿菌 ( Bacillus subtilis )，以及大腸桿菌 ( Escherichia coli ) 進行抗菌試驗。

K. pneumoniae 與 C. albicans 由臺東大學生命科學系林志輝老師提供。

B. subtilis 與 E. coli 由臺東大學生命科學系黃祥恩老師提供。

2. 菌種培養

C. albicans 、 K. pneumoniae 、 B. subtilis 與 E. coli 培養於 MH 平面培 養基，試驗時取一菌落接入 5 mL 之 MH broth 中，以 37 ℃ 培養 12 小時後 進行轉管，培養至 OD 值為 0.4 時進行抗菌試驗。

3. 樣品製備

將不同萃取條件之萃取物以 DMSO 回溶，使其最終濃度為 100 mg/mL，以 備抗菌實驗使用。

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4. 抗菌試驗之點測試

將培養好 OD 值 0.4 之菌液取 100 μL 塗抹於 MH 培養基上，靜置 10 分 鐘後取 2 μL ( 濃度為 100 mg/mL ) 之萃取物點在 MH 培養基上，並以 2 μL DMSO 做為對照，放至培養箱中以 37 ℃ 培養 8 至 10 小時後取出，觀察是 否有抑菌效果。

5. 抗菌試驗之紙錠擴散法

將培養好 OD 值 0.4 之菌液取 100 μL 塗抹於 MH 培養基上，靜置 10 分 鐘後取 20 μL ( 濃度為 100 mg/mL ) 之萃取物加入 8 mm 紙錠中，使其濃度為 2 mg/disk，將含樣品之紙錠貼於 MH 培養基上，並以加入 20 μL DMSO 之紙錠 做為對照，放至培養箱中以 37 ℃ 培養 8 至 10 小時後取出，測量其抑菌圈大 小。

n.d 代表無抑菌效果，9-10 mm 代表輕度抑菌效果，11-15 mm 代表中度抑菌效 果，16 mm 以上代表高度抑菌效果。

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六、乳酸菌發酵 1. 菌株選擇

過去文獻中發現，圓柏屬植物並沒有益生菌發酵之研究，為了瞭解以乳酸菌 發酵臺灣真柏針葉是否可以提升抗氧化及抗菌活性，選用了十株不同來源之乳酸 菌進行發酵測試，分別為 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum BCRC 10069、

Lactobacillus acidophilus BCRC 10695 、 Lactobacillus casei BCRC 10697 、 Lactobacillus amylovorus BCRC 11648、Lactobacillus fermentum BCRC 12190、 Lactococcus lactis subsp. lactis BCRC 14016、Lactobacillus crispatus BCRC 14618、 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei BCRC 17489、Lactobacillus amylolyticus BCRC 17497與 Lactobacillus taiwanensis BCRC 17755。

2. 菌種培養

L. plantarum subsp. plantarum BCRC 10069 、 L. acidophilus BCRC 10695、 L. casei BCRC 10697、L. amylovorus BCRC 11648、L. fermentum BCRC 12190、 Lactococcus lactis subsp. lactis BCRC 14016 、 L. crispatus BCRC 14618 、 L. amylolyticus BCRC 17497 與 L. taiwanensis BCRC 17755 皆以 MRS broth 於 37 ℃ 進行培養，L. paracasei subsp. paracasei BCRC 17489 以 MRS broth 於 30 ℃ 進行培養，培養 12 小時後進行實驗。

29

3. 乳酸菌發酵臺灣真柏針葉

實驗以半固態發酵 ( Semi-solid-state fermentation ) 方式進行，首先秤取 15 g 新鮮臺灣真柏針葉粉末倒入錐形瓶中，並加入 60 mL DD Water，以鋁箔紙封 住瓶口後放入滅菌釜進行滅菌，待其冷卻後加入 5 mL 乳酸菌菌液 ( OD 值為 0.4 )，以 150 rpm 、 30 ℃ 或 37 ℃ 進行搖瓶發酵，發酵時間為 48 小時。

4. 發酵物之超臨界萃取

以不同乳酸菌菌株發酵 48 小時後，收集錐形瓶內發酵後之粉末及發酵液，

鋪平後放入 50 ℃ 烘箱中，乾燥後取 10 g 發酵後針葉粉末裝填至超臨界之萃取 槽中，以最適萃取條件 35 ℃ 、 150 bar 加入 15 % 甲醇共溶劑進行萃取，收 集萃取物並測試其抗氧化及抗菌活性。

七、生物統計之方法

所有試驗皆進行三重複，結果以平均值 ± 標準誤差 ( mean ± SD ) 表示。

實驗數據以 Microsoft Excel 與 SPSS 進行統計分析，使用單因子變異數分析之 Tukey's test 進行檢定，P < 0.05 即為顯著差異。

30

Table 2. Supercritical CO

2 extraction yields of different temperatures under the fixed pressure.

