性，必須有更新穎的技術突破傳統整體實驗(Ensemble experiment)靜態分子的視 野及巨觀實驗的平均結果。隨著進步的光學影像及生物力學技術，提供了研究單
高解析螢光顯微鏡中利用單分子技術調控螢光染料分子隨機放光的特性可突破
2-2 螢光共振能量轉移(Förster resonance energy transfer)
螢光共振能量轉移的現象是透過供體螢光染料分子(Donor)受到特定波長的
共振能量轉移效率對應距離的公式得到螢光染料分子的距離變化可作為欲研究 效率與染料分子之間距離成六次方反比主要是受到偶極-偶極交互作用(Dipole-Dipole Coupling) 所影響。
此外，R0可以用來定義實驗的有效作用距離範圍約 3-8 奈米，其對應 5%-95%
的螢光共振能量轉移效率，能產生訊號變化的染料分子對距離變化在 0.5R0 -1.5R0，如Figure 14。但在實務中受限於雜訊的干擾可作用的範圍變小，以常用的 螢光染料分子對Cyanine3(Cy3)與 Cyanine5(Cy5)為例，如Figure 12，其R0約 5.6 奈米，可觀察的作用範圍在 2.8-8.4 奈米，可以提供奈米尺度的空間解析度但也
2-3 全內反射式螢光顯微術(Total internal reflection fluorescence
全內反射式螢光顯微鏡分為兩種：稜鏡式(Prism type)與物鏡式(Objective type)，稜鏡式的激發雷射由稜鏡折射在石英玻片上進行全反射，產生的螢光再由
顯微鏡物鏡所收集，考慮到樣品槽的厚度，須採用長工作距離水浸潤物鏡(Long working distance water immersion objective)才能得到清晰的影像(Figure 19(a))；物 鏡式全內反射式螢光顯微鏡的激發雷射由物鏡邊緣入射，經由大的數值光圈 電荷耦合器(Electron Multiplied Charged Coupled Device ，EMCCD)具有可針對特 定信號強度區間放大的優點改善前者的問題，本實驗架設採用 Andor 公司背照 光(back-illumined)式 iXon Ultra 897 EMCCD，解析度為 512x512 畫素，最高全幅 譜速(frame rate)可達每秒 52 張，並具有高量子效率(Quantum efficiency，在可見 光區可達 85%以上)與高度線性(linearity, >99%)等特性，感光元件裝置有熱電 (thermoelectric)晶片可降溫至-100°C(實際實驗僅降溫至-70°C)有效抑制雜訊。
2-4 數據校正與分析
螢光訊號由電子放大式電荷耦合器接收經訊號放大後傳送至電腦，分別使用 IDL(Exelis Visual Information Solutions)、MATLAB(The Mathworks Inc.)、HaMMy 及TDP25進行不同的數據分析處理。首先利用IDL 程序(script)22負責將實驗拍攝 的影片進行疊圖分析並校正光學元件的誤差，排除實驗中兩點距離過近造成的異
常光點，將實驗得到的單分子定位，並將影像簡化分別儲存其位置與螢光強度隨 子可經由非放光的系統間跨越(intersystem crossing) 而轉換至激發三重態，而激 發三重態可能經過非放光的系統間跨越，或是伴隨著磷光(phosphorescence)放光
化分子反應或螢光基團毀損導致無法放光，光毀損與光化學過程主要發生在螢光 protocatechuate-3,4-dioxygenase，PCD) ，另外還有吡喃糖氧化酶-過氧化氫酶系統(pyranose oxidase 與catalase，POC)20。在葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶的反應需加入少量的葡萄糖，
反應的生成物葡萄糖酸會造成酸鹼值快速下降，影響到對pH 值敏感的實驗系統，
與兒茶酸-3,4-雙加氧酶皆經過純化處理20,28。
2-7 石英玻片表面修飾
將石英玻片及蓋玻片依序使用丙酮、3M 氫氧化鉀以及甲醇浸泡並放入超音 波震盪儀清洗，中間過程使用超純水沖洗。用丁烷火焰以高溫再將表面有機物質 移除(蓋玻片以電漿清洗機清洗五分鐘) ，待其冷卻後浸泡在含有甲醇、醋酸、以 及N-(2-Aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane 的混和溶液中進行鈍化反應，
10 分鐘後以超音波震盪一分鐘，再繼續反應十分鐘，反應結束後依序使用甲醇 與超純水沖洗，再用氮氣將其吹乾，並移至底部含水以保持濕度的容器中。配製 以 100mM 碳酸氫鈉溶解 mPEG-SVA(分子量 5000，Laysan Bio,Inc)和 Biotin-PEG(分子量 5000，Laysan Bio,Inc)後放入高速離心機，取上清液滴在玻片表面再 用蓋玻片小心地蓋上(避免氣泡產生)，靜置於暗處 3 至 4 小時。最後用超純水充
/分鐘、溫度控制在 4℃離心 30 分鐘後吸取上清液，再重複前一步驟一次。最後 酶連鎖反應(Polymerase chain reaction，PCR)機器依Table 2程序進行黏合反應，
形成類似端粒重複序列由一部分雙股與欲研究之單股序列所組成的單分子實驗 DNA 構造，最後將黏合好的 5 µM 雙股 DNA 再稀釋到 250 nM 及 10 nM 放入-20
℃冰箱保存。
2-10 圓二色光譜(Circular dichroism spectroscopy) 2-10.1 圓二色性(Circular dichroism)
利用具有掌性對稱中心的分子對於左旋與右旋的吸收度不同，在圓二色光譜
內的平行結構在波長260 奈米位置有最大值，在波長 240 奈米則有最小值；反平 行結構在波長295 奈米有最大值，在波長為 265 奈米則有最小值，所有鳥嘌呤四 股結構在波長210 奈米皆為正值，此訊號為可與 A form 雙股 DNA 作區分。圓二 色光譜也可以提供鳥嘌呤四股結構的動力學實驗數據，可以觀察在不同離子條件 下構形的變化，此優點為核磁共振光譜及 X 射線結晶學無法達到的，但還是能 結合不同的實驗方法互相驗證其實驗結果的準確性。