緒論

1-1 端粒 1-1.1 端粒的發現

1930 年代，Hermann Muller 利用 X-ray 打斷果蠅染色體末端特殊結構，發現 染色體末端結構非常不穩定。因此， Hermann Muller 和 Barbara McClintock 更進 一步研究這段結構發現此特殊的結構可以保護 DNA，但是如何保護 DNA 的機 制與其基因序列卻還是無從得知。端粒一詞是由 Hermann Muller 所命名，在希 臘字裡，telo-為末端的意思而 mero 為單位。直到 1953 年，James D. Watson 和 Francis H. C. Crick 提出 DNA 為雙股雙螺旋結構與 Arthur Kornberg 發現了 DNA 複製的機制，染色體末端的特殊結構才又受到重視¹。 細胞內純化並取得作為研究的DNA 序列。美國科學家 Elizabeth H. Blackburn 等

人用 DNA 定序法對四膜蟲染色體末端 DNA 進行研究，發現其 DNA 序列由 TTGGGG 這六個鹼基重複 20~70 次所組成，但是沒有證據證明這段重複序列就 是端粒以及保護DNA 完整性的功能。在相近的時空背景下，Jack W. Szostak 等 人在完成博士學位的期間利用酵母菌研究DNA 重組的機制，畢業後他到了癌症 治療中心建立自己的研究室，延續之前的研究，他發現在酵母菌中注入線性的 DNA，線性的 DNA 會快速地降解或重組，與之前 Elizabeth H. Blackburn 等人研 究結果不同，他假設 TTGGGG 或許能保護在染色體末端線性的 DNA，並與 Elizabeth H. Blackburn 合作將親源關係很遠的四膜蟲端粒 DNA 序列注入酵母菌 中，觀察四膜蟲端粒是否能保護酵母菌的DNA 免於降解或重組，甚至幫助酵母 菌DNA 進行複製，這項結果成功地證明了先前的假設是正確的。他們將酵母菌 染色體進行純化後，發現酵母菌染色體末端DNA 重複序列(TG)1-3接在先前注入 的四膜蟲端粒重複序列之後，這項實驗結果顯示酵母菌可以用本身端粒延長的機 制延長在外加的四膜蟲端粒序列上，對於真核細胞中懸而未解的端粒機制也有新 的開端。在1980 年代，少數真核細胞端粒序列被 Elizabeth H. Blackburn 等人測 定出，並且在端粒序列發現有大量的鳥嘌呤存在。Jack W. Szostak 等人也觀察到 細胞內具有某種機制能將端粒重複序列加在染色體末端，但切確的機制仍然不清

由於染色體重排、降解與融合會形成不穩定的結構，影響DNA 複製的準確 2(TRF2)與端粒的雙股直接結合負責調控端粒長度與功能，POT1(Protection Of Telomeres 1)與 3’端單股端粒重複序列以及 T-loop 或 D-loop 結合，TRF1、TRF2 和POT1 還會與其他三種蛋白形成複合物這六種蛋白複合物(Shelterin) ，在端粒 T-loop，將 3’端羥基藏匿在其結構中使端粒酶無法與端粒結合，T-loop 的大小與 功能似乎沒有太大的關係，但是，端粒長度不足以形成此環狀結構時，3’端的羥

細胞將走向老化進行細胞凋亡的程序。但是在生殖細胞或癌細胞中端粒酶過表達 粒延長替代機制(Alternative Lengthening of Telomeres，ALT，Figure 6 and Figure 8)^2,5。

了解癌細胞端粒延長的機制，可以更深入的發展癌症的治療方法。現今主要 端粒酶需要Hsp90 複合物(Chaperone complex，伴侶蛋白複合物)與端粒酶結合以 穩定端粒酶的結構處在活化位，因此可抑制此蛋白複合物的生成，同時能抑制端 粒酶的活性。除了上述這方法還有從基因組抑制端粒酶基因的表達以及免疫治療 等方法。利用端粒序列本身富含著鳥糞嘌呤的特性，可以在端粒的3’端單股形成 鳥嘌呤四聚體的的二級結構，此結構在癌細胞染色體端粒可以抑制端粒結合蛋白