31

圖八、固定壓力下不同溫度超臨界萃取物之 HPLC 分析圖譜。

Figure 8. HPLC chromatogram of supercritical extraction with different temperature.

32

表三、固定壓力下不同溫度超臨界萃取物之 HPLC 圖譜波峰總積分面積值。

Table 3. HPLC area values of supercritical extraction with different temperature.

Temperature ( ℃ )

Peak area at each retention time ( min )

2.47 3.48 5.84 10.75 11.65 13.29

Peak area at each retention time ( min )

16.31 38.02 42.99 47.43 49.32 62.12

35

6,025,338 7,595,236 6,217,756 14,317,961 10,915,390 10,346,307

40

5,707,206 6,694,529 5,794,348 14,774,664 10,698,348 10,411,956

45

5,537,804 6,807,852 5,978,263 15,159,891 10,925,277 10,512,352

50

^{5,800,925 6,989,840 6,007,794} 14,988,918 12,299,097 10,400,992

55

^{5,457,303 6,632,732 6,117,300} 14,751,590 11,206,523 10,495,095

33

34

圖九、固定溫度下不同壓力超臨界萃取物之 HPLC 分析圖譜。

Figure 9. HPLC chromatogram of supercritical extraction with different pressure.

35

表五、固定溫度下不同壓力超臨界萃取物之 HPLC 圖譜波峰總積分面積值。

Table 5. HPLC area values of supercritical extraction with different pressure.

Pressure ( bar )

Peak area at each retention time ( min )

2.47 3.48 5.84 10.75 11.65 13.29

Peak area at each retention time ( min )

16.31 38.02 42.99 47.43 49.32 62.12 150 ^{6,205,969 5,885,674 8,231,324} 13,556,052 11,826,387 13,981,860

200 ^{6,536,982 7,260,954 7,182,187} 15,185,164 11,930,082 12,094,750

250 ^{5,741,604 7,466,137 5,638,627} 16,685,720 11,666,625 9,670,256

300 ^{6,025,338 7,595,236 6,217,756} 14,317,961 10,915,390 10,346,307

350 ^{5,901,007 7,666,768 6,189,327} 16,402,240 11,667,852 10,631,810

36

Table 6. Supercritical CO

₂ extraction yields of different methanol cosolvent contents.

Methanol contents

37

圖十、不同含量甲醇共溶劑超臨界萃取物之 HPLC 分析圖譜。

Figure 10. HPLC chromatogram of supercritical extraction with different methanol

cosolvent contents.

38

表七、不同含量甲醇共溶劑超臨界萃取物之 HPLC 圖譜波峰總積分面積值。

Table 7. HPLC area values of supercritical extraction with different methanol

cosolvent contents.

Methanol ( % )

Peak area at each retention time ( min )

2.47 3.48 5.84 10.75 11.65 13.29 0 ^{208,699 247,021 221,452 875,191 6,826,968 9,230,476}

3 ^{110,196 183,328 163,729 657,515 2,925,879 687,428}

6 ^{725,488 613,772 183,682 632,007 2,720,655 2,604,403} 9 ^{1,752,887 1,903,673 1,024,933 1,285,662 2,212,650 2,640,442} 12 ^{7,623,468 1,984,200 988,365 1,197,242 1,495,091 1,584,032} 15 ^{7,486,617 7,787,473 1,487,777 1,277,416 1,634,909 1,903,404}

Methanol ( % )

Peak area at each retention time ( min )

16.31 38.02 42.99 47.43 49.32 62.12 0 ^{6,205,969 5,885,674 8,231,324} 13,556,052 11,826,387 13,981,860

3 ^{2,720,443 5,363,382 8,338,208 6,511,621 4,328,637} 22,499,792

6 ^{2,689,100 7,125,907 7,903,468 6,991,385 3,738,612} 19,967,912

9 ^{3,971,108 5,055,685 3,720,472 6,990,304 1,015,473 6,439,058} 12 ^{2,750,250 3,266,389 2,487,591 4,668,754 673876 4,143,985} 15 ^{2,753,613 3,265,918 2,461,030 4,595,520 629044 4,120,104}

39

Table 8. Supercritical CO

₂ extraction yields of different acetone cosolvent contents.

Acetone contents

40

圖十一、不同含量丙酮共溶劑超臨界萃取物之 HPLC 分析圖譜。

Figure 11. HPLC chromatogram of supercritical extraction with different acetone

cosolvent contents.

41

表九、不同含量丙酮共溶劑超臨界萃取物之 HPLC 圖譜波峰總積分面積值。

Table 9. HPLC area values of supercritical extraction with different acetone cosolvent

contents.

Acetone ( % )

Peak area at each retention time ( min )

2.47 3.48 5.84 10.75 11.65 13.29 0 ^{128,962 303,633 358,715 4,457,747 7,592,941 3,077,556} 3 ^{1,320,321 1,503,894 273,700 3,190,790 5,601,421 2,402,443} 6 ^{425,162 867,172 573,260 6,568,379} 10,850,632 4,300,069

Peak area at each retention time ( min )

16.31 38.02 42.99 47.43 49.32 62.12 0 ^{1,642,298 1,507,590 1,229,764 3,148,420 8,816,234 1,682,185} 3 ^{1,216,979 1,206,881 1,800,974 2,757,812 1,920,313 2,032,598} 6 ^{2,355,090 1,804,017 1,134,408 4,063,085 3,845,110 2,357,883} 9 ^{1,535,483 1,681,201 1,052,995 3,357,425 3,754,965 2,372,010} 12 ^{1,155,138 1,483,296 1,142,444 3,611,710 2,555,815 2,930,788} 15 ^{1,415,689 2,012,223 1,359,602 4,465,170 3,286,768 3,753,461}

42

43

圖十二、不同含量乙酸乙酯共溶劑超臨界萃取物之 HPLC 分析圖譜。

Figure 12. HPLC chromatogram of supercritical extraction with different ethyl

acetate cosolvent contents.

44

Peak area at each retention time ( min )

2.47 3.48 5.84 10.75 11.65 13.29

Peak area at each retention time ( min )

16.31 38.02 42.99 47.43 49.32 62.12 0 ^{1,642,298 1,507,590 1,229,764 3,148,420 8,816,234 1,682,185} 3 ^{1,819,467 939,726 1,373,874 4,222,071 3,387,899 1,516,659} 6 ^{1,377,281 744,969 475,901 4,568,002 3,127,499 1,079,337} 9 ^{1,486,183 1,844,957 1,135,061 3,663,200 3,265,338 3,058,254} 12 ^{1,246,322 1,560,166 445,785 4,282,736 2,839,878 2,263,662} 15 ^{1,759,125 1,225,281 3,449,209 5,291,226} 12,687,262 2,398,052

45

Table 12. Supercritical CO

₂ extraction yields of different hexane cosolvent contents.

Hexane contents

46

圖十三、不同含量正己烷共溶劑超臨界萃取物之 HPLC 分析圖譜。

Figure 13. HPLC analysis of supercritical extraction with different hexane cosolvent

contents.

47

Peak area at each retention time ( min )

2.47 3.48 5.84 10.75 11.65 13.29

Hexane

Peak area at each retention time ( min )

( % ) 16.31 38.02 42.99 47.43 49.32 62.12 0 ^{1,642,298 1,507,590 1,229,764 3,148,420 8,816,234 1,682,185} 3 ^{1,589,107 1,958,752 1,712,653 1,255,893 3,068,079 1,217,979} 6 ^{1,639,716 2,191,107 1,254,485 4,193,013 4,702,502 3,606,126} 9 ^{1,770,855 2,649,629 1,407,448 4,700,449 5,197,752 4,101,135} 12 ^{1,533,050 829,352 1,124,862} 18,098,880 956,153 687,681

15 ^{1,661,887 2,402,298 1,383,292 4,673,850 3,459,640 3,809,342}

48

第二節、DPPH 自由基清除率探討

1. 不同溫度之超臨界萃取物對 0.5 mM DPPH 自由基清除試驗結果

DPPH 自由基清除試驗中，取 100 μL 之 0.5 mM DPPH 溶液與 100 μL 濃 度 5 mg/mL 之不同溫度條件萃取物於 96 孔盤中混合，避光反應 60 分鐘後，

以波長 517 nm 測吸光值，其結果如圖十五所示。

不同溫度條件萃取物中，50 ℃ 有最佳 DPPH 自由基清除力 62.75 ± 0.72 %，

不同溫度條件萃取物中，50 ℃ 有最佳 DPPH 自由基清除力 62.75 ± 0.72 %，

在文檔中 Antioxidant and antimicrobial activities of supercritical carbon dioxide fluid extracts from the (頁 30-0)