(TRF2 和 POT1)的作用，使得端粒結構被破壞，鳥嘌呤四聚體的形成也可以直接 抑制端粒酶作用在端粒上，因此研究在何種生理條件會形成此二級結構以及如何 穩定其結構對於發展對抗癌症的藥物有很大的幫助⁵。

1-2 鳥嘌呤四聚體(G-Quadruplex)

1-2.1 鳥嘌呤四聚體概述

區域附近有許多能形成鳥嘌呤四聚體的DNA 序列¹⁰，在此形成的鳥嘌呤四聚體 Shankar Balsubramanian 團隊利用特殊的抗體在細胞內染色體中能與端粒所形成 的鳥嘌呤四聚體結合並放出螢光¹²。2001 年，Schaffizel et.al 在體內實驗發現一 種由核醣體生成的抗體(Sty49)能與原生生物 Stylonychia lemnae 纖毛蟲端粒所形 成的鳥嘌呤四聚體結合並顯現出來¹³。Paeschke et.al 使用相同的抗體(Sty49)在纖 毛蟲DNA 進行複製的時候加入細胞內，發現端粒結合蛋白(TEBPα 和 TEBPβ)會

鳥嘌呤四聚體有著構形上的多樣性，其組成由四個鳥嘌呤利用Hoogsteen 氫 鍵形成環狀方型平面，G-quartet。再以兩個以上的 G-quartets 平面推疊形成 DNA 二級結構，鳥嘌呤四聚體(G-quardruplex)，此 DNA

二級結構為右手螺旋結構，G-quartet 之間的層距約 3.13~3.4 埃(Angstrom)，結構扭轉的角度約 30 度、直徑 25 埃(Angstrom)，以及磷酸股價所產生的四個溝槽¹⁴(Figure 9)。

G-quadruplex 的分類方式如Figure 10和Figure 11可依據(1)寡核苷酸的數量(單 體(Monomer)、雙體(Dimer)、四聚體(Tetramer))，(2)寡核苷酸股的方向(平行、反 平行、混和型)，(3)鹼基與五碳糖鍵結的角度χ(Syn、Anti)，(4)Loop 的尺寸與串 聯鳥嘌呤的方式(Diagonal 對角、Lateral 階梯、Prepeller 螺旋槳)，其中以 Loop 的 長度對最終的結構以及穩定性影響最大，當Loop 長度太短時會限制 DNA 序列 只能藉由螺旋槳型Loop 形成平行的結構:但是，當 Loop 長度夠長則傾向形成穩 定的反平行結構。

除此之外，環境中的陽離子種類也會影響鳥嘌呤四聚體的構形，先前的核磁 共振整體實驗研究結果得到，當環境中有鈉離子存在時，端粒 DNA 重複序列 (dAGGG(TTAGGG)3)會受到鈉離子幫助穩定在反平行的鳥嘌呤四聚體結構，在鉀 離子條件下則是得到混和型的鳥嘌呤四聚體⁸。由圓二色光譜也得到相同的結果，

具有顯著的活性導致癌症的病發。若能在癌細胞中端粒序列上形成鳥嘌呤四股結 係(BLM、WRN、RecQ、FANCj and PIFI 解旋酶)¹⁷。以Fanconi anemia(FANCj)病 患為例，由於基因組中生成FANCj 解旋酶的基因缺陷，導致此解旋酶失去能夠

1-3 研究動機

先前的研究指出金屬陽離子對鳥嘌呤四聚體具有穩定其結構的效果，在生理 條件下，鉀離子和納離子分別能穩定鳥嘌呤四股結構存在平行、混和型以及反平 行構形也經由整體實驗和單分子實驗得到證實。在人體細胞中，鎂離子的含量僅 次於鉀離子而且參與300 多種生化反應，相較於鉀離子(133pm)，鎂離子(65pm) 有著較小的離子半徑能更容易的進入結構中以及帶有二價的正電可能可以更加